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Asignatura: ANÁLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioquímica

CURSO: ANÁLISIS INSTRUMENTAL


PROFESOR: MS QF DAVID RUIDÍAS ROMERO

 Fundamentos
QUINCEAVA  Instrumentación
SEMANA  Optimización de la separación cromatográfica
 Aplicación de la HPLC

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1. Fundamentos

Técnica L columna, cm Diámetro de partícula, µm

LC 50 – 500 150 – 200

HPLC 3 – 30 3 – 10
UPLC Hasta 5 <2

LC: Liquid Chromatography

HPLC: High Performance Liquid Chromatography or


High Pressure Liquid Chromatography

UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography

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1. Fundamentos

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio

Reparto Líquido adsorbido sobre un Distribución entre


sólido líquidos inmiscibles
Reparto con fases Especies orgánicas enlazadas Distribución entre
enlazadas a una superficie sólida líquido y superficie
enlazada
LC Adsorción Sólido Adsorción

Intercambio iónico Resina de Int. Iónico Intercambio iónico

Exclusión por tamaño Líquido en intersticios de un Distribución/Exclusión


sólido polimérico

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1. Fundamentos

LC DE INTERCAMBIO IÓNICO

+ Intercambiador iónico (aniónico)


- y + : Especies a separar
+
- Las especies con carga negativa se unen a la resina que está

-+ + +
Flujo de fase móvil

cargada positivamente, quedando retenidas.

+- - - Las especies con carga positiva son repelidas por la resina


siendo eluídas de la columna.
- + +
EQUILIBRIOS DE INTERCAMBIO
+- +
+ + Intercambiador catiónico:
- + xRSO3-H+ + Mx+ ↔ (RSO3-)xMx+ + xH+
+ + +-
sólido disolución sólido disolución

Intercambiador aniónico:
- xRN(CH3)3+OH- + Ax- ↔ [RN(CH3)3+]xAx- + xOH-
sólido disolución sólido disolución

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1. Fundamentos

LC DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS

Bolas de gel: fase estacionaria

y : especies a separar
Las moléculas más pequeñas penetran
en los intersticios o canales del gel,
viajando a menor velocidad
Flujo de fase móvil

Las moléculas más grandes no pueden penetrar


en los canales del gel y por tanto viajan a mayor
velocidad.

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2. Instrumentación

COMPONENTES DE LA INSTRUMENTACIÓN

Depósitos de fase móvil

Bomba cromatográfica

Sistema de inyección
Depósito
de residuos
Compartimento para la columna
cromatográfica: Columna
Detector

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2. Instrumentación

Columna
Detector cromatográfica
fluorimétrico

Válvula de
inyección

Fase móvil

Bomba
cromatográfica 7
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2. Instrumentación

SISTEMA DE BOMBEO
• Proporciona presiones superiores
a 6000 psi.
• Salida de disolventes libres de
impulsos.
• Velocidades de flujo habituales de
0,1 – 5 mL/min.
• Reproducibilidades de flujo de, al
menos, 0,5% (Ej. 2 mL min-1: 1,99 –
2,01 mL/min)
• Resistencia a la corrosión .

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2. Instrumentación

SISTEMA DE INYECCIÓN: - Muestreadores automáticos


- Válvulas de bucle de muestreo

Lazo o bucle de
inyección (5 – 500 µL)

Salida hacia
la columna

Entrada de fase móvil


desde la bomba

Palanca para
Microjeringa cambio de posición
Orificio para inyección
mediante microjeringa 9
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2. Instrumentación

Microjeringa Microjeringa

A
residuos

Hacia la Lazo de
columna muestra
Entrada de Hacia la Entrada de
fase móvil columna fase móvil
POSICIÓN DE POSICIÓN DE
CARGA INYECCIÓN

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2. Instrumentación

MUESTREADOR AUTOMÁTICO

Brazo de
inyección

Bandeja

Lavado

Viales de
muestras

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2. Instrumentación
COLUMNA CROMATOGRÁFICA
Entrada
• Columnas: L=10-30 cm. D.I.= 4-10 mm.
Rellenos de tamaño de partícula: 5-10 μm.
Guarda-
columna N/m= 40000-60000
Fritas de
titanio poroso
• Microcolumnas: L=3-7cm. D.I.=1-4 mm.
Carcasa de Rellenos de tamaño de partícula: 3-5 μm.
alumnio N/m= 100000
anodizado

Columna principal
(plástico)

Frita de titanio
poroso

Salida
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2. Instrumentación

COLUMNAS DE LC

COLUMNA PRECOLUMNA

Flujo de
fase móvil

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2. Instrumentación

TERMOSTATIZACIÓN DE LA COLUMNA

Columna

Compartimento
de
termostatización

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2. Instrumentación

SISTEMAS DE DETECCIÓN
Algunos de los detectores comerciales más usados

Detector Límite de detección Intervalo de linealidad en


aproximado, ng decenas

Absorbancia 0,1 – 1 3-4


Fluorescencia 0,001 – 0,01 5
Electroquímico 0,01 - 1 4-5
Conductividad 0,5 - 1 5
Índice de refracción 100 - 1000 3
Espectrometría de masas 0,1 - 1 5

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2. Instrumentación
ESQUEMAS BÁSICOS DE DETECTORES

ESPECTRÓMETRO DE ABSORCIÓN
ESPECTRÓMETRO DE MASAS
VISIBLE-ULTRAVIOLETA
Salida de flujo
Fuente de Analizador Detector
Entrada iones de masas de iones
de flujo

Identificación:
Fuente
de luz Detector Espectros de masas
Adquisición
Abundancia de datos

Entrada
de flujo

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3. Optimización de la separación cromatográfica

A. SELECCIÓN DEL TIPO DE LC


Aumento de la polaridad Parámetros a considerar:
Insoluble en agua Soluble en agua
- Peso molecular
- Solubilidad
No polar Iónico
Polar no iónico
- Polaridad
- Estructura química
Reparto
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Intercambio
Adsorción iónico
(Reparto (Reparto
en fase en fase
reversa) normal)
103
Peso molecular

104
Exclusión

105
(En gel permeable) (Filtración en gel)

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3. Optimización de la separación cromatográfica

B. SELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL

Descartar los disolventes incompatibles por sus propiedades físicas

Ajuste de la fuerza de los disolventes

Selectividad de los disolventes

Fase móvil óptima

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3. Optimización de la separación cromatográfica


AJUSTE DE LA FUERZA DE LOS DISOLVENTES

Separación de 8 compuestos
Fase móvil:
Mezclas agua (A)/acetonitrilo (B)

ELUCIÓN ISOCRÁTICA

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3. Optimización de la separación cromatográfica


AJUSTE DE LA FUERZA DE LOS DISOLVENTES
ELUCIÓN EN GRADIENTE

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3. Optimización de la separación cromatográfica

LC DE REPARTO
Técnica Fase Fase
estacionaria móvil
Fase normal polar apolar 4>3>2>1
Fase reversa apolar polar 1>2>3>4

Polaridad de los compuestos

3 4
Respuesta del detector

2
1

Inyección

Tiempo

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4. Aplicaciones al análisis de fármacos

LC DE REPARTO
Sulfonamidas

Fase reversa.
Elución en gradiente con mezcla
ACN:agua.

Pesticidas, sulfonamidas, vitaminas, drogas y sus metabolitos, antibióticos, esteroides,


analgésicos, colorantes, ácidos grasos, nucleótidos ….
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4. Aplicaciones al análisis de compuestos orgánicos

LC DE ADSORCIÓN : Fase estacionaria alúmina y sílice


ORDEN EN TIEMPO DE RETENCIÓN DE MAYOR A MENOR

Olefinas
Hidrocarburos aromáticos
Haluros, sulfuros
Éteres
Nitrocompuestos
Ésteres, aldehídos, cetonas
Alcoholes, aminas
Sulfonas
Sulfóxidos
Amidas
Ácidos carboxílicos

Obsérvese que los compuestos menos polares presentan mayor afinidad por la fase estacionaria

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4. Aplicaciones al análisis de aguas

LC DE INTERCAMBIO IÓNICO

A C

Análisis y control de
calidad de aguas

B D
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4. Aplicaciones al análisis de proteínas

LC DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

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