14. Pruebos bioquimicas para Ia identificacién de bacterias La propiedad termorresistente es la base para la diferenciacion de algunas especies del género Pseudomonas. A) B) c) IV. REACTIVOS EMPLEADOS pnitrofenil fostato.? Preparar en concentracion del 0,1. % en agua destiladautilizando. un frasco volumé ico. 2. Guardar en un frasco de vidrio color caramelo. Evitar la exposicién ala luz 3. Rotular correctamente. Buffer Tris, 0,02 M, pH:8 1, Disolver 3.02 g (0,025 moles, peso mol, 121) detrissdlido (hidroximetil) aminometano (0 2-amino-2-hidro- ximetil-1.3-propandiol) en 100 ml aproximadamente de agua destila- da en un frasco volumétrico de un litvo. Hervir el agua destilada para que se desprenda el CO." 2. Agregar 25 ml de CH LN (0,025 moles de CIH) y cs.p. 1.000 ml con agua destilada hervida. 3. Controlar el pH; a 37° C debe ser 8. 4. Rotular correctamente. Método de utilizacién (de ambos reac- tivos).” 1. Con una torunda estévil retirar las células que se desarrollan en un medio de agar adecuado y preparar una suspension celular del organis- mo bajo sospecha, en buffer T (pH:8) con una densidad igual al N°3 del nefeloémetro de MeFar land. a) Estandarizar las densidades de células por ml b) Preparar diez tubos patron nu- merados desde el 1 hasta el 10. 1. Cada tubo contiene un multi- plo de 300.000.000 de orga- hismos por ml Numero del tubo patron por 300,000,000 es igual al mti- mero de organismos por ml (Tubo 3 = 9 x 10* cél/mb), oH Fosfatasa b—on OH paitrofenil fostato, Gncoloro) Colocar 0,5 ml de la suspensién de microorganismo en buffer en dos tubos, y rotularlos tubos 1 y 2. Colocar el Tubo 1 en un baito de agua a 70°C durante 20° min EI Tubo 2 es el control no calentado. Despueés de la incubacién del Tubo 1, agregar 0,5 ml de una solucién de-prnitrofenil fosfato al 01% (in- colora) a ambos tubos. Segunda incubacién, ambos _tubos, nun bafo de agua MG, b) Desde 1h hasta el dia siguiente. es negativa (no aparece color amarillo en ninguno de los tu- bos), incubar 24 h. 7. Registrar las reacciones de color D) Control de calidad. Antes de adoptarlos para su empleo general, deben contro- Larse los reactivos con cultivos positives y negativos conocidos. El Staphylococcus epidermidis y ka P. aeruginosa constituyen Duenos controles porque se obtiencn hacilmente y no crean problemas cuan- do se los conserva como cultivos madre, epidermidis: prueba de la fostatasa negativa, no se produce fosfatasa® P. aeruginosa: prucba de la fostatasa positi- va, resistente al calor. BE) Conservacion: Guardar ambos reacti- vos en un reftigerador (a 4° C) cuando no se los emplea. Su estabilidad es variable: por lo tanto, periddicamente habra que hacer un control de calidad. desechandolos si muestran una reac- cion negativa o débil con un organismo positive conocido. F) Quimica de la accion del reactivo: El Prnitrofenil fosfato es un reactivo ineo- loro que se desclobla para dar p-nitrofe- nol (un compuesto de color amarillo) y fosfato inorginico cuando sobre él acttia ‘la enzima fosfatasa.’ Las sales coloreadas de los p-nitrofenoles se for- man con bases (buffer Tris); probable- mente son sales de una estructura quinoide.” as sales de nitrofenol son de color amarillo intenso.” Fosfato inorginico pritvoenot i (amarillo)