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Programa de consulta al experto.

Coordinadora: Dra Graciela León de González


SEROLOGÍA DE GRUPOS SANGUÍNEOS:
GEL-CENTRIFUGACIÓN Y LAS TÉCNICAS
EN TUBO
PROFESOR INVITADO: Dr Alisson Dos Santos - Consultor de
Inmunohematología Belo Horizonte – MG – Brasil jalisson@uol.com.br

1. Introducción: como, posibles mutaciones genéticas que llevaran a cambios estruc-


turales de estos antígenos.
La medicina transfusional, así como, las terapias celulares, los tras-
plantes de órganos, empiezan a definir la compatibilidad principal- Discutiremos en este trabajo el fenómeno de aglutinación eritroci-
mente en bases funcionales, es decir a la base del resultado de una taria, una vez que las técnicas de serología de grupos sanguíneos
respuesta inmune. se basan en este fenómeno y las técnicas serológicas más utilizadas
Las interacciones inmunes capaces de inducir una respuesta inmu- para el estudio de los grupos sanguíneos y anticuerpos anti-eritro-
ne, ocurren en un contexto biológico complejo y dinámico donde la citarios, o sea, las pruebas hechas “en tubo” y la técnica de “Gel-
estructura no predice necesariamente la función. Con base en esta centrifugación”.
premisa, grupos de importantes profesionales en el mundo estu-
dian las interacciones y respuestas inmunes en todos sus aspectos, Si producimos ciertos cambios físico-químicos en suspensiones de
así como las posibilidades de control de estas respuestas (inmuno- partículas de coloides o de células como bacterias o glóbulos rojos,
modulación). estas suspensiones pierden la estabilidad y los coloides o células se
La comprensión de los mecanismos reguladores que determinan el aglutinan, formando grumos a los cuales llamamos “aglutinados”.
reconocimiento apropiado de los antígenos de grupos sanguíneos en
los niveles celulares y humorales del sistema inmunológico permitirá En inmunohematología eritrocitaria, el fenómeno de aglutinación
que la inmunohematología considere los aspectos funcionales ade- de los glóbulos rojos producido por la reacción entre anticuerpos y
más de los estructurales, en la compatibilidad transfusional. antígenos de grupos sanguíneos, constituye la base de casi todas las
técnicas aplicadas en la “serologia de los grupos sanguíneos”.
Hoy día, la immunohematología define la compatibilidad transfu-
sional con base en las estructuras, es decir que la compatibilidad La aglutinación de glóbulos rojos en suspensiones fisiológicas puede
es dependiente de los componentes estructurales de las células, los ocurrir por dos mecanismos básicos: específico y inespecífico.
anticuerpos y su interacción.
Las técnicas serológicas, actualmente disponibles, permiten deter- • Aglutinación específica:
minar a un muy alto grado de resolución la estructura de los antí- Sabemos que una suspensión de glóbulos rojos en solución salina
genos celulares, de los anticuerpos, las interacciones entre células y fisiológica (NaCl 0,85%) constituye un sistema estable, o sea, las cé-
las interacciones entre células y anticuerpos. lulas se mantienen a una cierta distancia unas de las otras. Esta
En casos muy particulares se puede mismo utilizar herramientas de estabilidad puede ser cambiada por la introducción de anticuerpos
biología molecular para determinación de los genes productores específicos que se fijarán en antígenos de membrana eritrocitaria,
de las proteínas portadoras de antígenos de grupos sanguíneos, así produciendo la aglutinación de estas células.

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De acuerdo con la “teoría de los puentes”, las moléculas de anticuer- 2-Procesos físico-químicos de la aglutinación
pos son capaces de fijarse sobre sitios antigénicos de células adyacen- (Potencial Zeta):
tes formando puentes entre ellas. La aglutinación sería observable,
tan luego la red así constituida, tenga una dimensión importante. Para la comprensión de los fenómenos de hemoaglutinación espe-
Veremos que esta concepción resulta de una simple analogía con los cífica y no específica, necesitamos de un modelo más complejo, con
fenómenos de precipitación. base en procesos físico-químicos, donde el factor más importante
La “teoría de los puentes” es un modelo simplista del fenómeno de a ser considerado es la distancia media que separa los glóbulos en
aglutinación de glóbulos rojos en suspensión y no permite compren- suspensión. Esta distancia puede ser disminuida por la adición de
der los ejemplos de aglutinaciones inespecíficas, o sea, en la ausencia anticuerpos u otras substancias al medio, hasta un punto crítico en
de anticuerpos. que la aglutinación ocurre.

• Aglutinación inespecífica: Los glóbulos rojos se comportan como partículas electronegativas en


estudios de migración electroforética. Los grupos carboxílicos de las
Este fenómeno, llamado de “panaglutinación”, corresponde a la sialo-glucoproteínas de la membrana eritrocitaria son los mayores
aglutinación de glóbulos rojos normales (no sensibilizados por an- responsables por esta electronegatividad.
ticuerpos) por substancias presentes en el medio de la suspensión,
como: detergentes, sílice coloidal, iones metálicos y macromoléculas En medio salino (NaCl al 0,85%), iones positivos de sodio (Na+) son
(albúmina, polibreno, ficol, dextran). atraídos para cerca de los glóbulos rojos, creando una doble camada
Algunas lectinas (fito-aglutininas) (anti-A1, anti-H) son capaces de de cargas positivas, que genera una fuerte repulsión interglobular.
reaccionar contra receptores presentes en los glóbulos rojos huma- La nube de iones positivos que involucra cada glóbulo, se vuelve me-
nos, produciendo un fenómeno que se acerca mucho de la agluti- nos densa mientras se aleja del glóbulo. La diferencia de potencial
nación por anticuerpos. eléctrico creada entre la doble camada de iones positivos (Na+) cerca
del glóbulo y el medio con iones de sodio y cloruro en equilibrio (neu-
tro), se llama “Potencial Zeta”. La fuerza de repulsión entre los glóbu-
los rojos, en medio salino, depende del valor del potencial zeta.

Considerando la carga eléctrica


del glóbulo rojo , la fuerza iónica
del medio de la suspensión ( ) y
la constante dieléctrica del medio
, Pollack desarrolló la siguiente
expresión del potencial zeta (Z):
“Z = f ”, o sea, la
diferencia del potencial zeta es
una función que varia directa-
mente con la electronegatividad
de la membrana eritrocitaria (
) e inversamente con la constante
dieléctrica del medio de suspensión
(D) y con la raíz cuadrada de su
fuerza iónica ( ).

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Desde el punto de vista físico-químico, la aglutinación ocurre por la agregación de los glóbulos rojos (aglutinados), cuando la distancia
media entre ellos se reduce hasta un valor mínimo. Esta distancia depende de los valores de dos fuerzas antagónicas: la “tensión interfacial”
(fuerza de cohesión), que tiende a agregar los glóbulos rojos y la “fuerza de repulsión”, debida a los escudos de cargas positivas creados
alrededor de los glóbulos (cargas iguales se repelen). En la ausencia de agentes aglutinantes, la fuerza de repulsión predomina y mantienen
la suspensión globular estable en medio salino.

La noción de “Potencial Zeta Crítico (Zc)” definida por Abram- membrana eritrocitaria:
son, muestra que para valores elevados del potencial Zeta (en Incluimos en esta categoría, los efectos debidos al tratamien-
valores absolutos), los glóbulos rojos no se aglutinan, incluso en to de los glóbulos rojos con enzimas proteolíticas, que sacan
la presencia de anticuerpos específicos. Disminuyéndose lenta- fragmentos de glucoproteínas de la membrana, reduciendo su
mente el potencial Zeta del sistema, se constata que la agluti- electronegatividad y al efecto de la fijación de anticuerpos sobre
nación ocurre en un valor determinado, que denominamos el la membrana eritrocitaria.
“Potencial Zeta Crítico”.
El potencial Zeta de un sistema puede • Cambios en la composición del medio:
ser cambiado de dos maneras: Los efectos debidos a los cambios de la fuerza iónica y de la
constante dieléctrica del sistema. La aglutinabilidad de un sis-
•Por la reducción de la carga eléctrica de la tema es más alta mientras más bajo sea el valor del potencial

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anti-RhD, se observa que los glóbulos rojos tienden a aglutinar-
se espontáneamente, al alcanzar el potencial Zeta crítico (Zc)
alrededor de -7 mV. Este valor para el potencial zeta crítico,
donde ocurre una aglutinación inespecífica de los glóbulos ro-
Zeta. Pollack así relacionó los términos de su ecuación: jos, no varia con diferentes suspensiones celulares y, debido a
esto, permite avaluar el valor de la “tensión interfacial” (fuerza
Esta ecuación nos muestra que el potencial Zeta puede bajar de cohesión) entre glóbulos rojos en suspensión salina (NaCl
y aumentar la aglutinabilidad del sistema, o hasta puede pro- al 0,85%).
mover la aglutinación de los glóbulos rojos en suspensión, si el
potencial zeta crítico (Zc) es alcanzado, en tres condiciones: Podemos rehacer los mismos ajustes anteriores, con la presen-
cia de anticuerpos anti-RhD de las clases IgG y IgM.
• si la carga eléctrica del glóbulo rojo ( ) disminuye. Suspensiones de glóbulos rojos RhD positivos fueron tratadas
• si la constante dieléctrica (D) del sistema aumenta. con anticuerpos anti-RhD de las clases IgG y IgM y, después
• si la fuerza iónica del medio (μ) aumenta. fragmentos de glucoproteínas de la membrana, reduciendo su
electronegatividad y al efecto de la fijación de anticuerpos sobre
Las condiciones mencionadas son los principales parámetros la membrana eritrocitaria.
utilizados para comprender las reacciones de aglutinación y los
métodos de producción de aglutinaciones artificiales utilizados Como el potencial Zeta crítico (Zc) de la suspensión de glóbu-
en los laboratorios de inmunohematología. los rojos sensibilizados por anticuerpos anti-RhD (IgM) es su-
perior en valor absoluto al de la propia suspensión en NaCl al
0,85%, estos anticuerpos son llamados “aglutinantes”.
Al contrario, el potencial Zeta crítico (Zc) en la presencia de
anticuerpos anti-RhD de clase IgG, que es inferior al de la sus-
pensión en NaCl 0,85%, no ocurre aglutinación de los glóbulos
rojos y estos anticuerpos son dichos “no aglutinantes”.

La ventaja de las moléculas de IgM sobre las de IgG está ligada


a su peso molecular y a su estructura pentamérica mejor adap-
tada a la función aglutinante.

4-Influencia de los antígenos en la aglutinación de los


glóbulos rojos:

3-El potencial zeta crítico (Zc) y las clases de


anticuerpos:
Pollack explicó en bases físico-químicas las diferencias de com-
portamiento de los anticuerpos de clase IgG y de clase IgM en
la aglutinación de los glóbulos rojos, cuando reaccionan con
antígenos de grupos sanguíneos.
Se estima en -15 mV (mV= mili-volts), el potencial zeta de una
suspensión de glóbulos rojos RhD positivos en NaCl al 0,85%.
Por el ajuste de la fuerza iónica (μ) y/o de la constante dieléctri- La aglutinación de los glóbulos rojos, en una suspensión, no
ca (D) del medio de la suspensión, se puede hacer variar el va- está relacionada simplemente con las clases de los anticuerpos,
lor del potencial Zeta del sistema y en ausencia de anticuerpos

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sino también con el número y ubicación de los antígenos. Los anticuerpos dichos “no aglutinantes” se fijan sobre las
membranas de los glóbulos rojos sin producir aglutinación. Por
Anticuerpos anti-A de clase IgM, por ejemplo, aglutinan gló- esto, la visualización de las reacciones de estos anticuerpos con
bulos rojos A1 o A2 en suspensión de NaCl al 0,85%, pero no sus respectivos antígenos, depende de artificios técnicos para
aglutinan glóbulos Am. De la misma manera, anticuerpos anti- producción de aglutinación.
RhD, de clase IgG, no aglutinan glóbulos RhD positivos en sus-
pensión de NaCl al 0,85%, pero aglutinan glóbulos del fenotipo En inmunohematología, estas técnicas son esenciales en la de-
D--/D-- (variante rara del sistema Rh). tección e identificación de alo-anticuerpos anti-eritrocitarios,
en el fenotipaje del glóbulo rojo, en el diagnóstico de las ane-
El número de antígenos es responsable por las diferencias de mias hemolíticas auto-inmunes (AHAI) y en el diagnóstico de
comportamientos de los anticuerpos anti-A y anti-RhD en las enfermedades hemolíticas del recién-nacido (EHRN).
presencia de glóbulos rojos Am y D--/D--, respectivamente.
Los glóbulos Am poseen un número de sitios antigénicos “A” Discutiremos las técnicas más importantes bajo la ecuación de
alrededor de 1.000 receptores por membrana, mientras que Pollack para el potencial zeta:
los glóbulos A1 poseen alrededor de 1.000.000. Los fenotipos
RhD más comunes poseen entre 10.000 hasta 30.000 sitios por •Tratamiento de los glóbulos rojos por enzimas
membrana, mientras que el fenotipo D--/D-- posee alrededor proteolíticas:
de 100.000.

Existe una relación clara entre aglutinabilidad de los glóbulos


rojos y el número de sitios antigénicos presentes en la mem-
brana. Existe un número crítico de antígenos para producir la
aglutinación, cuyo
valor depende del sistema de grupos sanguíneos estudiado y de
las condiciones experimentales.
En el sistema ABO, el número crítico de antígenos “A” es alre-
dedor de 2 hasta 3.000 receptores por célula, lo que explica el
hecho de no producirse aglutinaciones directas con los glóbu-
los “Am”. La tripsina, la papaína, la bromelina y la ficina son las principa-
les enzimas proteolíticas utilizadas en las técnicas enzimáticas
La ubicación de los antígenos en la membrana del glóbulo rojo de aglutinación artificial.
es otro factor importante en la reacción de aglutinación. Los Estas enzimas son capaces de sacar de la membrana eritroci-
antígenos pueden estar total o parcialmente involucrados (crip- taria, fragmentos peptídicos de glucoproteínas de membrana
to-antígenos) e inaccesibles a los anticuerpos. El ejemplo más conteniendo moléculas de ácido siálico (electronegativas), dis-
conocido es el antígeno “T” que, normalmente, no es reactivo minuyendo la carga negativa de los glóbulos rojos.
en glóbulos íntegros, pero que después de la acción de enzimas Como consecuencia de la disminución de la electronegatividad
proteolíticas bacterianas (pacientes con septicemia), quedan de los glóbulos, los escudos de iones positivos (Na+), atraídos
accesibles y poliaglutinables, una vez que los sueros humanos para cerca de las membranas eritrocitarias disminuyen y el va-
contienen auto-anticuerpos anti-T. lor de la diferencia de potencial eléctrico (potencial zeta) entre
estos escudos y el medio de suspensión en equilibrio (neutro),
5- Técnicas de producción artificial de la aglutinación también disminuye. Para valores más bajos del potencial zeta,
de glóbulos rojos: las suspensiones de glóbulos se quedan más aglutinables. Esto
está de acuerdo con el modelo electrostático de Pollack, donde

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el potencial Zeta (Z) es directamente proporcional a la electro- los glóbulos rojos, aumenta su constante dieléctrica (D). Es-
negatividad del glóbulo rojo (γ). tas moléculas poseen una extremidad positiva (amínica) y otra
negativa (carboxílica) y se polarizan en el campo eléctrico de
Como ejemplo, glóbulos rojos RhD positivos tratados por las los glóbulos rojos en suspensión. Una vez que son pesadas, son
enzimas proteolíticas citadas, pueden ser aglutinadas, en me- atraídas para cerca de los glóbulos neutralizando sus cargas ne-
dio salino, por anticuerpos anti-RhD de clase IgG (no agluti- gativas y promoviendo la dispersión de iones positivos (Na+)
nantes). cerca de ellos. La disminución de este escudo de cargas posi-
tivas, baja el valor del potencial zeta y disminuye la fuerza de
El cuadro arriba, muestra los efectos de la reducción del poten- repulsión interglobular. Esto está de acuerdo con la ecuación
cial zeta, producidos por las enzimas proteolíticas más utiliza- de Pollack, donde el potencial Zeta (Z) es inversamente propor-
das en los laboratorios de inmunohematología. cional a la constante dieléctrica (D) del medio de suspensión.
La albúmina (al 20 – 30%) y el polietilenoglicol (PEG) son los
• Adición de substancias macro-moleculares: medios macromoleculares más utilizados y su eficacia depende
del contenido de polímeros.
Pollack fue el primero en ofrecer un modelo físico-químico de
la aglutinación en medio macromolecular, o sea, del rol de la Reacciones falsas-positivas pueden ser producidas por el pro-
constante dieléctrica (D) del medio de suspensión. pio medio macromolecular, cuando un exceso de polímeros
Macromoléculas hidrosolubles como albúmina, PVP, dextran, aumenta la constante dieléctrica (D) hasta un punto donde el
ficol, PEG, etc, cuando añadidas al medio de suspensión de potencial Zeta crítico (Zc) es alcanzado y el fenómeno de la

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aglutinación ocurre espontáneamente, aún en la ausencia de de una serie de lavados de los glóbulos rojos con salina (NaCl al
anticuerpos (panaglutinación). 0,85%) que es un medio de fuerza iónica normal.
Las reacciones falsas-positivas pueden ser evidenciadas por la
utilización de sueros-control producidos por el mismo fabri- En la técnica de “Gel-centrifugación”, las reacciones de LISS/
cante y conteniendo el mismo medio macromolecular de los Coombs no presentan la etapa de lavados de los glóbulos rojos
sueros de clasificación sanguínea. El uso de estos controles es después de la etapa de incubación. En estos casos, la solución
obligatorio por las normas técnicas vigentes. de baja fuerza iónica es cambiada (LISS mod.) por un peque-
ño aumento de su constante dieléctrica (D), para compensar
• Cambio de la fuerza iónica del medio: el efecto de la disminución de la fuerza iónica del medio de la
suspensión (μ) sobre el potencial zeta (Z).
Una concentración muy elevada de ciertos cationes (Cr3+, Observen que se puede trabajar en más de una variante de la
Al3+, Fe3+) puede producir una “panaglutinación” de una sus- ecuación del potencial zeta (Z) de Pollack.
pensión de glóbulos rojos no sensibilizados.
Los cationes introducidos en el medio cambia poco la nube ió- • Prueba de la antiglobulina humana
nica alrededor de los glóbulos, una vez que la densidad de esta o prueba de Coombs:
nube de cationes depende de la carga negativa de los glóbulos.
Sin embargo, la diferencia de potencial (potencial zeta) dismi- La prueba de la antiglobulina humana o prueba de Coombs re-
nuye entre los escudos de cargas positivas alrededor de los gló- presenta la técnica más importante de aglutinación artificial en
bulos rojos y el medio de suspensión que se queda más iónico inmunohematología.
por el exceso de cationes, resultando en una disminución de la Por un procedimiento inmunológico, esta reacción nos permi-
fuerza de repulsión interglobular. te revelar la presencia de anticuerpos “no aglutinantes” en la
membrana eritrocitaria. Decimos “procedimiento inmunológi-
Esto está en acuerdo con la ecuación de Pollack, donde un au- co”, porque los sueros de Coombs son compuestos de anticuer-
mento de la fuerza iónica (μ) lleva a una disminución del poten- pos contra anticuerpos humanos. Son producidos por la inyec-
cial Zeta de la suspensión de glóbulos rojos en NaCl al 0,85%, lo ción de cadenas leves y pesadas de IgGs humanas en animales
que favorece la aparición del fenómeno de aglutinación. (conejos u ovejas), que producen anticuerpos contra las fraccio-
nes “Fc” de las inmunoglobulinas humanas.
La fuerza iónica desempeña un rol importante en el equilibrio Estos anticuerpos pueden reconocer cualquier inmunoglobuli-
primario de la reacción antígeno-anticuerpo, sendo su efecto na humana, por esto en la ejecución de la prueba de Coombs es
manifestado bajo dos aspectos antagónicos. Si un aumento de necesario lavar los glóbulos rojos, después de la etapa de sensi-
“μ” lleva a un aumento de la aglutinabilidad (según la ecuación bilización (incubación) y antes de se añadir el suero de Coombs,
de Pollack), en la práctica, concentraciones iónicas elevadas con el propósito de se remover los anticuerpos libres. Los gló-
compiten con los anticuerpos e inhiben su fijación inicial sobre bulos rojos quedan involucrados solamente con los anticuerpos
los antígenos, llevando a un efecto inverso al deseado. que se ligaron específicamente con antígenos de membrana.
En la técnica de “Gel-centrifugación”, la separación de los an-
Técnicamente, en reacciones hechas en dos tiempos (LISS/Co- ticuerpos libres de los fijados sobre antígenos de membrana,
ombs), la etapa de sensibilización ocurre en medio isotónico de ocurre por un gradiente de centrifugación.
baja fuerza iónica (LISS), aumentando la fijación inicial de los
anticuerpos sobre los antígenos de membrana correspondien- Cuando añadimos el suero de Coombs, los anticuerpos antiglo-
tes (más alta sensibilidad de la reacción), además de reducir el bulinas humanas (AGH), se ligan en las fracciones “Fc” de los
tiempo de incubación. La etapa de revelación de los anticuerpos anticuerpos anti-eritrocitarios fijados en la membrana eritroci-
fijados sobre la membrana eritrocitaria, por la adición de la an- taria. Considerando su estructura tridimensional, observamos
tiglobulina humana (suero de Coombs), es ejecutada después que cada fracción “FC” de un anticuerpo fijado en la membrana

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molítica del Recién-Nacido (EHRN), de la Anemia He-
molítica Auto-Inmune (AHAI), de la hemólisis inducida
por drogas y en el diagnóstico de las reacciones hemolíti-
cas pos transfusionales.
La prueba de Coombs indirecto (PCI) representa la re-
acción-clave y de más grandes posibilidades en inmuno-
hematología y nos permite ejecutar una serie de pruebas
como: investigación y identificación de anticuerpos anti-
eritrocitarios, pruebas de compatibilidad pre-transfusio-
nales y determinación de antígenos eritrocitarios que no
pueden ser evidenciados por aglutinación directa (ejem-
plos: variantes débiles de RhD, antígenos Duffy, Kidd,
Kell, etc).
La sensibilidad de la prueba de Coombs indirecto (PCI)
puede ser aumentada por procedimientos que cambian
la primera etapa de la reacción, o sea, de la fijación de
los anticuerpos durante la incubación. Los más utilizados
son: adición de albúmina al 22% (BSA) o polietilenogli-
eritrocitaria, puede reaccionar con diversas moléculas de an-
col (PEG) al medio, uso de medios de baja fuerza iónica (LISS)
tiglobulinas humanas (AGH). De esta manera se queda más
y la utilización de glóbulos rojos ya tratados por enzimas pro-
grande y más pesado.
teolíticas.

Como se puede observar en el gráfico del experimento arriba,


La adición de albúmina o polietilenoglicol (PEG) aumenta la
la capacidad de aglutinación de los anticuerpos de la clase IgG
constante dieléctrica (D) del medio de suspensión y baja el valor
ligados a la AGH es similar a de los de clase IgM que son natu-
del potencial zeta (Z), favoreciendo la aglutinación de los glóbu-
ralmente “aglutinantes”.
los rojos. Favorece también, la fijación inicial de los anticuerpos
a la membrana eritrocitaria por la disipación de iones positivos
Los sueros de Coombs pueden ser “poliespecíficos o monoes-
cerca de la membrana, sin embargo este procedimiento es me-
pecíficos”. Los llamados poliespecíficos contienen, además de
nos eficaz que la disminución de la fuerza iónica del medio.
los anticuerpos contra fracciones “Fc” de las inmunoglobulinas
humanas, anticuerpos contra la fracción C3d del Complemento
El uso de un medio isotónico de baja fuerza iónica (LISS), en
que puede estar presente sensibilizando la membrana eritro-
la etapa de sensibilización de los glóbulos rojos, aumenta con-
citaria, en la presencia o ausencia de anticuerpos fijados. Los
siderablemente la velocidad de fijación y la cantidad de anti-
sueros monoespecíficos contienen anticuerpos contra solamen-
cuerpos fijados sobre la membrana eritrocitaria. Este hecho
te un tipo de inmunoglobulina (IgG, IgM o IgA) o contra frac-
nos permite aumentar la sensibilidad y disminuir el tiempo de
ciones del Complemento (C3c o C3d). Los anticuerpos contra la
incubación de la prueba.
fracción C4 no deben estar presentes en los sueros poliespecífi-
cos, para evitarse reacciones cruzadas con antígenos del grupo
El uso de glóbulos rojos pre-tratados con enzimas proteolíticas
sanguíneo Chido/Rodgers (ISBT= 017- CH/RG).
(tripsina o papaína) en prueba de Coombs indirecto (PCI), es
La prueba de Coombs puede ser realizada de dos maneras: Co-
un procedimiento indicado para mejorar la detección de anti-
ombs directo e indirecto.
cuerpos anti-Kidd.
Por la prueba de Coombs directo (PCD), demostramos glóbulos
rojos sensibilizados in vivo por anticuerpos y/o fracciones del
complemento. Se usa en el diagnóstico de la Enfermedad He-

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6- Otros factores que influencian la reacción de aglutina- Las pruebas serológicas “en tubo” representaran un avance
ción de los glóbulos rojos: técnico en relación a las pruebas en láminas y placas de opa-
lina. Además, ampliaron la gama de pruebas realizadas en el
La temperatura de la reacción y el pH del medio de suspensión, laboratorio de inmunohematología y siguen utilizándose hasta
influencian la fijación primaria de los anticuerpos sobre sus hoy día en la mayoría de los laboratorios clínicos y bancos de
antígenos y sobre el fenómeno de aglutinación, ya que los dos sangre.
aspectos de la reacción no son disociables.
Como se ha discutido anteriormente, distinguimos dos tem- Todavía, la ejecución de esta técnica presenta aspectos básicos
peraturas de reacción: un primer grupo presenta reacciones de no estandarización y subjetividad que pueden comprometer
óptimas en bajas temperaturas y un segundo grupo presenta la calidad de los resultados:
reacciones óptimas en temperaturas más elevadas.
•Variación de los volúmenes de reactivos pipetados y de la con-
Los anticuerpos activos en temperaturas bajas (4oC), también centración de las suspensiones celulares llevan a una variación
llamados “anticuerpos fríos” corresponden, principalmente, a de la relación antígeno-anticuerpo de una prueba a otra y de un
las especificidades anti-I, -H, -A, -B, -AB, -Le, -M, -N e –P1. Se servicio a otro.
trata, normalmente, de anticuerpos naturales regulares o irre-
gulares. •Los lavados ejecutados en las pruebas de Coombs, si demasia-
Los anticuerpos dichos “inmunes” reaccionan mejor en 37oC y dos producen elución de anticuerpos disminuyendo la sensibi-
son, también, llamados “anticuerpos calientes”. Este es el caso, lidad de la prueba. Si insuficientes producen resultados falsos-
por ejemplo, de los anticuerpos de los sistemas Rh, Kell, Duffy, negativos, por la neutralización de la antiglobulina humana
Kidd, MNS, Diego, etc. (suero de Coombs) por anticuerpos libres non removidos.

Los cambios de pH entre 6,0 y 8,0 tienen poca o ninguna in- •La centrifugación de los tubos en alta rotación antes de la in-
fluencia sobre la reactividad de los anticuerpos. Fuera de estos terpretación de las pruebas pueden producir resultados falsos-
límites se puede observar hemólisis de los glóbulos rojos para positivos.
valores extremos del pH, o una inhibición de la aglutinación
debida a una disminución importante de la constante de aso- •La interpretación de los resultados varía de un profesional a
ciación de los anticuerpos. otro, principalmente si las reacciones son débiles.

7-Las pruebas serológicas en tubo y la gel-centrifugación •Los profesionales necesitan ser muy bien entrenados para evitar
para estudios inmunohematológicos: errores advenidos de la subjetividad de las pruebas “en tubo”.

Basadas en el fenómeno de aglutinación que estudiamos arriba, La técnica llamada “gel-centrifugación” desarrollada por el Dr.
las pruebas serológicas “en tubo” y “gel-centrifugación” repre- Yves Lapierre (Lion-Francia) se utiliza de una matriz de gel
sentan las técnicas más utilizadas en el laboratorio de inmuno- (sephadex) en microtubos para atrapar aglutinatos (glóbulos
hematología. rojos aglutinados) producidos por la reacción entre antígenos
de la membrana eritrocitaria y anticuerpos anti-eritrocitarios,
Por las dos técnicas se puede realizar todas las pruebas seroló- después de una centrifugación en baja rotación.
gicas de control inmunohematológico de las transfusiones san-
guíneas y de la relación feto-materna, o sea, determinación de Existen 3 formulaciones básicas del gel:
antígenos de grupos sanguíneos, investigación y identificación
de anticuerpos anti-eritrocitarios. -Gel neutro: solo contiene la matriz de gel-sephadex pero sin
adición de anticuerpos, para detección de aglutinados produci-

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8-Conclusiones:

Las técnicas serológicas para estudios de los grupos sanguíneos


y anticuerpos anti-eritrocitarios “en tubo” y “gel-centrifuga-
ción” hacen parte de un desarrollo histórico en la búsqueda de
una estandarización de procesos en el laboratorio de inmuno-
hematología, facilitando la implementación de programas de
control de la calidad.

El conocimiento de los procesos físico-químicos involucrados


con la hemoaglutinación específica y inespecífica son extrema-
dos por anticuerpos aglutinantes. Utilizados en la prueba in- mente importantes para que los profesionales inmunohema-
versa ABO, en la investigación de anticuerpos fríos y pruebas tólogos sean capaces de comprender las pruebas que ejecutan
enzimáticas. todos los días. De esta manera, se quedan más críticos y pueden
-Gel específico: es una mezcla de gel-sephadex con un anticuer- evitar errores técnicos, principalmente cuando se utiliza técni-
po contra un antígeno de grupo sanguíneo. Se utiliza para de- cas subjetivas que dependen mucho más de la capacidad técni-
terminación de antígenos de grupos sanguíneos. ca de los profesionales.
-Gel antiglobulina: es una mezcla de gel-sephadex con antiglo-
bulinas humanas y/o fracciones del complemento. Se utiliza en 9-Referencias:
las pruebas de Coombs para investigación e identificación de
anticuerpos anti-eritrocitarios incapaces de producir aglutina- - M.Goudemand, Ch.Salmon; Immuno hématologie et Immu-
ciones directas. nogénétique
Paris: Flammarion Médecine Sciences
La “gel-centrifugación” representa un avance técnico sobre la -Ph.Rouger, Ch.Salmon; La Pratique de l’agglutination des
técnica “en tubos” por algunas razones fundamentales: érythrocytes et le test de Coombs
Paris: Masson,éd.
•Estandarización de procedimientos, reacciones e interpreta- -Ph.Rouger, Ch.Salmon; La Pratique des Groupes et Groupages
ciones de resultados. Sin aspectos subjetivos. Erythrocytaires
Paris: Masson,éd.
•La prueba de Coombs sin lavados disminuye las posibilida- -Ph.Rouger, Ch.Salmon; La Pratique des Allo et Auto anticorps
des de errores técnicos, aumenta la sensibilidad de la prueba y Anti Erythrocytes
permite el procesamiento de una grande cantidad de muestras Paris: Masson,éd.
simultáneamente. -B.Genetet, G.Andreu,J.M.Bidet; Aide Mémoire de Transfusion
Sanguine
•Utiliza bajos volúmenes de muestras (micro-técnica). Paris: Flammarion Médecine Sciences

•Las reacciones son estables permitiendo lecturas posteriores y -Technical Manual of AABB;
por diferentes profesionales. Además las reacciones pueden ser USA: Bethesda, Maryland (2006)
fotocopiadas o leídas por lectores automáticos. José Alisson dos Santos
Consultor de Inmunohematología
•Formación técnica muy simplificada. El entrenamiento de Belo Horizonte – MG - Brasil
profesionales es rápido y seguro.

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