METODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOOGICO 2

 ANALIZAR OS DIFERENTES GRUPOS DE ORGANISMOS QUE SE EXCLUYE DEL RECUPERADO A

PARTIR DE MUESTRAS BIOOGICAS.
 REALIZAR TÉCNICAS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACION Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS
EMPLEANDO LOS EQUIPOS Y REACTIVOS NECESARIOS INDICADOS EN FUNCION DE PARAMETRO A
DETERMINAR.

COLORACIONES

ES EL PROCESO MEDIANTE EL CUAL APLICAMOS COLOR A LAS CELULAS DE LOS ORGANISMOS QUE
SE ENCUENTRAN EN UNA MUESTRA BIOLOGICA ESTUDIADA.
EL COLORANTE ES AQUELLA SUSTANCIA QUE TIENE LA PROPIEDAD DE ORIGINAR COLOR A OTROS
CUERPOS DE CUALQUIER NATURALEZA,EN EL PROCESO DE COLORACION SE DEBE TENER EN
CUENTA DE ADIESTRAR AL ESTUDIANTE EN LA PREPARACION DE MATERIALES MICROBIANOS ASI
COMO TAMBIEN EL CASO APROPIADO DE LAS COLORACIONES SIMPLES Y DIFERENCIALES.
RECONOCER EL FUNDAMENTO DE PORQUE EXISTEN CARACTERISTICAS DIFERENCIALES ENTRE LOS
ORGANISMOS GRAM POSITIVOS Y LOS MICROORGANISMOS GRAM NEGATIVOS.
DE ACUERDO AL NUMERO DE SOLUCIONES COLORANTES Y A LOS TEJIDOS DE ESTUDIO SE
´PUEDEN REALIZAR DIFERENTES TIPOS DE COLORACION COMO SON:COLORACION
SIMPLE,DIFERENCIAL,NEGATIVA Y SELECTIVA.
PARA QUE UNA SUSTANCIA SE COMPORTE COMO COLORANTE DEBE ESTAR COMPUESTA POR:
CROMOGENO (MOLECULA INCOLORA + CROMOFORO) + AUTOCROMO =COLORANTE.

CROMOGENO: SON LAS MOLECULAS QUE POSEEN POTENCIALES DE COLORACION CON PEDIDOS
CON UN RADICAL LLAMADO CROMOGENO.
CROMOFORO: GRUPO DE ATOMOS MONOSATURADOS SUSCEPTIBES QUE DAN COORACION A
LAS MOLECULAS DE LAS CUALES FORMAN PARTE LA FUERZA DE LOS CROMOFOROS VARIAN CON
LA NATURALEZA DE SU CAPA Y SU ESTRUCTURA.
SI EL CROMOFOR ES UN ION POSITIVO EL COLORANTE ES DE TIPO BASE PERO SI LA CARTA ES
NEGATIVO SERA DE TIPO ACIDO.
AUTOCROMO: GRUPO DE ATOMOS NO SATURADOS DEBIDO A ESTA DICTAURACION INFLUYE EN
EL COLOR Y PUEDEN SER:
a) SIMPLE:PORTAN UN ATOMO NO SATURADO(NH2)
b) COMPUESTO:CUANDO CADA UNO ENCIERRA DOS ATOMOS NO SATURADOS DE GRUPO
HIDROQUIMICO (NHNH2)

CLASES DE COLORANTES:
1. DE ACUERDO A SU ORIGEN
a) NATURALES: SON COLORANTES OBTENIDOS A PARTIR DE LA NATURALEZA YA SEA DE
FUENTES ANIMALES O VEGETALES.
POR EJEMPLO: LA HEMATOXIDINA, CARMIN
b) ARTIFICIALES: SON COLORANTES OBTENIDOS MAYORMENTE COMO DERIVADOS DE LAS
ALQUITRAN DE ELLAS.
POR EJEMPLO: CRISTA VIOLETA, SAFRANINA.
2. DE ACUERDO A SU COMPOSICION QUIMICA
a) BASICOS: SON COLORANTES QUE SU PARTE CROMOFORA LLEVAN CARGA ELECTRICA
POSITIVA LA QUE TENDRIA UNA FUERTE AFINIDAD POR LOS GRUPOS ELECTRO
NEGATIVOS QUE PRESENTAN NORMALMENTE LAS BACTERIAS EN SU PROTOPLASMA
COMO SON LOS ACIDOS NITRICOS DERIVADOS.
POR EJEMPLO: FUCSINA BASICA, CRISTAL VIOLETA, Y OTROS.
b) ACIDOS: SON COLORANTES QUE SU PARTE CROMOFORA LLEVAN CARGAS ELECTRICAS
NEGATIVAS LAS QUE TENDRIAN FUERTE AFINIDAD POR LOS GRUPOS ELECTROS
POSITIVOS DE LAS CELULAS.
POR EJEMPLO: ANARANJADO DE METIO, EL ACIDO FONICO.
c) NEUTROS: SON COLORSNTES QUE RESALTAN DE LA COMBINACION DE LOS COLORANTES
ACIDOS Y BASICOS.
POR EJEMPO: EL GIEMSA, WRIGHT
 PROCEDIMIENTO DE UNA COLORACION
1. EXTENSION: CONSISTE EN LA FORMACION DE UNA DELGADA PEICULA DE LA MUESTRA EN UNA
LAMINA PORTAOBJETO LIMPIA TRANSPARENTE Y DESENGRASADA.
SI LA MUESTRA ES LIQUIDA SE REALIZA CON EL ASA DE SIEMBRA EN ARO ESTERILIZADA, SI EL
CULTIVO ES SOLIDO PREVIAMENTE COLOCAR UNA GOTA DE AGUA DESTILADA Y CON EL ASA
BACTERIOLOGICA O DE KOLE TOMAR LA MUESTRA Y HOMOGENIZAR.

2. FIJACION: ES EL PROCESO QUE SE REALIZA CALENTANDO MODERADAMENTE EL FROTIS EN LA

LLAMA DE UN MECHERO O CON ALCOHOL DE 60% Y OTRAS SUSTANCIAS O LIQUIDO FIJADOR
SEGÚN LA TECNICA O PROCEDIMIENTO.

3. COLORACION: ES EL PROCESO MEDIANTE EL CUAL SE CUBRE LA EXTENSION FIJADA CON LA

SOLUCION O COLORANTE ENSAYADO DEJANDO ACTUAR CON TIEMPO REQUERIDO DE ACUERDO
A LA CELULA. SE IDENTIFICA LA COLORACION MEDIANTE EL USO DE MORDENTE POR EJEMPO EL
LUGOL PARA LA COLORACION GRAM.
 4. LAVADO: SE DEBE LAVAR CON AGUA CORRIENTE PARA QUITAR EL EXCESO DE COLORANTE EN
ALGUNOS CASOS SE RECOMIENDA EL USO DE AGUA DESTILADA.
5. DIFERENCIACION: SE REALIZA EMPLENADO O UTILIZANDO ALCOHOL, ALCOHOL CETONA, ACIDO
FUERTE, COMO AGENTES DE COLORANTES DEBIENDO DEJARSE ACTUAR HASTA QUE EL LIQUIDO
PASE INCOLORO (QUE NO VOTE COLOR).
6. LAVADO: REALIZARLO CON AGUA CORRIENTE O AGUA DESTILADA.
7. RECOLORACION: SE UTILIZA PARA LA COLORACION DE ESTRUCTURAS QUE SE DECOLORANPOR
ACCION DE LOS DIFERENCIADORES.
SE RECOMIENDA HACER ACTUAR EL COLORANTE DE CONTRASTE EN TIEMPOS VARIABLES SEGÚN
EL TIPO DE MUESTRAS.
8. LAVADO: SE REALIZA CON AGUA CORREINTE O AGUA DESTILADA.
9. SECADO: ES PREFERIBE EL AMBIENTE COLOCANDOLO DE FROMA INCLINADA O VERTICAL PARA EL
RECUBRIMIENTO Y POR EL FROTIS PROTEGIDO DEL POLVO E IMPUREZAS.
SE PUEDE ACELERAR ESTE PROCESO CON EL CALOR DEL MECHERO EVITANDO EL
SOBRECALENTAMIENTO.
10. OBSERVACION: OBSERVAR AL MICROSCOPIO CON LA LENTE DE INMERSION O MAYOR AUMENTO
Y ACEITE DE CEDRO.

METODOS DE COLORACION
1. COLORACION SIMPLE: SE EMPLEA PARA COMPROBAR LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN
CUALQUIER MATERIAL Y MUESTRA,REVELAR EL TAMAÑO, FORMA Y DISPOSICION DE LA CELULAS
MICROBIANAS.
SE PUEDE UTULIZAR COLORANTES ACIDOS O BASICOS LOS QUE REACCIONAN CON LA CELULA
BCATERIANA MAS NO ASI CON EEMENTOS QUE LA RODEA.
PROCEDIMIENTO:
 COLOCAR UNA GOTA DE AGUA DESTILADA EN UN PORTAOBJETO LIMPIO.
 TOMAR CON EL ASA DE KOLE PREVIAMENTE FLAMEADA Y ESTERIIZADA UN POCO DE
MUESTRA,HOMOGENIZAR EN LA GOTA DE AGUA FORMANDO UNA CAPA FINA.
 CUBRIR EL PREPARADO CON EL COLORANTE DEJANDO ACTUAR POR EL PASO DE 1
MINUTO.
 LAVAR SUAVEMENTE CON AGUA
 SECAR A MEDIO AMBIENTE
 EXAMINAR LA PREPARACION AL MICROSCOPIO CON OBJETIVO DE INMERSION
HABIENDO AGREGADO PREVIAMENTE A LA MUESTRA UNA GOTA DE ACEITE DE
INMERSION O ACEITE DE CEDRO.

SI SE REALIZARA POR EJEMPLO LA COLORACION SIMPLE CON AZUL DE METILENO AL 1% EN AGUA

DESTILADA.
CASI TODOS LOS ORGANISMOS SE OBSERVARAN AL COLOR DE COLORANTE Y SERAN VISTOS MAS
FACILMENTE EN LA OBSERVACION DEL MICROSCOPIO.
2. COLORACION DIFERENCIAL: LOS MICROORGANISMOS REQUIEREN FISICA Y QUIMICA ENTRE SI Y
POR ESO REACCIONAN DE UNA MANERA DISTINTA AUN DETERMINADO PROCEDIMIENTO DE
COLORACION, PERMITE DISTINGUIR OS DIFERENTES TIPOS DE MICROORGANISMOS O BACTERIAS.
LA COLORACION GRAM FUE DESARROLADA EN EL AÑO 1865 POR CRISTHIAN GRAM EN
DINAMARCA ES UNO DE LOS METODOS MAS UTILES EN BASE DE BACTERIOLOGIA, POR MEDIO DE
 ESTE METODO ES POSIBLE DISTINGUIR A LAS BACTERIAS EN 2 GRANDES GRUPOS: BACTERIAS
GRAM POSITIVAS Y BACTERIAS GRAM NEGATIVAS.
CUANDO SE TIÑEN CON VIOLETA DE CRISTAL O VIOLETA DE GENCIANA Y SE RETRACTA CON
SOLUCIONES EN BASE DE YODO TODOAS LAS BACTERIAS SE TIÑIRAN DE UN COLOR AZUL
PURPURA MUY OSCURO.
SI SE TRATA SECUENTEMENTE CON ALCOHOL O ACETONA LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS
RETIENEN LA COLORACION POR MAS TIEMPO QUE LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS.
SE ATRIBUYE ESTA DIFERENCIA AL CONTENIDO LIPIDO MUCHO MAS ELEVADO DE LAS PAREDES
CELULARES EN LAS BACTERIAS LLAMADAS GRAM POSITIVAS.
EL ALCOHOL ELIMINA CASI TODOS LOS LIPIDOS DE LA PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM
NEGATIVAS.
LAS BACTERIAS QUE SE DECOLORAN SE TIÑEN COMO COLORANTE DE CONTRASTE LA FUCSINA
BASICA O LA SAFRANINA SE TIÑEN DE COLOR ROJO DICHO COMPORTAMIENTO SE CREE QUE
DEPENDE DE LA COMPOSICION O DE LA DIFERENCIA DE LAS CAPAS SUPERFICIALES O PARED
CELULAR DE LOS 2 TIPOS DE CELULAS.
PROCEDIMIENTO:
 PREPARAR EL FROTIS DE LA MUESTRA EN UN PORTAOBJETO LIMPIO
 FIJAR LA MUESTRA Y AÑADIRLA AL MECHERO SUAVEMENTE
 CUBRIR LA PREPARACION CON EL COLORANTE PRINCIPAL Y DEJAR POR ESPACIO DE 1
MINUTO
 LAVAR CON AGUA
 ADICIONAR EL LUGOL Y DEJAR ACTUAR POR 1 MINUTO
 LAVAR A CHORRO INTERMEDIO O AGUA DESTILADA
 DECOLORAR CON ALCOHOL ACETONA HASTA QUE NO DESPRENDA MAS COLORANTE
 LAVAR CON CHORRO INTERMEDIO O AGUA DESTILADA
 CUBRIR LA PREPARACION CON EL COLORANTE SECUNDARIO LA SAFRANINA Y DEJAR
ACTUAR POR ESPACIO DE 30 SEGUNDOS(CONTRA COLORACION)
 LAVAR LA PREPARACION CHORRO INTERMEDIO O AGUA DESTILADA
 SECAR LA PREPARACION
 OBSERVAR AL MICROSCOPIO CON OBJETIVO DE INMERSION Y COLOCAR UNA GOTA DE
ACEITE DE CEDRO.

EN EL PRIMER PASO DE LA COLORACION TODOS LOS ORGANISMOS SE TIÑEN DE VIOLETA Y TOMAN UN

COLOR PARDO AZULOSO SUCIO DESPUES DEL TRATAMIENTO CON LA SOLUCION DEL YODO QUE SIRVE
COMO MORDENTE PARA FIJAR EL COLORANTE PRINCIPAL O PRIMARIO EN CIERTOS TIPOS DE
MICROORGANISMO.

LA COLORACION TIÑE A LOS ORGANISMOS QUE HAN SUFRIDO DECOLORACION DE SU COLOR NORMAL.

LOS ORGANISMOS QUE RETIENEN LA COMBINACION DEL YODO Y DEL VIOLETA DE GENCIANA O VIOLETA
DE CRISTAL RECIBEN EL NOMBRE DE GRAM POSITIVOS.

LOS QUE SUFREN PERDIDA DE SU COLOR Y SON CONTRA TEÑIDO CON EL COLORANTE SECUNDARIO
RECIBEN EL NOMBRE DE GRAM NEGATIVO.
 COLORACION ZIEHL NEELSEN (BAAR)

ESTA COLORACION ES APROPIADA PARA ORGANISMOS DE TIPO ACTINOMYCETES ESPECIALMENTE EL

GENERO MYCOBACTERIUM QUE POSEE UN ALTO CONTENIDO DE ALCOHOL LIPIDO (E-MICOL CERA) A
NIVEL DE LA PARED SE HACE DIFICULTOSO COLOREAR CON COLORACION GRAM A PESAR DE SER GRAM
POSITIVO HACIENDOSE NECESARIO SOMETER A LA REACCION DE LA CERA CON ALCOHOL MAS ACIDO
CLORIDRICOY CALOR QUE VAN A PERMITIR EL INGRESO DEL COLORANTE (FUCSINA BASICA) QUE ACTUA
COMO COLORANTE PRINCIPAL, SIENDO LOS COLORANTES SECUNDARIOS EL AZUL DE METILENO O EL
ACIDO CITRICO DE COLOR AMARILLO Y QUE ACTUA COMO CONTRASTE PARA RESALTAR EL COLOR FUCSIA
DEL MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Y PARA OBSERVAR LAS CELULAS Y DISTINTOS ACOMPAÑANTES DE
LA CELULA.

PROCEDIMIENTO:

LA COLORACION DE ZIELH NEELSEN DE ACIDO RESISTENTE O BK SON TERMINOS USADOS EN LOS

LABORATORIOS.

 PREPARAR UN FROTIS CON UN ASA DE SIEMBRA ESTERIL, COGER LA MUESTRA Y COLOCARLA EN

EL CENTRO DE LA LÁMINA.
 PROCEDER A LA COLORACION CENTRAL COLOCANDO LA FUCSINA SOBRE LA MUESTRA, DEJAR
POR UN MINUTO
 PASAR LA LAMINA SOBRE LA LLAMA DEL MECHERO SUAVEMENTE POR 2 A 3 IRAS Y VUELTAS
HASTA VER DESPRENDER HUMITO, EL COLORANTE NO DEBE SECARSE NI HERVIR
 DEJAR ENFRIAR LA LAMINA, LAVAR CON AGUA CORRIENTE O CHORRO DE AGUA
 AGREGAR AL FROTIS LA MEZCLA DE ACIDO Y ALCOHOL POR ESPACIO DE 30 SEGUNDOS
 ENJUAGAR CON AGUA
 ADICCIONAR EL COLORANTE DE CONTRASTE (AZUL DE METILENO,ACIDO CITRICO) DEJAR POR
ESPACIO DE 1 MINUTO
 ENJUAGAR CON AGUA CORRIENTE
 DEJAR SECAR COMPLETAMENTE
 OBSERVAR BAJO LA LENTE DE INMERSION

LOS BACILOS DE BK O ACIDO RESISTENTES SE TIÑEN DE COLOR FUCSIA QUE ACTUA COMO COLORANTE
PRINCIPAL, OTROS MATERIALES SE TIÑIRAN CON EL COLORANTE DE CONTRASTTE AZUL DE METILENO.
 COLORACIONES DE LAS ESTRUCTURAS BACTERIANAS

LAS ESTRUCTURAS DE LAS CELULAS TIENEN SU PROPIA COMPOSICIONQUIMICA Y FORMA LO QUE VAN A
PERMITIR FORMAR LOS COLORANTES ESPECIFICOS CON TÉCNICAS PROPIAS, ASI COMO EN EL CASO DE LAS
CAPSULAS QUE ES UNA CAPA MUCOSA A BASE DE POLISACARIDOS QUE SE PRESENTA EN LA FASE
MICROBIANA DE A BACTERIA Y POR SER RESISTENTE DIFICULTA SU COLORACION PERO SE OBSERVA
CUANDO SE DISPERSA LA LUZ BLANCA Y APARECE COMO UN HAO BLANCO RODEANDO EL CUERPO DE LA
BACTERIA Y EL COLORANTE ACTUA COMO CONTRASTE COLOREANDO EL CUERPO DE LA BACTERIA YEL
FONDO.
LOS GRANULOS E INCLUSIONES TAMBIEN EN ALGUNAS COLORACIONES APARECERAN SOLO POR SU
RESISTENCIA Y EN ALGUNOS CASOS LA METACROMACIA DE COLORANTE FRENTE AL
CROMPUSCUOPUEDEN MANIFESTAR LA PRESENCIA DEL ELEMENTO A ESTUDIAR.
LOS FLAGELOS SON ESTRUCTURAS FILIFORMES A BASE DE PROTEINA (FLAGELINA) QUE SALE DEL INTERIOR
DE LA BACTERIA Y SON MUY FLAGILES AL CALOR A PARTIR DE LOS 38°C EL ALCOHOL Y EL ACIDO LOS
DESTRUYE, LA MISMA FRICCION DURANTE EL FROTIS PARA EL CUAL SE DEBERA TENER CUIDADO
PERTINENTES PARA SU COLORACION UNA COLORACION ESPECIAL.
 COLORACION DE CAPSULAS: COORACION DE ANTHONY WECH
PUEDE TENERSE COMO MUESTRA ESPUTO, LIQUIDOS CORPORALES O CULTIVOS FRESCOS.
PARA COLOREAR CAPSULAS SE UTILIZA LA COLORACION DE TINTA CHINA NIGROSINA Y WRIGTH
SE UTILIZAN COMO REACTIVOS EL VIOLETA DE CRISTAL Y EL SULFATO DE COBRE.
PROCEDIMIENTO:
 PREPARAR UN FROTIS PERO NO FIJARLO
 CUANDO ESTE SECO AGREGAR SUAVEMENTE EL VIOLETA DE CRISTAL Y DEJARLO POR
ESPACIO DE 4 MINUTOS
 LAVAR CON LA SOLUCION DE SULFATO DE COBRE AL 20%
 DEJAR SECAR AL AIRE
LOS ORGANISMOS DEBEN DE TOMAR UN COLOR PURPURA PROFUNDO LA CAPSULA UN AZUL CLARO
CONTRA UN FONDO PURPURA CLARO TAMBIEN.
  COLORACION DE ESPORAS:

LA ESPORA ES UNA FORMACION DE REPOSO DURANTE EL CICLO BIOLOGICO DE ALGUNAS BACTERIAS

DONDE EL CITOPLASMA SE CONDENSA PIERDE AGUA Y SU METABOLISMO SE REDUCE CERCA DE 0.

LA SIMPLE COLORACION Y LA COLORACION DE GRAM NO CONSISTE TEÑIR LAS ESPORAS MENOS

PENETRABLES QUE USUALMENTE PERMANECEN COMO CUERPOS RECTATILES SIN TEÑIR. A VECES SE
REQUIERE TEÑIR LAS ESPORAS MISMAS PARA ESE FIN SE HAN DESARROLLADO VARIOS METODOS EL
REACTIVO MAS UTILIZADO PARA ESPORAS ES EL VERDE DE MALAJITA CONTRACOLOREADA CON LA
FUCSINA O SAFRANINA.

PROCEDIMIENTO:

 REALIZAR UN FROTIS Y SECARLO A LA LLAMA VARIAS VECES

 COLORAR CON VERDE DE MALAJITA AL 7.6 % DURANTE 10 MINUTOS
 ENJUAGAR CON AGUA CALIENTE
 CONTRA COLOREAR CON FUCSINA O SAFRANINA DURANTE 30 SEGUNDOS
 LAVAR CON AGUA CORRIENTE, SECAR Y OBSERVAR BAJO LA LENTE DE INMERSION

LAS ESPORAS DEBEN TEÑIRSE DE UN COLOR VERDE ENTERO MIENTRAS EL RESTO DE ORGANISMO DE LA
BACTERIA SE TIÑE DE COLOR ROJO
  COLORACION DE FLAGELOS:

LOS FLAGELOS SON ESTRUCTURAS FILIFORMES COMPUESTAS DE PROTEINA LA PROTEINA SE CONOCE

COMO FLAGELINA, EXITEN VARIAS BACTERIAS QUE AL PRESENTAR FLAGELOS LA DISPOSICION DE LOS
MISMOS PUEDEN REALIZARSE EN UNO AMBOS POLOS TENIENDO EN CUENTA EL NUMERO Y SU
DISPOSICION.
LOS FLAGELOS SE CLASIFICAN EN : MONOTRICOS, AMFITRICOS, LOFOTRICOS, Y PERITRICOS.
PROCEDIMIENTO:

 SE DEBE UTILIZAR PORTAOBJETOS NUEVOS Y LAVARLOS CON ALCOHOL

 CULTIVOS FRESCOS PREFERENTEMENTE EN AGAR NUTRITIVO Y DE 12 HORAS.
 LOS FLAGELOS TEÑIDOS SE OBSERVAN DE COLOR POR IMPRESNACION EL CUERPO DEL
ORGANISMO SE TIÑIRA DE COLOR AZUL.
 SIEMBRA MICROBIANA
SON PROCEDIMIENTOS QUE CONSISTEN EN ACONDICIONAR EL MICROORGANISMO A UN MEDIO
DE CULTIVO FERTIL DE ACUERDO A SUS EXIGENCIAS VITALES PARA QUE EN CONDICIONES
OPTIMAS DE TEMPERATURA Y TIEMPO DE INCUBACION PUEDAN DESARROLLARSE Y
MULTIPLICARSE EN VITRO.
LA SIEMBRA MICROBIANA TIENE 2 FINALIDADES:
a) PARA REALIZAR UN AISLAMIENTO
b) PARA REALIZAR UN TRANSPLANTE
AISLAMIENTO:
PERMITE LA SEPARACION DE LOS MICROORGANISMOS EL ESTADO DE PUREZA A PARTIR DE UNA
MUESTRA PROVENA SE REQUIERE DE UN MEDIO SOLIDO CON GRAN SUPERFICIE PARA QUE LOS
MICROORGANISMOS AL SER DISEMINADOS SOBRE EL MEDIO GENEREN SU PROGENIO O POBLACION
(CEPA) POR FORMACION DE COLONIAS SEPARADAS.
SI SE AISLAN EN CEPAS DISTINTAS CADA COLONIA TENDRA CARACTERES ESPECIALES. LA MORFOLOGIA
BACTERIANA SERA TAMBIEN DISTINGUIDA.
TRANSPLANTE:
SIGNIFICA LA SEPARACION DE LA CEPA A UN MEDIO DE CULTIVO APROPIADO EN TUBO QUE PUEDE SER
LIQUIDO O SOLIDO.
SE CONSERVA LA CEPA PURA Y POR SUS SIGUIENTES TRANPLANTES EN MEDIOS ESPECIALES SE LOGRA
COBNOCER LAS PROPIEDADES CULTIVABLES Y BIOQUIMICAS Y COMO RESULTADO LA IDENTIFICACION
ESPECIFICA

AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS AEROBICAS EN PLACA

A. AISLAMIENTO POR ESTRIAS
LA PLACA DE ESTRIAS SE UTILIZA FUNDAMENTALMENTE PARA AISLAR CULTIVOS PUROS DE MUESTRAS
QUE CONTIENEN UNA FLORA LISTA. EN ESTE AISLAMIENTO SE PUEDE ESTUDIAR LA MORFOLOGIA,
COLORACION DE LAS COLONIAS, SUCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS, ETC CONOCIMIENTO QUE
PERMITE EL DIAGNOSTICO Y LA IDENTIFICACION.
LAS SUPERFICIES DE LOS AGARES O MEDIOS DE CUTIVO DEBEN SER SUAVE Y HUMEDO PERO SIN EXCESO
DE HUMEDAD PORQUE PODRIA HABER SUPERPOSICION DE COLONIAS.
TODO EL PROCESO SE DEBE REALIZAR JUNTO A UN MECHERO PARA EVITAR LA CONTAMINACION.
PROCEDIMIENTO:
 FLAMEAR EL ASA DE SIEMBRA MANTENIENDOLA VERTICALMENTE EN EL MECHERO
 QUITAR EL TAPON DE ALGODÓN DEL TUBO QUE CONTENGA LA MUESTRA, TOMAR UNA
CANTIDAD LIGERA DEL INOCULO
 TAPAR EL TUBO CON LA MANO IZQUIERDA, SE TOMA LA PLACA PETRI LEVANTANDO
PARCIAMENTE LAS TAPAS
 DILUIR LA MUESTRA O INOCULO POR ESTRIAS EN ZIG – ZAG CON UNA SEPARACION DE UNA DE
OTRA DE 1-3 mm EL NUMERO DE ESTRIAS DEPENDE DE LA CANTIDAD DE MUESTRA SE DEBE
EVITAR ROMPER EL MUSLO.
SOBRE LAS PRIMERAS ESTRIAS SE DESARROLARAN MASAS MICROBIANAS INDIFERENCIALES, EN LAS
ESTRIAS INTERMEDIAS UN DESARROLLO CASI UNIFORME CON UNA DE OTRA COLONIA LIGERAMENTE
AISLADA Y EN LAS ULTIMAS ESTRIAS ESCASAS COLONIAS DE DESARROLLO NORMAL Y DIFERENCIAL.
ESTAS DEBEN SER ELEGIDAS PARA EL TRANSPLANTE Y OBTENCION DE CEPAS PURAS.
B. AISLAMIENTO POR DESIMINACION

 MEDIANTE UNA PIPETA PASTEUR ESTERIL SE TOMA UNA PEQUEÑA CANTIDAD DEL INOCULO
 EL INOCULO ES DEPOSITADO EN UN MARGEN DEL MEDIO DE CULTIVO O AGAR
 CON UNA VARILLA HORIZONTAL DE DIGASTRIL SE DISTRIBUYE EL INOCULO O MUESTRA POR
TODA LA SUPERFICIE DEL MEDIO EVITANDO PASAR DOS VECES POR EL MISMO PLANO.
LA TAPA DE LA PLACA DEBE LEVANATRSE SOLO LO NECESARIO PARA EVITAR CONTAMINACION

C. AISLAMIENTO POR DIFUSION (CONTEO EN PACA)

ESTA TECNICA SE APLICA DE PREFERENCIA PARA ANALISIS CUANTITATIVOS BACTERIANOS POR
EJEMPLO: PARA CONOCER EL NUMERO DE MICROORGANISMOS POR MILIMETRO ES UNA
MUESTRA PARA PREPARAR LAS DILUCIONES PUEDE UTILIZARSE AGUA AMORTIGUADA,
SOLUCION ESTERILIZADA DE CLORURO DE SODIO AL 0.95% O MEDIO DE CULTIVO ESTERILIZADO.
PROCEDIMIENTO:
 DE LA MUESTRA PROBLEMA CON UNA PIPETA SE SACA 1ml DE INOCULO Y SE LLEVA A UN TUBO
QUE CONTIENE 9ml DE DILUCION BASICA ESTE TUBO CORRESPONDE A LA DILUCION 1:10
 DE LA DILUCION 1:10 SE SACA 1ml Y SE LLEVA A OTRO TUBO CON 9ml DE DILLUCION ESTA
DIUCION CORRESPONDE A LA PROPORCION 1:100.
 DE LA DILUCION 1:10 SE SACA 1ml Y SE TRANSFIERE A OTRO TUBO CON 9ml DE DILLUCION
BASICA ESTE TUBO ES LA DILUCION 1:1000
 DE CADA TUBO DE DILUCION SE TRANSFIERE UN 1ml A UNA PLACA PETRI ESTERILIZADA
 VACIAR DE 15-18 ml DE AGAR FUNDIDO ESTERILIZADO Y ENFRIADO A 45°C EN CADA UNA DE LAS
PLACAS QUE CONTIENE LAS DILUCIONES.
 MEZCLAR EL MEDIO DE CULTIVO O AGAR CON EL INOCULO HACIENDO GIRAR LA PLACA PETRI
DEJAR QUE SOLIDIFIQUE EL MEDIO
 INCUBAR LAS PLACAS EN POSICION INVERTIDA DE 24-48 HORAS
ESCOGER UNA PLACA QUE CONTENGA DE 30-300 COLONIAS CUENTEN EL NUMERO DE COLONIAS.
MULTIPLIQUE E NUMERO DE COLONIAS POR LA DILUCION DE LA MUESTRA.
POR EJEMPLO:
SI LA PLACA ES DILUCION 1:10 MUESTRA 40 COLONIAS TENEMOS QUE MULTIPLICAR 40* 10 QUE
SERIA IGUAL A 400. EN CASO DE POBLACION BACTERIANA DEL ESPECIMEN ORIGINAL SERIA 400
MICROORGANISMOS POR MILILITROS Y SE REGISTRA COMO CUENTA ESTANDAR DE PLACA POR
MILILITRO.