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Nombre completo: Juan Esteban Zurita Fecha: 26/10/2017

En esta actividad, analizarás las secuencias de virus del Ebola que fueron aisladas de pacientes
en Sierra Leona durante el brote de 2013–2016, con el fin de rastrear la propagación del virus.

Piensa como un científico: La selección natural durante un brote (Think Like a Scientist: Natural
Selection in an Outbreak) (https://www.youtube.com/watch?v=iMuICicNvQk)

Considerando lo que viste en el video y lo que discutieron las Dras. Sabeti y Moses, identifica
tres factores que contribuyeron al número de individuos infectados durante el brote de Ebola.
1. Delimitación de zonas urbanas: El primer caso se dio por un contagio zoonótoco entre un
humano y un murciélago en Guinea, África, duarante el 2013. Esto indica que la población
de Guinea está en frecuente contacto con animales que tienen potencial de contagiar
enfermedades zoonóticas. Es que no debe ser de solamente el Ebola la única enfermedad
zoonótica frecuente en la zona, ya que los murciélagos son vectores de varios virus y otros
patógenos humanos. A su vez, en Guinea al menos, no se minimiza la intercacción entre
estos animales que portan agentes infecciosos y los humanos.
2. Modo de contagio: El virus es particularmente virulento porque puede transmitirse por
contacto, desde fluídos, como el sudor o la sangre, de alguien infectado hacia un humano
sano. Esto hace al virus altamente virtulento e incrementa la tasa de contagio. Si es que una
persona se infecta y empieza a desarrollar síntomas y su familia o personal de salud intentan
cuidar de él, también ellos van a terminar infectados. Moses dijo que este virus se transmite
por amor, es decir, que el mero hecho de cuidar a alguien infectado de Ebola sin conocer
sobre la patogenicidad del virus, hará que una exista una transmisión del virus. De acuerdo
a Sabeti, el riesgo de muerte para empleadores de la salud es 20 veces mayor que el de la
población en general y eso se debe a que ellos están en contacto con el virus de manera más
frecuente. Una persona infectada de cierta manera podría hasta evitar contagiar si conoce
las vías de transmisión, pero el personal de salud siempre estará atendiendo a enfermos.
3. Mutaciones favorables: El virus del Ebola pudo haber adquirido mutaciones que
favorecieran su transmisión e infección a humanos mientras infectó poblaciones de animale
y de humanos. Mi hipótesis se parece a lo que menciona Sabeti: que el virus mutó primero
durante su propagación dentro de las poblaciones de animales infectados en contacto,
previo a los humanos, como puede ser murciélagos u otro animal más emparentado con
humanos dentro del grupo de los primates, o incluso con los mismos humanos. Luego
ocurrió un primer brote que le permitió al virus adaptarse gradualmente al cuerpo humano,
hasta que finalmente se vieron los grandes brotes desde el año 2013.
4. Movilidad y sistema de salud: En el video se habla sobre estos dos factores y su contribución
con la alta tasa de transmisión del Ebola dentro de África central. Primero, en Sierra Leona
ocurrió un brote en un periodo político conflictivo, después de la guerra civil, para la gente
de aquella nación. Su sistema de salud no tenía la capacidad de sustentar un brote infeccioso
masivo, es decir, tratar a tantas personas infectadas a la vez ni enseñar sobre formas de
prevenir los contagios. Solo funcionaba el hospital de Kenema. Sabiendo la vía de
transmisión del virus, se puede saber que es muy facil contagiar o adquirir la enfermeda d.
Por ello el brote llegó a tener tantos pacientes infectados por día gracias a la gran movilidad
de la gente en Sierra Leona. Las carreteras eran siempre buenas y la gente se movía de un
laro a otro debido a sus actividades económicas.

Define el término “mutación” al respecto del virus de Ebola.


Una mutación es un cambio aleatorio en la secuencia de nucléoteidos del genoma de un
organismo, en este caso, en el genoma de ARN del vírus del Ebola. Cada vez que el material
genético se replica exite la probabilidad de que la nueva copia de ARN difiera en uno o más
nucléotidos, en comparcaión a la secuencia original, haciendo que los productos que codifican
las nuevas secuencias sean diferentes a los que codifican las secuencias originales, dependiendo
del tipo de mutación que haya ocurrido. Entonces pueden ocurrir dos eventos importantes, si
una mutación es desfavorable para las nuevas copias del virus, entonces el virus perderá
adaptabilidad a ambientes diferentes. Al contrario, si la mutación es favorable, el virus podrá
adaptarse mejor a su entorno. Mientras más oportunidades de mutaciones existan para el virus,
entonces más oportunidades hay de que estos dos eventos ocurran y de que eventualmente
una nueva cepa del virus sea más infecciosa para un organismo determinado mientras se va
propagando entre la población de este organismo, como ocurrió en humanos.

En tus propias palabras, ¿por qué es importante examinar las secuencias del genoma del virus
del Ebola durante un brote?
Es importante porque se pueden enontrar patrones sobre la evolución del virus en un
mismo paciente infectado, como entre pacientes que se han transmitido la enfermedad, que
sean de utilidad para manejar el virus en poblaciones en riesgo de infección. Digamos, si es que
se diagnostica fiebre hemorrágica por Ebola a un paciente al inicio de la infección y se extrae
una muestra del virus dentro del paciente y se secuencia su ARN, entonces se tendrá un punto
de partida para conocer el estado del virus en periodo de infección aguda. Luego, en etapas más
tardías de la infección, conociendo el modo de contagio del virus, es probable que lo haya
contagiado a otra persona. Entonces se pueden tomar muestras de ambos pacientes y
secuenciar los genomas. De repente habrá información suficiente que se puede correlacionar
con mutaciones dentro del ARN del virus con datos epidemiologicos como incremento en la tasa
de contagio o el tiempo que tarda la infección o la gravedad de la infección. Así el personal de la
salud podrá tener información importante sobre el manejo de personas infectadas, prevención
de la transmisión del virus y en futuros escenarios, búsqueda de alguna especie de tratamiento
efectivo.

Figura 1. Secuencias del virus del Ebola


 Cambia el orden de las secuencias 1–15 para identificar patrones en las mutaciones.
 Agrupa las secuencias de acuerdo a los patrones que observes.
 Cada secuencia debe pertenecer a un grupo, y no es necesario que todos los miembros del mismo grupo
sean idénticos. Usa tus agrupaciones para responder las preguntas de análisis:

(A) ¿Cómo te dividiste los grupos de secuencias? Por favor incluir una foto de los
grupos bien divididos, o una explicación por escrito como dividiste los grupos
diferentes (utilizando los números de las secuencias).

La tabla 2 muestra los grupos encontrados en el pool de secuencias de la figura 1. Antes


de ver la tabla 2 hay que saber que le di un orden a los nucleótidos de la secuencia de referencia,
que se especifica en la tabla 1. Entonces, sabiendo eso, la tabla 2 contiene información sobre las
mutaciones que tiene cada secuencia, en comparación a la secuencia de referencia. La columna
“Característica” contiene las mutaciones específicas, que justifican el grupo. Se entiende que
todas las secuencias están emparentadas y se conoce que solo se encuentran mutaciones de
cambio de letra, entonces cada grupo, desciende del que le precede, es decir, cada grupo
acarrea también las mutaciones del grupo que le precede. Digamos, el grupo 3 contiene
secuencias con un cambio en la posición 3 (3) de adenina (A) a guanina (G): (3)𝐴 → 𝐺 , además
tiene de antecesor al grupo 2, por ende también tiene los cambios de nucleótidos (2)𝑇 → 𝐶 y
(6)𝐶 → 𝑇 que le caracterizan al grupo 2. De la misma manera con el resto de grupos. La figura 2
refleja esto en un cladograma. El nuevo orden de secuencias se refleja en la tabla 3.

Tabla 1. Posiciones de nucleótidos en secuencia de referencia


Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Referencia C T A T G C A A G C A G T T

Tabla 2. Grupos de secuencias


Grupo Característica Secuencias
1 Sin mutación Referencia
2 (2)𝑇 → 𝐶 4, 6, 11, 13
(6)𝐶 → 𝑇
3 (3)𝐴 → 𝐺 3
4 (5)𝐺 → 𝐴 14
5 (8)𝐴 → 𝐺 9
6 (10)𝐶 → 𝑇 1
(11)𝐴 → 𝐺
7 (1)𝐶 → 𝑇 2, 5, 7 ,15
(7)𝐴 → 𝐶
(12)𝐺 → 𝐴
(13)𝑇 → 𝐶
8 (14)𝑇 → 𝐶 8, 12
9 (4)𝐴 → 𝐶 10
(9)𝐺 → 𝐴
Tabla 3. Nuevo orden de secuencias
Secuencia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Grupos
Referencia C T A T G C A A G C A G T T 1
Secuencia 4 C C A T G T A A G C A G T T
Secuencia 6 C C A T G T A A G C A G T T
2
Secuencia 11 C C A T G T A A G C A G T T
Secuencia 13 C C A T G T A A G C A G T T
Secuencia 3 C C G T G T A A G C A G T T 3
Secuencia 14 C C A T A T A A G C A G T T 4
Secuencia 9 C C A T G T A G G C A G T T 5
Secuencia 1 C C A T G T A A G T G G T T 6
Secuencia 2 T C A T G T C A G C A A C T
Secuencia 5 T C A T G T C A G C A A C T
7
Secuencia 7 T C A T G T C A G C A A C T
Secuencia 15 T C A T G T C A G C A A C T
Secuencia 8 T C A T G T C A G C A A C C
8
Secuencia 12 T C A T G T C A G C A A C C
Secuencia 10 T C A G G T C A A C A A C T 9

(B) Escribe los criterios que utilizaste para asignar las secuencias a los distintos grupos.

Pensé que podría servir agrupar las secuencias por cada nueva mutación encontrada, en
comparación a la secuencia de referencia. Para ello di un número a cada nucleótido de la
secuencia de referencia, en orden, del 1 al 14, como se especifica en la tabla 1. Cabe recalcar
que importa conservar el orden de la secuencia. Además, también tomé en cuenta que es mucho
más probable que las mutaciones aparecieran en un nucleótido por vez, que más de una a la
vez. En la tabla 4 listo cada secuencia con su número de mutaciones y las posiciones en donde
se encuentra la mutación. Reordené las secuencias de acuerdo al número de mutaciones, de
menor a mayor. Luego comparé los cambios de nucleótido de las secuencias con números
iguales de mutaciones, a ver si compartían estos cambios. La tabla 5 resume todos los cambios
de nucleótido encontrados entre las 15 secuencias, en comparación a la secuencia de referencia.
Luego, en función de los cambios de nucleótido volví a agrupar las secuencias. Hice grupos por
cada nueva mutación que aparecía, que se muestran en el cladograma de la figura 2 y en la tabla
2. Cada clado es un grupo con una nueva mutación, en relación a la secuencia de referencia. Si
se toma en cuenta a la secuencia de referencia como parte del pool de secuencias, entonces hay
9 grupos de secuencias, que se resumen en la tabla 2.

Tabla 4. Abundancia de mutaciones en comparación a referencia


Secuencia Número de mutaciones Posiciones
1 4 2,6,10,11
2 6 1,2,6,7,12,13
3 3 2,3,6
4 2 2,6
5 6 1,2,6,7,12,13
6 2 2,6
7 6 1,2,6,7,12,13
8 7 1,2,6,7,12,13,14
9 3 2,6,8
10 8 1,2,4,6,7,9,12,13
11 2 2,6
12 7 1,2,6,7,12,13,14
13 2 2,6
14 3 2,5,6
15 6 1,2,6,7,12,13
Tabla 5. Cambio de nucleótido por posición en comparación a la secuencia de referencia
Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Referencia C T A T G C A A G C A G T T
Mutación T C G G A T C G A T G A C C

Describe criterios alternativos que podrías haber empleado y explica por qué optaste por los
criterios expuestos en tu respuesta a la Pregunta 4.

Otro criterio podría haber sido usar solamente el porcentaje de parentesco de las
secuencias en comparación a la secuencia de referencia. Por ejemplo, solo usar el número de
mutaciones que aparecieron en cada secuencia y a más número de mutaciones, más divergencia
entre las secuencias y la secuencia de referencia. Aunque pienso que terminaría siendo
exactamente el mismo orden que ya puse antes en la tabla 3.
Otro pudo haber sido ordenar las secuencias por tipo de mutación, es decir, por cada
cambio de nucleótido que apareció. Entonces se ordenaría todos los que cambian a citosina,
luego todos los que cambian a guanina, y así con las que restan. Sin embargo, con este criterio
no habría secuencia u orden de la información que cambió en el tiempo, porque se podría elegir
arbitrariamente cuál de los nucleótidos va primero. Sin embargo, sería bueno para determinar
cuáles son los cambios de nucleótido más frecuentes a lo largo de la evolución del genoma del
virus, que se traduce a qué mutaciones se vuelven más conservadas mientras existan nuevos
contagios e individuos infectados. De esa manera quizá detectar las mutaciones que le confieren
más adaptabilidad a los virus mientras se replican y evolucionan dentro del ser humano.
Opté por los criterios de la pregunta 4 porque me permitían tener una idea cronológica
de los cambios observados en el genoma del virus del Ebola. Esto me permite entender cuáles
han sido los cambios que ha tenido el virus mientras se lo encontraba en las poblaciones. Quizá
entonces saber cuáles de las mutaciones se fijan más en las poblaciones de los virus y cuales
tienden a ser neutrales. Esto podría ser muchísimo más útil si se tuviera información sobre la
epidemiología de la infección, como virulencia, infectividad, resistencias, tasas de replicación y
cosas por el estilo. Así se podría asociar ciertas mutaciones a las características antes
mencionadas. Por ejemplo, por el orden propuesto en la tabla 3, se puede decir que los grupos
3, 4 y 5 se caracterizan por mutaciones neutrales o deletéreas, porque no se conservan en el
resto de secuencias con mayor divergencia. No se puede saber si fueron neutrales o deletéreas
porque no se tiene información al respecto. No se sabe si estas cepas son extantes o ya extintas.
Se podría asumir que a mayor distancia entre nucleótidos de una misma base se tiene mayor
probabilidad de error, por lo que se podría armar un árbol genealógico con mutaciones de
acuerdo a número de mutaciones y a orden de ocurrencia dentro del grupo, entonces mientras
una mutación haya aparecido en una posición más cercana al nucleótido de inicio de secuencia,
entonces es más reciente. Esto se muestra en la figura 3.

Si una secuencia tiene un mayor número de mutaciones en comparación con la secuencia de


referencia, ¿significa que corresponde a un momento temprano o tardío del brote? Explica tu
respuesta.

Cuando una secuencia tiene un número mayor de mutaciones que otra, en comparación con la
secuencia de referencia, entonces se puede decir que es menos emparentada, por lo que es más
vieja en el transcurso evolutivo de la secuencia. Eso porque los ácidos nucleicos tienen una tasa
de mutación que depende del error que tengan las enzimas que los replican, como la polimerasa
de ADN o la polimerasa de ARN de sentido negativo, como la que tiene el virus del Ebola
(ViralZone, 2017). Cada nueva copia del genoma del virus puede generar mutaciones. Ya que la
mutación es un evento probabilístico, puede ocurrir en cualquier logar del genoma en cualquier
replicación, pero es muy poco probable que ocurran muchas más de una mutación por
replicación en donde aparece. Si es que las enzimas de replicación fueran muy erradas, el virus
podría perder mutaciones que le confieran adaptabilidad y la integridad del genoma se vería
comprometida. Por ejemplo, se sabe que la tasa de mutación de una polimerasa dependiente
de ARN del fago QB tiene una tasa de error de 1.5X10-3 bp-1, que significa que el virus produce
una mutación en su genoma cada 1500 pares de bases (Carey, 2015). Por ende, se sabe que, a
más mutaciones, más tiempo de replicación en comparación a una cepa del virus durante etapas
tempranas del brote, por ende, más mutaciones en el genoma y de etapas más tardías de un
brote.

Crea una representación gráfica que resalte la relación entre tus grupos. Los organigramas y
árboles son ejemplos de representaciones gráficas efectivas. Asegúrate de que tu
representación incluya una flecha que indique el paso del tiempo durante el brote.

Figura 2. Cladograma para secuencias de virus de Ebola

Aunque si tengo la figura 2, hay cosas que explicar. Por ejemplo, los clados 3, 4 y 5 (que
da lo mismo que los grupos 3, 4 y 5) pueden parecer encontrarse en orden cronológico, sin
embargo, no es así necesariamente. Ya que todos ellos presentan solamente una mutación
después de divergir del clado 2 (grupo 2), entonces se sabe que estos tres grupos son más viejos
que el grupo 2, pero no se sabe en qué orden surgieron. Se necesitaría más información, como
las fechas de primeros registros o avistamientos de las mutaciones, pienso. De igual manera, el
orden de las secuencias dentro de cada grupo no es de interés puesto que son del mismo
genotipo. Fuera de los grupos mencionados, el resto si está en orden cronológico porque a
mayor número de mutaciones, se entiende como más tiempo bajo selección natural y mayor
probabilidad de tener mutaciones, lo que lleva a efectivamente tener más mutaciones.
Para ver qué tan acertados son los resultados hice un apareamiento de las secuencias
con la herramienta “Multiple Sequence Alignment” MAFFT de EMBL y obtuve un árbol
filogenético, que se muestra en la figura 3. Se ven características como el grado de parentesco
entre secuencias. Este grafico propone un orden de las secuencias mas no las agrupa. Existen
ciertos clados que no deberían existir porque no tienen diferencias entre sí. Sin embargo si da
una idea de cuáles son las secuencias más viejas y nuevas en relación a su predecesor.

Figura 3. Multiple Sequence Alignment MAFFT de todas las secuencias

Luego, hice un recalculo, eliminando secuencias que son exactamente iguales y dejando
las que representan a cada grupo. La herramienta arrojó el árbol de la figura 4, que muestra el
mismo orden que propongo en la tabla 3. Esto confirma que el análisis fue hecho correctamente.

Figura 4. Multiple Sequence Alignment MAFFT por secuencia representativa de cada grupo

1. Carey, L. B. (2015). RNA polymerase errors cause splicing defects and can be
regulated by differential expression of RNA polymerase subunits. eLife, 4, e09945.
http://doi.org/10.7554/eLife.09945
2. Gire, Stephen K. et al. (2014). “Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and
transmission during the 2014 outbreak.” Science 345(6202):1369–1372.
3. Tam, Ruth. 2014. “This is how you get Ebola, as explained by science.” PBS Newshour.
4. “Frequently Asked Questions on Ebola virus disease.” World Health Organization.
http://www.who.int/csr/disease/ebola/faq-ebola/en/
5. http://www.hhmi.org/biointeractive/ebola-disease-detectives
6. ViralZone. (2017). Ebolavirus. Obtenido desde: http://viralzone.expasy.org/5016