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Profesor Patrocinante

Ing. Marcia Costa Lobo


Instituto de Ciencia y Tecnología de los
Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias

Profesor Co-Patrocinante
Dr. Alejandro Reyes Pinto
Instituto de Microbiología y Bioquímica
Facultad de Ciencias

OBTENCION DE UN EXTRACTO DE FITASA CON


ACTIVIDAD A BAJA TEMPERATURA, MEDIANTE
FERMENTACIÓN EN SUSTRATO SÓLIDO.

Tesis de Grado presentada como parte de


los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico

FRANCISCO JAVIER PALMA ALVAREZ

VALDIVIA – CHILE
2013
II

AGRADECIMIENTOS

Debo agradecer a varias personas en particular, que aportaron acciones que, a

pesar de todas las adversidades, me ayudaron a llegar a la meta de este largo proceso.

En primer lugar agradezco a mis padres por apoyarme incondicionalmente en

todo y darme ánimos siempre.

Agradezco a Paola Andrea Romero Ojeda por ser el apoyo moral fundamental

durante el año 2012.

A la señora Rosa María Carrasco Fuentes por todos los consejos y gratas

conversaciones.

Al Profesor Patricio Godoy Martínez por asesorarme al momento de identificar el

hongo.

A la profesora Marcia Costa Lobo por aceptarme como tesista y especialmente

por su disponibilidad y paciencia.

A los profesores Mariela Horzella Rademacher y Alejandro Reyes Pinto por ser

mis profesores informantes y por sus consejos.

A todas las personas que de alguna u otra forma colaboraron a mi estabilidad

anímica durante este largo proceso.

Finalmente agradezco a la Universidad Austral de Chile.

Esta tesis fue financiada por el proyecto DID S-2012-46 y por el proyecto Fondef
CA12i10022
III

INDICE GENERAL

Capítulo Página

1 RESUMEN 1

1.1 ABTRACT 2

2 INTRODUCCIÓN 3

2.1 Proteína vegetal en la industria pecuaria y acuícola. 3

2.2 Proteínas vegetales. 4

2.3 Ácido fítico. 8

2.4 Fitasas. 10

2.5 Actividad fitásica y métodos de detección. 15

2.6 Fermentación en sustrato sólido (SSF) y sumergido (SmF). 16

2.7 Fuentes de Fitasas. 17

2.8 Fitasas en acuicultura. 20

2.9 Hipótesis 24

3 MATERIALES Y METODOS 25

3.1 Reactivos químicos 25

3.2 Microorganismos 26

3.3 Medios de cultivo 26

3.4 Equipos e implementos 26

3.5 Selección de Microorganismo 27


IV

3.5.1 Screening 27

3.5.2. Confirmación mejor cepa y mejor pH de crecimiento 27

3.6 Método colorimétrico de detección de actividad fitásica 27

3.6.1 Soluciones y reactivos. 30

3.6.2 Curva de calibración 30

3.6.3 Ensayos de actividad en muestras 30

3.6.4 Cálculo de actividad enzimática en muestras 33

3.7 Cuantificación de proteínas. 35

3.8 Fermentación Sustrato Sólido (SSF) 35

3.8.1 Preparación de inóculos 35

3.8.2 Evolución de producción de fitasa en el tiempo. 35

3.8.3 Cultivo de Hongo código H3 en canola para máxima producción 38

de fitasa.

3.8.4 Preparación de extractos enzimáticos 38

3.9 Semipurificación y concentración de extractos enzimáticos. 39

3.9.1 Determinación de actividad fitásica de extractos enzimáticos 39

ultrafiltrados. 39

3.9.2 Caracterización de la actividad enzimática respecto a la

temperatura. 39

3.10 Identificación de microorganismo seleccionado. 39

3.10.1 Microcultivo para observación de estructura micótica. 40

3.10.2 Pruebas de asimilación de fuentes de Carbono (Auxanograma)

y Nitrógeno. 40
V

3.10.2.1 Asimilación de urea. 40

3.10.2.2 Asimilación de D-Xilosa y Celobiosa (auxonograma).

4 RESULTADOS 43

4.1 Selección de cepas. 43

4.1.1 Screening. 43

4.1.2 Validación de mejor cepa y mejor pH de crecimiento. 45

4.2 Evolución de producción de actividad fitásica en el tiempo. 47

4.3 Semipurificación y concentración extractos enzimáticos. 50

4.3.1 Ultrafiltración y Diafiltración de extractos enzimáticos 50

provenientes del cultivo número 1.

4.3.2 Ultrafiltración y Diafiltraciones de extractos enzimáticos 53

provenientes del cultivo número 2.

4.4 Caracterización de actividad enzimática respecto de la 56

temperatura.

4.5 Identificación del hongo código HNG-3 seleccionado. 59

4.5.1 Observación de morfología. 59

4.5.2 Asimilación de fuentes de nitrógeno y carbono específicas. 59

5 DISCUSIÓN 61

5.1 Discusión de los resultados. 61

5.1.1 Curvas de crecimiento. 61

5.1.2 Análisis de curvas de evolución de producción de fitasa y 62


VI

fermentación en sustrato sólido (SSF).

5.1.3 Análisis de semipurificación y concentración de extractos 63

ultrafiltrados.

5.1.4 Análisis de la caracterización de la actividad enzimática 66

respecto a la temperatura.

5.1.5 Análisis de la identificación del microorganismo. 67

5.2 Conclusiones. 68

6 BIBLIOGRAFÍA 69

7 ANEXOS 85
VII

INDICE DE FIGURAS Página

Figura 1: Estructura molecular de ácido fítico. 9

Figura 2: Esquema de hidrolisis del fitato a inositol e intermediarios, 11

por fitasa.

Figura 3: Estructura molecular de fitasas tipo: (a) HAP; (b) BPP y (c) 13

PAP.

Figura 4: Grafico curva de calibración para determinación de Pi liberado. 32

Figura 5: Esquema de preparado de estrías de APD. 41

Figura 6: Esquema de distribución de discos de D-Xilosa y Celobiosa. 42

Figura 7: Curvas de crecimiento (screening). 44

Figura 8: Curvas de crecimiento de cepas con mejores parámetros 46

de crecimiento en medio selectivo F2.

Figura 9: Evolución de actividad total de fitasa durante 6 días. 49

Figura 10: Ultrafiltraciónes y Diafiltraciones de extractos crudos a través de 52

cartuchos de 100kDa y 30kDa, cultivo 1.

Figura 11: Ultrafiltraciónes y Diafiltraciones de extractos crudos a través de 55

cartuchos de 100kDa y 30kDa, cultivo 2.

Figura 12: Caracterización de la actividad enzimática respecto a 58

temperatura.

Figura 13: Morfología y bioquímica de Geotrichum candidum. 60


VIII

INDICE DE TABLAS Página

Tabla I: Fosforo total y fosforo fítico en ingredientes comunes usados en 6

las dietas de los peces a nivel mundial.

Tabla II: Orden de inoculación de hongos para screening (placa ELISA). 28

Tabla III: Orden inoculación de hongos seleccionados para confirmación 29

de mejor cepa y mejor pH de crecimiento (placa ELISA).

Tabla IV: Preparación curva de calibración para determinación de Pi 31

liberado.

Tabla V: Protocolo para curva de calibración o muestras (placa ELISA). 36

Tabla VI: Valores curva de calibración para cuantificación de proteínas 37

mediante el método de Bradford (para placa ELISA).

Tabla VII: Valores obtenidos en la evolución de la producción de actividad 48

neta de fitasa durante 6 días.

Tabla VIII: Valores de Actividad de Ultrafiltrados y Diafiltrados a través de 51

cartuchos de 100kDa y 30kDa, del cultivo número 1.

Tabla IX: Valores de Actividad de Ultrafiltrados y Diafiltrados a través de 54

cilindros de 100kDa y 30kDa, del cultivo número 2.

Tabla X: Valores de Actividad enzimática del extracto concentrado 57

R2 (30kDa) del cultivo número 1, frente a diferentes temperaturas.


IX

INDICE ANEXOS Página

7.1 Preparación de reactivos para análisis de actividad enzimática. 85

7.2 Medios de cultivo sintéticos usados para esta tesis. 86

7.3 Reacción negativa (izquierda) y reacción positiva (derecha). 87

7.4 Fotografía 1: Curva de calibración para determinar Pi libre. 88

7.5 Fotografía 2: Cultivo líquido de Geotrichum candidum. 89

7.6 Evolución de producción de enzima, fotos de cultivo Geotrichum 90

candidum en canola.

7.7 Cultivo SSF de Geotrichum candidum en torta de canola. 91

7.8 Extracto crudo antes de Ultrafiltrar. 92

7.9 Proceso de ultrafiltración a través de cartuchos de retención de 93

partículas de 100kDa y 30kDa.


X

LISTA DE ABREVIATURAS

AF/PA Ácido Fítico/Phytic Acid.

HAP Histidine Acidic Phosphatase, fosfatasas acido-histidinica.

BPP Beta-Propeler Phytase, fitasa de hélice enrollada.

PAP Purple Acidic Phosphatase, fosfatasa ácida purpura.

PTP Protein Tyrosin Phosphatases, proteínas fosfatasas tirosínicas.

SSF Solid Substrate Fermentation, fermentación en sustrato sólido.

SmF Submerged Fermentation, Fermentación en sustrato sólido.

CRS Color Reagent Solutión, solución reactiva colorimétrica.

Ammo Ammonium molibdate; 5%, Molibdato de amonio 5%.

Rpm Revolutions per minute, revoluciones por minuto.

F1 Medio fítico selectivo número 1.

F2 Medio fitíco selectico número 2.

ECM Extracto crudo microfiltrado.

R(100kDa) Retenido del proceso de ultrafiltración a través de cartuchos de 100kDa

F1(100kDa) Filtrado del proceso de ultrafiltración a través de cartuchos de 100kDa.

D1(100kDa): Diafiltrado del proceso de lavado a través de cartuchos de 100kDa.

R(30kDa): Retenido del proceso de ultrafiltración a través de cartuchos de 30kDa.

F(30kDa): Filtrado del proceso de ultrafiltración a través de cartuchos de 30kDa.

D(30kDa): Diafiltrado del proceso de lavado a través de cartuchos de 30kDa.


1

1. RESUMEN

El uso de proteína vegetal en la alimentación de animales monogástricos,

especialmente peces, ha tenido consecuencias graves para éstos y su ambiente. La

presencia de altas cantidades de ácido fítico (AF) en estas materias primas ha traído

problemas económicos y contaminación ambiental, pues al no ser bioabsorbido por

los peces, produce problemas de mal nutrición, y al excretarse al ambiente éste

eutrofiza las zonas de crianza, favoreciendo la proliferación de especies de algas y

microorganismo no deseados. Para corregir el problema, se ha intentado usar fitasas

exógenas provenientes de microorganismos para biodisponibilizar el fósforo fítico

para los peces, encontrándose grandes obstáculos para ello. Estas fitasas sólo

funcionan de forma óptima a temperaturas de entre 40-60 °C, muy por sobre las

presentes en los peces y zonas de crianza, anulándose así casi por completo la

actividad fitásica. El objetivo de la presente tesis fue seleccionar y cultivar un hongo

que potencialmente sintetizara una fitasa extracelular con alta actividad a bajas

temperatura (~14°C). Los resultados obtenidos indican que al cultivar el hongo

identificado como Geotrichum candidum, es factible obtener actividad de fitasa en

extractos enzimaticos. Además, se logró realizar satisfactoriamente procesos de

ultrafiltración de estos extractos, lograndose una mayor concentración de la actividad

enzimática entre los rangos de 100kDa y 30kDa. También fue posible caracterizar la

actividad de la fitasa, respecto a la temperatura, obteniéndose que a 45°C se logra

una mayor actividad enzimática, y que a 14°C la actividad sólo representa un 15,8%

de actividad relativa a la de 45°C.


2

1.1 SUMMARY

The use of plant feed-stuff in monogastric animal feeding, especially fish, has

had serious consequences for them and their environment. The presence of high

amounts of phytic acid (PA) in this material has brought economic and environmental

pollution problems. Not being bio-assimilated by fish, PA produces malnutrition

problems and eutrophication of the environment when excreted, causing a high

proliferation of unwanted algae and microorganism. To correct the problem, it has been

tried to use exogenous phytase from microorganisms, to make phytic phosphorus

assimilable by fishes, it has been great obstacles to do so. These phytases work best at

temperatures of about 40-60 °C, above than those found in fish and breeding areas, so

the activity of phytase is very low. The aim of this work was to select and cultivate a

microorganism that potentially synthesizes an extracellular phytase, with high activity at

low temperature (~ 14 °C). The results show that, by cultivating the fungus identified as

Geotrichum candidum, it is feasible to obtain phytase activity in enzymatic extracts.

Furthermore, the ultrafiltration processes of these extracts were satisfactory. There is a

higher concentration of enzyme activity between the ranges of 10 0-30kDa. Also,

characterizing the phytase activity by temperature shows a maximum yield at 45 °C,

and the activity at 14 °C, represents just a 15.8% of relative activity of 45 °C.
3

2. INTRODUCCION

2.1 Proteína vegetal en la industria pecuaria y acuícola.

El uso de derivados o desechos de las industrias oleaginosas y cerealeras en la

alimentación de ganado bovino, porcino, avícola y otros, no es nuevo, y surgió por la

necesidad de obtener alimentos a bajo costo y de alta calidad nutritiva. Pero el uso de

estos materiales se limitaba sólo para animales rumiantes, debido a la presencia del

ácido fítico (AF) o fitato (molécula no digerible por monogástricos) presente en altas

cantidades en tales insumos. En vegetales el ácido fítico cumple función de almacenaje

de hasta un 90% del fósforo, especialmente en semillas (Hernández et al., 2005).

En cerdos y pollos, debido a las propiedades químicas del AF, su alta ingesta y

falta de fósforo en las dietas, produjo problemas de mal crecimiento, desmineralización,

mal formaciones, debilitaciones del sistema inmune y todo tipo de problemas

sistémicos, generado grandes pérdidas en el sector industrial. Además, la excreción

intacta de esta molécula, produjo contaminación ambiental por exceso de fosfatos y

demás nutrientes, aumentando altamente la proliferación de microorganismos y plantas

en los lugares de descarga de excretas (Rao et al., 2009; Onyango et al., 2005).

Posteriormente, la suplementación con fitasas a los alimentos de los

monogástricos logró corregir ambas situaciones, mejorando la producción animal y

descontaminando el ambiente (Kim et al., 2010; Leytem et al., 2008).

Similarmente, las industrias productoras de animales de origen acuático

necesitaron recurrir a las mismas materias primas, debido al creciente precio de la

harina de pescado. Por su excelente calidad y aporte nutritivo, su mercado aumentó


4

mucho al igual que su demanda, repercutiendo negativamente en la industria de la

acuicultura, significando un tremendo aumento de los costos de producción de peces en

todo el mundo (Baruah et al., 2004).

Se logró realizar satisfactoriamente la sustitución gradual en la dieta de los peces

de la harina de pescado por materia prima de origen vegetal, abundante en proteínas y

de buen valor nutricional, pero comenzaron a observarse los mismos problemas que

ocurrieron con los cerdos y pollos. Los peces desarrollaron las mismas patologías, mal

formaciones, bajo crecimiento, debilidades sistémicas, efectos atribuibles a la presencia

del ácido fítico y falta de fósforo disponible en la dieta (Yao et al., 2011; Rao et al.,

2009; Lall y Lewis-McCrea, 2007; Gatlin et al., 2007; Greiner y Konietzny, 2006; Refstie

y Storebakken, 2001; Carter y Hauler, 2000).

Los peces son monogástricos y agástricos, por lo que no digieren el AF y lo

excretan directamente hacia las aguas junto con parte de fósforo mineral suplementado

a su dieta. Esto contaminó gravemente el recurso hídrico de las zonas de criadero,

eutrofizando el medio acuático, observándose alta proliferación de algas y

microorganismos acuáticos, alterando la cadena alimentaria, cambiando el pH, entre

otros problemas. Se logró suplementar exitosamente con fitasas el alimento de los

peces, solucionando parcialmente estos problemas, ya que en este escenario la

utilización de esta enzima es mucho más limitada (Kumar et al., 2011; Bohn et al., 2008;

Cao et al., 2007; Verlhac et al., 2007; Correl, 1999).

2.2 Proteínas vegetales.

La calidad nutricional de los desechos agroindustriales es alta, entre un 25 y 40%


5

de proteínas, alrededor de 15% de lípidos de excelentes propiedades, y bajos en

carbohidratos, pero también altos en fibra, proceden de la industria de oleaginosas y

cerealera como derivados o desechos de la soya, maíz, canola, girasol, sésamo, trigo,

arroz, etc. Gradualmente año tras año, la industria acuícola aumentó su utilización para

alimento de peces, versus la disminución progresiva en la utilización de la harina de

pescado (Buschmann y Fortt, 2005; Refstie y Storebakken, 2001).

En la proteína vegetal el fósforo disponible es muy escaso y está acoplado a la

molécula de AF en forma de fosfato, aproximadamente entre un 50 a 90%. El

porcentaje restante se encuentra en trazas de ácidos nucleicos, ATP, fosfolípidos, y

demás moléculas fosfatadas (Debnath et al., 2005; Yao et al., 2011).

Las cantidades de fósforo total y fósforo fítico en las distintas materias primas

varía según se trate de derivados de los cereales o de la oleaginosas, en la Tabla I se

aprecian los valores medios que se han determinado para una gran cantidad de

alimentos usados en acuicultura (Selle et al., 2000).

Además, por el actual aumento del cultivo de la colza, siendo la Canola es el

fruto de la colza mejorada genéticamente en Canadá mediante técnicas estandarizadas

de cruzamiento entre ejemplares con las características deseadas. Se le denomina

Canola debido al origen canadiense del aceite (Canadian oil) y de las cepas de colza.

Por las propiedades de la canola, la parte residual también es alta en nutrientes, posee

la mejor y mayor proporción de aminoácidos esenciales y no esenciales de todos los

derivados agroindustriales, usados en la alimentación industrial, también es alto en

ácido linoleico y linoleneico, pero la cantidad de AF es bastante alta Tabla I.

Desde la primera mitad de la década de los noventa cada vez fue mayor su uso
6

Tabla I: Fósforo total y fósforo fítico en ingredientes comunes usados en

las dietas de los peces a nivel mundial.

Pi total Pi fítico Pi fítico en


Ingrediente
(g/kg) (g/kg) Pi total (%)

Maiz 2,40 2,05 85,40

Gluten de Maiz 5,00 4,20 84,00

Grano 2,50 1,70 73,00

Germen y salvado de grano (grueso) 6,60 4,20 64,00

Germen y salvado de grano (fino) 12,10 7,80 65,00

Salvado de arroz 17,51 15,83 90,20

Arroz 1,20 0,80 65,00

Arroz integral 15,70 11,30 72,00

Salvado de trigo 10,96 8,36 76,30

Derivados del trigo 8,02 7,00 87,30

Trigo 3,08 2,20 74,90

Cebada 2,73 1,86 67,30

Avena 2,43 2,10 86,40

Harina de cacahuate 6,00 4,60 77,00

Semillas de soya (entero) 5,55 3,08 55,50

Harina de semilla de soya 6,66 4,53 68,30

Semillas de algodón (entero) 6,05 4,25 70,20

Harina de semillas de algodón 11,36 9,11 80,50


7

Harina de girasol 9,05 7,48 82,80

Harina de colza 11,80 7,00 59,00

Harina de canola 8,76 6,69 76,40

Habas 4,01 2,43 60,00

Lupino albo (antero) 4,47 2,49 55,70

Lupino angustifolius (antero) 3,10 1,60 51,60

Pi total (g/kg): Gramos de fosfato inorgánico por kilogramo de materia prima. Pi fítico

(g/kg): Gramos de fosfato inorgánico (proveniente del ácido fítico) presente por

kilogramo de materia prima; Pi fítico en Pi total (%): Porcentaje de fosfato inorgánico

(proveniente del ácido fítico) en todo el fosfato inorgánico del material (Kumar et al.,

2011).
8

para alimentar peces, como salmones, truchas, bagres, carpas, tilapias, percas y

muchos otros. Actualmente constituye, el segundo insumo de este tipo, después de la

harina de soya, más usado en forma rutinaria en todo el mundo en las industrias

pecuarias y acuícolas, a pesar de la elevada cantidad de AF presente. Esto hace que

no sea óptimo su aprovechamiento por los peces, debido a que sus condiciones

gastrointestinales presentan más limitaciones que los terrestres, a pesar de la

suplementación de sus dietas con fitasas exógenas (Newkirk, 2009; Verlhac et al.

2007).

2.3 Ácido fítico.

El AF es una molécula de inositol que tiene acoplado una molécula de ortofosfato

a cada uno de sus seis carbonos, a raíz de lo cual, la IUPAC nombró oficialmente este

compuesto como mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis dihidrógeno fosfato (Figura 1). Los

grupos fosfato le confieren una carga altamente negativa a pH neutro o superior.

Interacciona fácilmente con moléculas con carácter positivo como las sales minerales,

actuando como un quelante muy potente de cationes mono, di y trivalentes como el

Na+, K+, Ni2+, Co2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ y Cr3+. Algunos de estos

cationes se encuentran en cantidades más bajas en el alimento suministrado,

disminuyendo aún más la cantidad disponible para los peces (Turner et al., 2002).

Además sufre interacciones electrostáticas con proteínas. A pH altos, y dependiendo

del punto isoeléctrico de las proteínas, este interactúa con los aminoácidos cargados

positivamente y grupos amino terminales. Además, al acomplejarse con minerales,

través de estos, forma interacciones con grupos carboxilo y residuos cargados


9

Figura 1: Estructura molecular de ácido fítico. La figura muestra la estructura

molecular del AF, un anillo de inositol el cual tiene acoplado un grupo de ortofosfato a

cada uno de sus carbonos (Yao et al., 2011).


10

negativamente. Los complejos formados pueden ser AF-cationes, AF-proteínas, AF-

cationes-proteína y AF-cationes-proteína-almidón (Figura 2) impidiendo la degradación

y absorción de estos mismos, que finalmente pasan por el tracto digestivo sin ser

degradados.

Los complejos además, inhiben distintas enzimas proteolíticas como pepsina,

tripsina, quimotripsina, y enzimas amilolíticas, limitando la biodisponibilidad de

aminoácidos y otros nutrientes para el organismo. Sumado a la carencia de minerales,

genera problemas de salud en los monogástricos como: inmunológicos, bajo desarrollo,

mal formaciones, y debilidades generales (Debnath et al., 2005; Bretti et al., 2012).

A raíz de esto, una enorme cantidad de nutrientes principalmente fósforo en

forma de fitato, y otros menos solubles son depuestos en las aguas de las zonas de

crianza, que se acumulan en el lecho marino contribuyendo aún más a su eutrofización.

A consecuencia de esto, se multiplican hongos, algas neurotóxicas, cianobacterias, se

producen cambios de pH, baja de oxígeno, aumento de gases tóxicos, cambio en la

biodiversidad y alteración de la cadena ambiental. En general estos fueron las

principales efectos secundarios por alimentar a los peces con harina de canola, soya,

sésamo y demás alimentos, por la masiva cantidad de nutrientes no digeridos

especialmente los que determinan la proliferación explosiva de algas capaces de

producir compuestos gastrotóxicos, hepatotóxicos, neurotóxicos y cancerígenos

(Debnath et al., 2005; Ali et al., 2010).

2.4 Fitasas.

Las fitasas (mio inositol hexafosfato hidrolasa), son hidrolasas de la familia de


11

Figura 2: Esquema de hidrolisis del fitato a inositol e intermediarios, por fitasa.

La figura grafica las interacciones que ocurren en el tracto digestivo de los animales,

entre el AF-cationes-poteínas-almidón, y el cómo la fitasa deshace estas interacciones

a través de la hidrólisis de los grupos ortofosfatos (Yao et al., 2011).


12

las fosfatasas que catalizan la hidrolisis de los ortofosfatos desde el AF. Hasta la fecha

se ha demostrado la existencia de una gran variedad de fitasas, desde plantas como la

calabaza, lilia, arroz, trigo, soya, maíz, canola, de microorganismos como la E. coli,

Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, en intestino de aves y mamíferos.

Según el carbono en que se encuentre el ortofosfato que liberan primero, las

fitasas se clasifican en 3 grupos: Las “4/6-fitasas” (EC 3.1.3.26), principalmente nativas

de plantas superiores, cortan inicialmente en el fosfato de los carbonos 4 o 6; las “1/3-

fitasas” (EC 3.1.3.8) de origen microbiano cortan en los fosfatos de los carbonos 1 o 3; y

las “5-Fitasa” (EC 3.1.3.72) cortan en el fosfato del carbono 5 (Li et al., 2010).

Respecto del tamaño, los pesos moleculares de las fitasas bacterianas y de

hongos fluctúan entre 40-55 kDa y 80-120kDa respectivamente, principalmente debido

al número de glicosilaciones, mientras las fitasa de plantas superiores tienen pesos de

47-76kDa. Por ejemplo, la fitasa más caracterizada es la del Aspergillus niger,

codificada por un gen de 1,4 kb y tiene un peso molecular de 80 kDa con 10 lugares de

glicosilación (Lei y Porres, 2003).

Las 4/6-fitasas presentan actividades relativamente altas y relativamente

constantes a pH’s entre 4,5 y 7, a temperaturas entre 25 y 50 °C. Las 1/3-fitasas se

caracterizan por ser mucho más variadas y versátiles, pudiendo actuar desde pH´s 2,0

hasta 8,0 y a temperaturas entre 20 y 80°C. Respecto de las “6-fitasas” por lo general

actúan a pH 2,5 y 5,5 y a temperatura de 55 a 60°C (Viveros et al., 2002; Oh et al.,

2004).

Catalíticamente la mayoría de las fitasas pertenecen a la familia de las fosfatasas

ácido-histidínicas (Histidine Acidic Phytases “HAP”) (Figura 3, a), y se han aislado de


13

Figura 3: Estructura molecular de fitasas tipo. Se muestra las estructuras

moleculares de los tres tipos de fitasas mas caracterizadas: (a) acido-histidínicas

(Histidine Acidic Phytases “HAP”); (b) Hélice Enrollada (Beta-Propeller Phytases

“BPP”) y (c) Fosfatasas ácidas purpura (Purple acidic phosphatases “PAP”) (Yao et

al., 2011).
14

bacterias, levaduras, hongos filamentosos y plantas (Mullaney y Ullah, 2003). Se

caracterizan por conservar una secuencia heptapeptídica RHGXRXP y un sitio catalítico

dipeptídico HD. Este grupo de enzimas cataliza la hidrolisis del AF en dos pasos: un

ataque nucleofílico desde la histidina en el sitio activo de la enzima, hacia el grupo

fosfoéster objetivo y luego la protonación del grupo saliente por parte del residuo de

ácido aspártico del sitio catalítico HD (Lei y Porres, 2003).

Las de hélice enrollada (Beta-Propeller Phytases “BPP”) (Figura 3, b) son

alcalinas, poseen un sitio con seis lugares específicos de unión a iones de Calcio, la

que a su vez le confiere una termoestabilidad muy alta. Otros tres sitios inespecíficos de

unión a iones Calcio confieren la actividad catalítica a la enzima por la transición de un

confórmero a otro, que es el que se une al AF e induce la hidrolisis. (Mukhametzyanova

et al., 2012; Kim et al., 2010). Hasta ahora, las BPPs de la especie Bacillus han sido las

más ampliamente caracterizadas (Greiner et al., 2007).

Fosfatasas ácidas purpura (Purple acidic phosphatases “PAP”) (Figura 3, c) o fitasas

cisteínicas, son comunes entre microorganismo, plantas y mamíferos. Estas enzimas

necesitan iones metálicos para su actividad catalítica (Mukhametzyanova et al., 2012;

Dionisio et al., 2011). Fueron encontradas en bacterias anaeróbicas como

Selenomonas ruminantium del rumen. Su mecanismo catalítico sugiere que pertenecen

a la gran familia de las fosfatasas cisteínicas que presentan la secuencia conservada de

HCXXGXXR (T/S) en su sitio activo. (Mukhametzyanova et al., 2012; Kumar et al.,

2011; Nakashima et al., 2007).

Un reciente grupo de proteínas fosfatasas tirosínicas que degrada AF se añadió

a la lista de fitasas (Protein Tyrosin Phosphatases, “PTP”) (Chu et al., 2004; Yao
15

et al., 2011). Además, se han aislado PAP’s 5-fitasas desde alfalfa, porotos, arvejas,

Selenomonas ruminantium y del polen de la lilia (Chu et al. 2004; Mehta et al., 2006).

2.5 Actividad fitásica y métodos de detección.

La actividad de las fitasas implica la hidrolisis de al menos 1 ortofosfato desde el

AF. Una unidad de actividad fitásica (FTU) se define como la cantidad de enzima con

capacidad de liberar 1 mol de fosfato inorgánico (Pi) por minuto, a las condiciones de

pH y temperatura en que ocurre la reacción. Actualmente, y por la gran variedad de

condiciones químicas en las que suceden las reacciones, se ha determinado que la

unidad internacional de actividad fitásica sea (IU).

Debido a la liberación de Pi, la manera de determinar actividades de fitasas se ha

hecho a través de la medición del aumento de la cantidad de Pi en las soluciones en

donde actúan. Siendo esto así, los métodos analíticos se han basado en medir el

fosfato inorgánico al inicio y al final de las reacciones. Hasta la fecha se han

desarrollado varios métodos de determinación de Pi que se basan en el

acomplejamiento del Pi con molibdato, resultando en un color medible

espectrofotométricamente, en donde el color es directamente proporcional a la

presencia de Pi liberado.

Fiske y Subbarow (1925) validaron un método de detección de Pi en soluciones,

basado en la formación de un complejo fosfomolíbdico en presencia de ácido ascórbico,

medible a 820nm (Mittal et al., 2011; Li et al., 2008; Kim et al., 1998). Taussky y Shorr

(1953) determinaron fosfato inorgánico basado en la formación del complejo azul

molibdeno reducido por FeSO4, y detectable a 660 nm (Bogar et al., 2003), que fue el
16

primero en ser aplicado en la determinación de Pi liberado por la reacción de fosfatasas

acidas y alcalinas. Además, este método deriva de la metodología de detección de Pi

de Holman (1943) (Huang et al., 2009a; Huang et al., 2006). El método del Vanado-

molibdato es otro método de detección de ortofosfatos, en que se forma un complejo

metavanadato-molibdato-Pi para dar un color amarillo medible a 420 nm (Burns y

Hustby, 1986). Heinonen y Lathi (1981) desarrollaron un conveniente método para

detectar Pi fácilmente aplicable a la medición de actividad de fitasas.

2.6 Fermentación en sustrato sólido (SSF) y sumergido (SmF).

Hay dos formas de cultivo por la cuales bacterias o hongos filamentosos se

pueden desarrollar para producir enzimas: cultivo o fermentación en estado sólido

(SSF) y cultivo o fermentación en estado sumergido (SmF). Por su parte, las bacterias y

levaduras por requerir actividades de agua mayores se cultivan en SmF.

La mayoría de las enzimas comerciales se han producido por SmF, el cual

resulta ser un proceso costoso (Bogar et al., 2003). Es posible y además conveniente la

producción de Fitasas por medio de SSF usando hongos filamentosos (Spier et al.,

2008). La SSF tiene varias ventajas por sobre el SmF: menos utilización de líquidos;

requiere menor energía; se puede realizar con medios de cultivo mucho más simples;

es de fácil aireación; presenta baja probabilidad de contaminación por bacterias; y

sobretodo la utilización de medios de cultivo derivados agroindustriales directamente

con o sin un pequeño tratamiento, significando una gran ventaja. Además, se debe

preferir el cultivo de hongos filamentosos para la producción de fitasas comerciales por

medio del SSF debido a los altos rendimientos y la demostrada obtención de enzimas
17

accesorio (xilanasas, celulasas, proteasas) que complementan la actividad de las

Fitasas, al utilizar derivados agroindustriales como medio de cultivo (Sabu et al., 2005;

Rodríguez-Fernández et al., 2010). Así también lo demostró Costa et al., (2010), al

producir fitasas, xilanasas, proteasas y celulasas mediante la SSF haciendo uso de la

canola como medio de cultivo sólido.

Estudios han demostrado que al cultivar hongos filamentosos como la cepa de

Aspergillus ficuum NRRL 3135 se obtienen rendimientos muy altos de actividad por

gramo de material seco. Además, cultivos de hongos no convencionales como Mucor

racemosus y Rhizopus oligosporus, presentan producción de fitasas con alta actividad

no solo en canola sino también en salvado de trigo, soya, y otros (Dahiya, 2009; Bogar

et al., 2003).

2.7 Fuentes de Fitasas.

Tanto en mamíferos como en peces se ha descrito actividad fitásica presente en

extractos de “mucosa intestinal”. Varias especies de peces presentan actividad fitásica.

La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) es el único pez que hasta ahora presenta

excepcionalmente alta actividad de fitasa en su mucosa intestinal, siendo capaz de

liberar Pi desde el AF y digerir hasta un 50% del fitato ingerido en la dieta, pero

globalmente la actividad enzimática presente en la mucosa intestinal de la mayoría de

los peces es casi nula (Ellestad et al., 2002; Tanami et al., 2008, Greiner y Konietzny,

2006).

Los animales rumiantes presentan altos niveles de actividad fitásica producida

por la microbiota del rumen, pero en los monogástricos y agástricos no. Se ha descrito
18

que especies de microorganismos de la microbiota de mamíferos, aves y roedores

presentan actividad fitásica, pero esta es muy baja. En peces se ha reportado que esta

es muy variable dependiendo de la especie, del grupo de microorganismos en cuestión

y de la temperatura ambiente de los peces. Peces de aguas menos frías como el labeo

roho (Labeo rohita), catla (Catla catla), mrigal (Cirrhinus mrigala), bata (Labeo bata),

kalbasu (Labeo calbasu), tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), perca trepadora

(Anabas testudineus), carpa común (Cyprinus carpio), carpa plateada

(Hypophthalmichthys molitrix) y carpa herbívora (Ctenopharyngodon idella) indican que

las bacterias aisladas de sus microfloras intestinales varían mucho en la capacidad de

hidrolizar el AF. La microbiota de la trucha arcoíris es capaz de hidrolizar hasta solo un

5% del fitato ingerido, y el robalo rayado y la carpa común sólo entre un 1 - 2% (Kumar

et al., 2011; Nakashima et al., 2007).

Las fitasas nativas, presentan niveles variables de actividad, hay mayores niveles

de actividad por kilogramo de materia en cereales y sus derivados que en leguminosas

y oleaginosas, y respectivos derivados. La harina de canola tiene una actividad de 5 -

35 FTU/kg a pH 5,0 y a 50°C; la harina de girasol tiene menos de 10 FTU/kg a pH 5,2 y

a 55°C; el salvado de arroz pose 70 - 190 FTU/kg a pH 4,5 y a 40°C; gluten de maíz 45

FTU/kg a pH 5,0 y 55°C; el salvado de trigo 1700 y 3090 FTU/kg a pH 5,15 y 55°C; la

harina de soya 10 - 95 FTU/kg a pH 5,0 y 55°C. (Hernández et al., 2005; Greiner y

Konietzny, 2006; Bohn et al, 2008). Estas actividades son casi completamente

destruidas debido a los procesos a altas temperaturas que estos alimentos son

tratados, previamente a la suministración a los peces (Kumar et al., 2011).

Las fitasas más comúnmente usadas en la industria son microbianas,


19

generalmente de hongos filamentosos y son extracelulares, las bacterianas son

intracelulares a excepción del género Bacillus, y las de levaduras son mixtas (Kaur et

al., 2007; Dvorakova, 1998).

Actualmente hay un espectro muy amplio de fitasas de origen microbiano tanto

de hongos filamentosos como de levaduras y bacterias que se usan en la alimentación

animal. Por ejemplo fitasas desde microorganismos como: Aspergillus niger presenta

actividad de 50 - 103 U/mg a pH 5,5 y a 55°C; Aspergillus terreus posee 142 - 196 U/mg

a pH 5,5 y a 70°C; Aspergillus oryzae posee 11 U/mg a pH 5,5 y a 50°C; Bacillus

amyiloliquefaciens posee 20 U/mg a pH 7,0 – 8,0 y a 70°C; Bacillus subtilis posee 9 - 15

U/mg a pH 6,5 - 7,5 y a 70°C; Cladosporium posee 909 U/mg a pH 3,5 y a 40°C;

Peniophora Icyii posee 1080 U/mg a pH 5,5 y a 58°C; Candida krusei posee 1210 U/mg

a pH 4,6 y a 40°C; Escherichia coli posee 811 - 1800 U/mg a pH 4,5 y a 55°C;

Citrobacter braakii posee 3457 U/mg a pH 4,0 y a 50°C (Mukhametzyanova et al., 2012;

Greiner y Konietzny, 2006; Konietzny y Greiner, 2004).

Últimamente se ha logrado introducir genes codificantes para fitasas microbianas

en plantas de interés, insertando genes de Aspergillus niger. También se han insertado

genes derivados de Bacillus subtilis, Aspergillus fumigatus, Escherichia coli,

Schwanniomyces occidentalis, Selenomonas ruminantium, etc. en plantas con

importancia en la industria oleaginosa y cerealera como: sésamo, soya, canola, arroz,

trigo, llegándose a obtener actividades enzimáticas tan altas como las actividades

existentes en extractos directos de los microorganismos (Rao et al., 2009; George et al.,

2009; Greiner y Konietzny, 2006).


20

2.8 Fitasas en acuicultura.

Se han documentado una gran cantidad de estudios relacionados con el uso de

fitasas comerciales en la industria acuícola. Diversos estudios evalúan: Natuphos (A.

niger); Bio-Feed Phytase (P. Icyii); AMAFERM, SP, TP, SF, Phyzyme, Ronozyme y

Roxazyme (A. oryzae); globalmente estos estudios indican que existe una relación

positiva entre su aplicación y la biodisponibilidad de nutrientes en peces.

Dependiendo del pez, la temperatura y el alimento, actividades de entre 250 -

1500 FTU/kg de alimento son suficientes para hacer que los peces puedan usar el

fósforo fítico de la harina de soya o canola (Baruah et al., 2007; Kumar et al., 2011),

alrededor de un 20% del fósforo fítico puede hacerse biodisponible cuando se usa entre

500 y 1000 FTU/kg de alimento, y a actividades más altas, se pueden alcanzar hasta un

90% cuando se usan hasta de 4000 FTU/kg de alimento (Cao et al., 2007). El uso de

fitasas a estas actividades permiten también la utilización de minerales en el salmón del

atlántico, trucha arcoíris, carpa común, etc, (Kumar et al., 2011; Nwanna, 2007;

Debnath et al., 2005; Liebert y Portz., 2007; Liebert y Portz., 2005; Papatryphon y

Soares, 2001). Bajos niveles de fitasas pueden facilitar la absorción de elementos como

Ca, Mg, y Mn (1000 FTU/kg), en contraste con elementos como el Zn y Ca que se

percibe aumento importante de bioabsorción sólo cuando se suplementa el alimento

con hasta 8000 FTU/kg de material.

El uso de fitasas también disminuye la inhibición de enzimas como pepsinas,

tripsinas y amilasas por parte del AF, debido a una baja en las interacciones

electrostáticas entre el AF y las proteínas, además por la ya no existencia de complejos

AF-Cationes, permitiendo así una mayor degradación de estos nutrientes en canola,


21

para truchas arcoíris y otros (Kumar et al., 2011; Forster et al., 1999; Mwachireya et al.,

1999).

Las tasas de crecimiento de los peces cuyo alimento ha sido suplementado con

fitasas aumentan cuando se aplican actividades de entre 250 – 1500 FTU/kg de

alimentos compuesta de soya y canola (Cao et al., 2008; Nwanna y Schwarz, 2007), a

peces como: pez gato africano; trucha arcoíris; lubina rayada; tilapia del Nilo; carpa

común, labeo roho y otros (Kumar et al., 2011; Nwanna et al., 2005; Nwanna y Schwarz,

2007; Baruah et al., 2007; Papatryphon y Soares, 2001; Vielma et al., 2000; Weerd et

al., 1999). Además, gracias a esto se ha detectado una reducción en la contaminación

por exceso de nutrientes en las aguas, aminorando la sobrecarga ambiental por fósforo

hasta un 60%. Este impacto depende de las condiciones en las que son criados estos

peces, debido a que estas cifras son muy mayores en estudios realizados para peces

de aguas cálidas como las tilapias, carpas, labeo roho o salmón del atlántico, que para

peces de aguas más frías como la trucha arcoíris o el salmón del pacifico (Cao et al.,

2007; Kumar et al., 2011).

Por otro lado, se han documentado estudios en salmón del atlántico y pargo

japones (Pagrus major), donde la incubación del alimento con fitasas no mostró

resultados positivos. La biodisponibilidad de fósforo, minerales y proteínas no

aumentaron a niveles considerable (Denstadli et al., 2007; Biswas et al., 2007).

En este escenario, además de las temperaturas, otro de los factores limitantes en

la eficiencia de las fitasas es el pH de los tractos digestivos de los peces, ya que

algunos son gástricos que presentan pH’s bajos en sus estómagos, y otros son

agástricos con un pH de 6,5 – 8,4 en todo el tracto digestivo, significando que las fitasas
22

acidas prácticamente no presentan actividad a esos pH’s (Kumar et al., 2011). La

manera clásica de suministrar las fitasas a los peces gástricos es rociando la fitasa en

forma de solución estabilizada con MgSO4 (Vielma et al., 2004), después de que el

alimento haya sido tratado industrialmente a altas temperaturas para generar pellets de

soya, canola y demás. Esto pues, las altas temperaturas destruye las fitasas no

termorresistentes. Pero, especialmente para peces agástricos, la comida post tratada es

incubada con las fitasas para que exista actividad fuera del pez, y luego suministrarla al

pez (Cao et al., 2007; Verlhac et al., 2007). Pero con el desarrollo de fitasas

termoestables, de cepas de A. niger, A. y E. coli, modificadas y expresadas en vectores

como Pichia pastoris, se pueden obviar estos procesos de postratamiento del alimento

(Kumar et al., 2011; Garrett et al., 2004; Han y Lei, 1999). Se han desarrollado fitasas

termoresistentes, manteniendo hasta un 85% la actividad fitásica, después de ser

calentadas a 90 °C por varios minutos. Fitasas de Schwanniomyces castellii, Arxula

adeninivorans y various Pichia spp. presentan actividades a temperaturas de 80 °C, y

se han logrado clonar fitasas tipo BPP de cepas del genero Bacillus en Pichia pastoris

que presenta alta termoestabilidad a 90 °C por hasta 10 minutos, y alta actividad a altas

temperaturas y a pH neutros y básicos, adecuada para peces agástricos (Salvadó et al.,

2011; Kumar et al., 2011; Vohra y Satyanarayana, 2003). Hasta la fecha, la limitante

más importante en el desempeño de las fitasas comerciales es la temperatura.

Históricamente se han investigado y comercializado industrialmente fitasas termo-

resistentes con alta actividad a temperaturas elevadas, que puedan resistir y a su vez

actuar en los procesos de tratamiento de los alimentos de los peces.

Dado el escenario actual de crianza de peces de aguas frías, donde las


23

temperaturas pueden oscilar desde 0 a 15 °C, las fitasas comerciales pierden hasta un

90 % de su actividad óptima. Excepcionalmente, Verlhac et al., (2007) indicó que

estudios de actividad de la fitasa comercial de Peniophora lycii (RONOZYME P5000

(CT) de origen finlandés), puede conservar al menos hasta un 40% de su actividad a

10°C, y desde un 32 a 37% de la actividad a temperaturas entre 5 - 8°C, a pH 5,5.

Estudios como estos indican que existen microorganismos productores de fitasas con

relativamente altas actividades a bajas temperaturas, ideales para su aplicación en

zonas donde la crianza de peces es a temperaturas bajo 15°C. Por esto, es necesario

investigar y desarrollar fitasas que presenten alta actividad enzimática a estas

temperaturas tan bajas con el fin de aprovechar al máximo la proteína vegetal, para

aumentar la calidad del producto acuícola, reducir costos de producción y

principalmente minimizar la eutrofización ambiental en Chile y el mundo.


24

2.9 Hipótesis

De los microorganismos aislados de las costas de Osorno y Valdivia, que crecen

a temperaturas bajas y/o medias, es posible seleccionar al menos, un microrganismo

que al ser cultivado en medios basados en fuentes vegetales ricas en AF a

temperaturas medias, liberan fitasas con alta actividad a bajas temperaturas.

Objetivo General

Seleccionar un microorganismo productor de fitasa con actividad a bajas

temperaturas, identificarlo y cultivarlo para producir la enzima y caracterizarla

térmicamente.

Objetivos Específicos

1. Desde el cepario del ICYTAL, seleccionar un microorganismo, que crezca a

temperaturas medias (~25 °C) y bajas (~14 °C), y que sea productor de fitasa con

actividad a ~14 °C.

2. Determinar la cinética de producción de la fitasa, del microorganismo seleccionado,

cultivándolo a pequeña escala en modalidad de cultivo sobre sustrato sólido (SSF),

torta de canola.

3. Producir la enzima en (SSF), semipurificarla y concentrarla medinte tecnologías de

membrana (microfiltración y ultrafiltración).

4. Caracterizar la enzima en función de la temperatura.

5. Identificar el microorganismo.
25

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Reactivos químicos.

- Fosfato de potasio monobásico, KH2PO4 (Merck)

- Acetato de sodio anhidro, C2H3NaO2 (Winkler)

- Ácido acético glacial, CH3CO2H (Merck)

- Sal dipotásica de ácido fítico, C6H16O24P6K2 (Merck)

- Heptamolibdato de amonio tetrahidradatado, H24Mo7N6O24*4H2O (Merck)

- Ácido clorhídrico, HCl (Merck)

- Hidróxido de sodio, NaOH (Merck)

- Ácido sulfúrico, H2SO4 98% (p/v) (Merck)

- Acetona, C3H6O (Winkler)

- Citrato trisódico (Merck)

- Ácido cítrico (Merck)

- Cloruro de potasio (Merck)

- Casaminoácido (Merck)

- Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4*7H2O (Merck)

- Cloruro de calcio dihidratado, Ca(Cl)2*2H2O (Merck)

- Sulfato de manganeso monohidratado, MnSO4*H2O (Merck)

- Sulfato de amonio anhidro, (NH4)2SO4 (Merck)

- Sulfato de Calcio pentahidratado, CaSO4*5H2O (Merck)

- Ácido bórico, H3BO3 (Winkler)

- Molibdato disódico monohidratado, Na2MoO4*H2O (Merck)


26

- Sulfato de zinc heptahidratado, ZnSO4*7H2O (Merck)

- Cloruro de níquel, NiCl2 (Merck)

- Sulfato de cobalto heptahidratado, CoSO4*7H2O (Merck)

- Yoduro de potasio (Merck)

- Sulfato de cobre pentahidratado, CuSO4*7H2O (Merck)

3.2 Microorganismos.

Cepas de microorganismos aisladas de las costas de Osorno y Valdivia.

3.3 Medios de cultivo (preparación Anexo 7.2).

- Medio F1

- Medio F2

- Medio 3

- Medio 4

- Medio de Ureasa

- Medio C para Auxonograma:

3.4 Equipos e implementos.

- Agitador orbital termorregulado (Marconi)

- Baño termorregulado (Memmert)

- Bomba de vació para filtración (BOECO)

- Centrífuga (HITACHI)

- Espectrofotómetro Spectronic Genesys 5 (Genesys)


27

- Filtros de jeringa (Millipore)

- Millipore Prep/ScaleTM TFF Cartridges 100 y 30kDa cut-off. (Millipore)

- Micropipetas de 5000, 1000, 200, y 10 microlitros (Brand)

- Placas Petri

3.5 Selección de Microorganismo.

Se realizó un screening de diversas cepas de microorganismos existentes en el

cepario del ICYTAL, provenientes de las costas de Osorno y Valdivia.

3.5.1 Screening. Las cepas de microorganismos aislados fueron crecidas en una

placa ELISA. Para el screening se colocó 200 uL de “Medio F1”. Cada microorganismo

aislado fue nombrado arbitrariamente con un código de identificación y luego se inoculó

esporas de estos en cada pocillo por cuadruplicado según el orden que se aprecia en la

Tabla II. Se incubó 7 días a 14°C y se midió crecimiento por densitometría a 450 nm.

3.5.2 Confirmación mejor cepa y mejor pH de crecimiento. En una placa de ELISA

se colocó 200 uL de “Medio F2” a diferentes pH (3,0 - 6,5) para determinar las

condiciones de pH óptimo de crecimiento para cada cepa previamente seleccionada. El

orden de inoculación y pH’s se aprecia la Tabla III. Se incubó 7 días a 14°C y se midió

crecimiento por densitometría a 450 nm.

3.6 Método colorimétrico de detección de actividad fitásica.

Este método analítico considera el uso de un reactivo colorimétrico (CRS) que al


28

Tabla II: Orden de inoculación de hongos para screening (placa ELISA).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A PD PD PD HDA HMP LDA HDA HNG HNG HNG HNG BMP

5 12 1 3-11 G-6 1-11 4 11 9 4 3 11 7-11

B PD PD PD HDA HMP LDA HDA HNG HNG HNG HNG BMP

5 12 1 3-11 G-6 1-11 4 11 9 4 3 11 7-11

C PD PD PD HDA HMP LDA HDA HNG HNG HNG HNG BMP

5 12 1 3-11 G-6 1-11 4 11 9 4 3 11 7-11

D PD PD PD HDA HMP LDA HDA HNG HNG HNG HNG BMP

5 12 1 3-11 G-6 1-11 4 11 9 4 3 11 7-11

E PD PD HDA HMP HMP HMP HNG HNG HNG HNG LRV BMP

8 7 1 S-11 8-11 7-11 6 11 A 12 11B 10B 1-11

F PD PD HDA HMP HMP HMP HNG HNG HNG HNG LRV BMP

8 7 1 S-11 8-11 7-11 6 11 A 12 11B 10B 1-11

G PD PD HDA HMP HMP HMP HNG HNG HNG HNG LRV BMP

8 7 1 S-11 8-11 7-11 6 11 A 12 11B 10B 1-11

H PD PD HDA HMP HMP HMP HNG HNG HNG HNG LRV BMP

8 7 1 S-11 8-11 7-11 6 11 A 12 11B 10B 1-11

La tabla corresponde a un esquema de la forma en que se inoculó, por cuadruplicado,

cada una de los 24 microorganismos en una placa de ELISA. Los códigos que se

muestran son arbitrarios. La temperatura de incubación fue de 14°C.


29

Tabla III: Orden inoculación de hongos seleccionados para confirmación de mejor

cepa y mejor pH de crecimiento (placa ELISA).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
A
3,0 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9

pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
B
3,5 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9

pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
C
4,0 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9

pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
D
4,5 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9

pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
E
5,0 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9

pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
F
5,5 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9

pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
G
6,0 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9

pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
H
6,5 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9

La tabla corresponde a un esquema de la forma en que se inoculó, por triplicado, los 4

hongos que presentaron crecimiento en la etapa de screening (placa ELISA). La

temperatura de incubación fue de 14°C.


30

entrar en contacto con fosfato inorgánico (Pi) torna la mezcla de un color amarillo al

generar un complejo fosfomolíbdico que puede ser directamente detectado

espectrofotométricamente a 400 nm (Bhavsar et al., 2012; Greiner et al., 2009; Greiner

y Farouk, 2007; Heinonen y Lathi, 1981; Pavlova et al., 2008; Soni et al., 2007; Spier et

al. 2011).

3.6.1 Soluciones y reactivos. (Preparación anexo 7.1). Las siguientes son parte de

los materiales y reactivos mayormente usados.

- Buffer Citrato 0,2 M a pH 3,5.

- Solución 10 mM de Sal dipotásica de ácido fítico (AF)

- Solución molibdato de amonio 5% (p/v). (Ammo)

- Ácido sulfúrico 2,5 M.

- Acetona.

- Solución Reactiva Colorimétrica (CRS)

- Solución estándar de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) 50 mM.

3.6.2. Curva de calibración. La curva mide directamente la cantidad de Pi en la

mezcla. Se realizó por triplicado utilizando el rango de 0,05 a 2,5 μmol de Pi, y

utilizando el promedio de las pendientes para los análisis (Tabla IV). Ecuación obtenida

del análisis de regresión se expone en la Figura 4.

3.6.3 Ensayos de actividad en muestras. La actividad consideró la diferencia entre

dos ensayos: reacción positiva y reacción negativa.


31

Tabla IV: Preparación curva de calibración para determinación de Pi.

Blanco Tubo1 Tubo2 Tubo3 Tubo4 Tubo5

H2Od (L) 50 40 30 20 10 0

KH2PO4 50 mM. (L) 0 10 20 30 40 50

AF 10 mM (L) 500 500 500 500 500 500

CRS (mL) 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

Cantidad de Pi (mol) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

AF: solución de ácido fítico 10mM; CRS: Color Reagent Solution, es la solución

compuesta por molibdato de amonio 5% + ácido sulfúrico 2,5M + acetona en una

proporción de 1:1:2.
32

1,200
A400nm media

1,000

0,800
A 400nm

0,600

0,400

0,200

0,000
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500

Pi(umol)

Figura 4: Grafico curva de calibración para determinación de Pi liberado. Ecuación

para determinar Pi liberado: ( ) ⁄


33

Procedimiento reacción positiva: En un tubo de ensayo, mezclar:

- 500 L de solución AF 10 mM (a pH necesario)

- 50 L de la muestra

- incubar 2 horas a 55 °C (puede modificarse tiempo y temperatura)

- 4 mL de CRS para detener la reacción.

- enfriar 5 minutos a 4°C

- Medir Absorbancia 400nm

Procedimiento reacción negativa. En un tubo de ensayo, mezclar:

- 500 L de solución AF 10 mM (a pH necesario)

- incubar 2 horas a T° ambiente

- 4 mL de CRS para detener la reacción

- 50 L de la muestra

- enfriar 5 minutos a 4°C

- leer Absorbancia 400nm

Para ambos ensayos, si hay turbidez, ha de centrifugarse la muestra antes de

medir absorbancia. Ha de leerse la muestra dentro de los primeros 30 minutos, después

de agregar el C.R.S.

3.6.4 Cálculo de actividad enzimática en muestras. Se calcularon todas las

actividades enzimáticas usando la ecuación obtenida a partir de la regresión de la curva

de calibración descrita en la Figura 4, y usando las siguientes ecuaciones:


34

Determinación delta de absorbancia entre ensayos positivos y negativos:

( ) ( )

Ecuación para determinar moles de Pi liberado:

( )
( )

Ecuación para determinar actividad enzimática neta (actividad por gramo de

sustrato):

( ) ( )
( ) ( )( )

Ecuación para determinar actividad enzimática específica (actividad por

miligramo de proteína en la muestra):

Para todas las determinaciones de actividades se utilizaron los siguientes

factores y constantes: Factor Dilución de la muestra = 1; Tiempo de Incubación = 120

minutos; Volumen de muestra = 50 uL; Factor extracción = 0,2 gs/mL; correspondiente

a la relación de extracción con Tritón X 100, se explicará el punto 3.8.4; Concentración

de proteínas = determinado por método Bradford descrito en 3.7.


35

3.7 Cuantificación de proteínas.

Método de Bradford, basado en la unión del colorante azul brillante de

CoomassieR G-250 a las proteínas, permitiendo detectarlas espectrofotométricamente a

620 nm. Las mediciones se realizaron en placas ELISA, con patrones de una solución

de BSA de distintas concentraciones. La Tabla V indica el protocolo de preparación de

la curva de calibración, la Tabla VI indica la ecuación obtenida para calcular la

concentración de proteínas totales.

3.8 Fermentación Sustrato Sólido (SSF).

3.8.1 Preparación de inóculos. Para aumentar la cantidad del hongo, se cultivó vía

SmF usando el medio 3, a 25°C, en matraces de 1 litro, conteniendo 250mL de medio.

Siempre en condiciones de esterilidad, se recuperó los cultivos hacia botellas de

centrifuga de 500 mL y fueron centrifugados a “12000 rpm” por 10 minutos a 0 °C. Se

eliminó sobrenadante y los pellets se resuspendieron en buffer citrato 0,2 M pH 3,5

hasta alcanzar las concentración de hongo por mL deseada. Las concentraciones de

hongo para ambas resuspenciones fueron: “Suspensión 1” con 3,9 mg/mL y

“Suspensión 2” con 5,7 mg/mL (mg/mL = miligramos de hongo por mililitro de buffer

citrato 0,2 M pH 3,5).

3.8.2 Evolución de producción de fitasa en el tiempo. Se prepararon 7 placas de

Petri de 16 cm de diámetro con 70 gramos de canola c/u (estéril) que fueron inoculadas

al 60% de humedad con hongo código HNG-3, descrito a continuación:


36

Tabla V: Protocolo para curva de calibración o muestras (placa ELISA).

Intervalo de medida (0,2 – 1,4mg/ml) Patrón o muestra Blanco

Solución patrón o muestra 10 L -

H2Od - 10 L

Solución relativa de Bradford 200 L 200 L

Para la curva de calibración se agregó a los pocillos correspondientes 10 L de solución

patrón a las concentraciones indicadas en la Tabla VI, y 200 L de reactivo de

Bradford. La curva de calibración no resulta lineal, esto es indicado en el protocolo.

Para cuantificar las proteínas de una muestra se realizó el mismo procedimiento, pero

usando las muestras correspondientes.


37

Tabla VI: Valores curva de calibración para cuantificación de proteínas

mediante el método de Bradford (para placa ELISA).

Pocillos BSA (mg/mL) Absorbancia a 620nm

Blanco 0,0 0,000

1 0,2 0,230

2 0,4 0,408

3 0,6 0,517

4 0,8 0,649

5 1,0 0,734

6 1,2 0,764

7 1,4 0,835

La absorbancia a 620 nm corresponde a la concentración de BSA indicada. Las

muestras de patrón se realizaron en cuadruplicado.

La ecuación para calcular la concentración de proteínas totales fue:

⁄ ( ) √ ⁄
38

- una como control negativo inoculada solo con buffer citrato 0,2 M pH 3,5 (estéril).

- 3 fueron inoculadas con 105 mL de la “suspensión 1” resultando 5,9 mg/g

(miligramos de hongo por gramo de canola), con un desfase de 2 días c/u (X3).

- 3 fueron inoculadas con 105 mL de la “suspensión 2” resultando 8,55 mg/g

(miligramos de hongo por gramo de canola), (X3).

La incubación se realizó en una estufa, a 25°C, durante 6 días, tomando

muestras diarias de ~6 gramos.

Para la confección de la cinética de producción de enzima se utilizó el método

enzimático descrito en 3.6, para cada uno de los 42 extractos.

3.8.3 Cultivo de Hongo código HNG-3 para máxima producción de fitasa. Se

reprodujo (duplicado) las condiciones descritas en el paso 3.8.1, inoculándose al 60%

de humedad con una cantidad de 5,7 mg/mL de hongo resuspendido en buffer citrato

0,2 M y pH 3,5 equivalente a 8,55 mg/g (miligramo hongo por gramo de canola). La

incubación fue a 25°C y se extrajo el día de mayor actividad fitásica.

3.8.4 Preparación de extractos enzimáticos. Las muestras tomadas en 3.8.2 fueron

eluídas con una solución de tritón X100 al 0,1% (estéril) en la proporción de 5:1, luego

se agitaron a temperatura ambiente a 250 rpm por 3 horas, y centrifugadas a 7500 rpm

por 10 minutos a 4 °C, recuperando los sobrenadantes correspondientes a los extractos

crudos, los que fueron refrigerados para la posterior confección de cinética de

producción de fitasa. Se hizo lo mismo a los cultivos descritos en 3.8.3.


39

3.9 Semipurificación y concentración de extractos enzimáticos.

Los extractos de los cultivos descritos en 3.8.3 fueron concentrados mediante

filtraciones seriadas. Primero los extractos crudos fueron microfiltrados a través de

membranas de 0,45 um, y luego ultrafiltrados usando cartuchos Millipore Prep/ScaleTM

TFF de retención de partículas 100 y 30 kDa.

3.9.1 Determinación de actividad fitásica de extractos enzimáticos ultrafiltrados.

Se realizaron ensayos de actividad enzimática como se describe en 3.6 para cada

ultrafiltrado. Para la cuantificación de proteínas se usó el método de Bradford indicado

en 3.7.

3.9.2 Caracterización de la actividad enzimática respecto a la temperatura. Para la

caracterización de la actividad enzimática respecto a la temperatura se llevaron a cabo

ensayos a temperaturas de 5, 14, 25, 37, 45, 55, 65, 75, 85 y 95°C, bajo las condiciones

descritas en el apartado 3.6, y a pH constante.

3.10 Identificación del microorganismo seleccionado.

La identificación del hongo código HNG3 se realizó mediante la observación de

características macroscópicas, microscópicas y mediante pruebas bioquímicas de

asimilación de fuentes especificas Nitrógeno y Carbono (Von Arx, 1970; Kurtzman y

Boekhout, 1998).

3.10.1 Microcultivo para observación de estructura micótica. Con un bisturí se


40

recortaron estrías de Agar papa Dextrosa y se colocaron de forma paralela en la

superficie del agar. Luego, con un aza estéril, se le inoculó gotas de un cultivo líquido

del hongo HNG-3 por los bordes de las estrías y fueron cubiertas con un cubreobjeto

estéril (Figura 5). Se incubó 25C por 48 horas. Se extrajo el cubreobjeto, se colocó

sobre un portaobjeto y se observó al microscopio con objetivas de 40X y 100X. La

presencia de artroconídios es sugestiva de Geotrichum spp. o Trichosporon spp.,

siendo en este último género descrito además la presencia de blastoconídios.

3.10.2 Pruebas de asimilación de fuentes de Carbono (auxonograma) y Nitrógeno.

Se determinó el género realizando las siguientes pruebas.

3.10.2.1 Asimilación de urea. Se evaluó la capacidad de sintetizar la enzima ureasa,

hidrolizar la urea y alcalinizar el pH del medio dejándolo de color rojo. Se inoculó hongo

HNG-3 en Medio de Ureasa, se incubó por 72 horas a 25°C y se observó el cambio de

color del medio. Lectura: Rojo = positivo; Amarillo = negativo

3.10.2.2 Asimilación de D-xilosa y celobiosa (auxonograma). Se evaluó la

asimilación de fuentes de carbono. Se utilizó Medio C para auxonograma y discos de D-

xilosa y celobiosa. Con una tórula estéril se distribuyó homogéneamente una

suspensión del hongo HNG-3 sobre una placa Petri con medio C para auxonograma.

Con una pinza estéril fueron dispuestos sobre el agar los discos de D-xilosa y celobiosa

(Figura 6). Se incubó a 25°C por 48 horas. El crecimiento del hongo indica la utilización

de la fuente de carbono específica (Iturrieta, 2010).


41

Cubreobjeto
(encima)

Estrías
de APD
(debajo)

Figura 5: Esquema de preparado de estrías de APD. La figura representa el cómo se

distribuyeron las estrías de agar papa dextrosa (pedazos de APD, cortados con el

bisturí) sobre el resto del agar, y encima de las estrías se logra ver el cubreobjeto.
42

Disco
Celobiosa

X
Z

Disco
D-Xilosa

Figura 6: Esquema de distribución de discos de D-Xilosa y Celobiosa. La figura

muestra la forma en que fueron dispuestos los discos de azucares sobre el agar al que

previamente se le distribuyó homogéneamente una suspensión del hongo HNG-3, para

verificar la utilización de fuentes de carbono.


43

4. RESULTADOS

4.1 Selección de cepas.

A continuación se presentan los resultados de los screenings de cepas cultivadas

en medio selectivo F1 y F2, en donde la única fuente de fosfato es el AF.

4.1.1 Screening:

Con un n=4 para cada una de las 24 cepas de microorganismos aislados de las

costas de Osorno y Valdivia, y utilizando el medio fítico selectivo F1, se obtuvo que sólo

4 cepas de hongos tuvieron las capacidad de crecer a 14°C. Se logra apreciar las 4

curvas de crecimiento de cada uno de los 4 hongos. El hongo código HNG-3 tuvo un

crecimiento temprano estadísticamente significativo al 2do día de incubación con una

pendiente en su fase exponencial de 2,5212 d-1 y R2= 1 (Figura 7). La cepa HNG-4

presentó un crecimiento al tercer día, con una pendiente en su fase exponencial de

2,0086 d-1 y R2= 0,9464 (Figura 7). La cepa HNG-9 creció al 4to día, con una pendiente

en su fase exponencial de 1,5363 d-1 y un R2= 0,9331. La cepa HNG-11 creció al tercer

día, con un a pendiente en su fase exponencial de 0,5344 d-1 y un R2= 0,9783 (Figura

7).

Debido a la obtención de estos resultados, se eligieron estas 4 cepas de hongos

para hacer un nuevo sondeo confirmatorio de la mejor cepa y el mejor pH de

crecimiento.
44

y = 0,0043e2,5212x
10000,000 R² = 1
HNG-3
HNG-4
1000,000 HNG-11 y = 0,0012e2,0086x
HNG-9 R² = 0,9464
100,000 y = 0,0014e1,5363x
R² = 0,9331
10,000
y = 0,0875e0,5344x
R² = 0,9785
1,000
0 1 2 3 4 5 6 7
0,100

0,010

0,001

Figura 7: Curvas de crecimiento (screening). Este grafico corresponde a la fase

exponencial de las curvas de crecimiento de los 4 microorganismos que crecieron en el

medio selectivo F1. Las líneas de colores representan la pendiente en la fase

exponencial de crecimiento del microrganismo, una mayor pendiente representa que el

microorganismo creció más rápido. La temperatura de incubación fue de 14°C.


45

4.1.2 Validación de mejor cepa y mejor pH de crecimiento.

De la evaluación del crecimiento de los 4 hongos seleccionados previamente y

bajo las condiciones dadas en el apartado 3.5.2, se obtuvieron los siguientes

resultados.

Según el análisis de crecimiento, con un n=3 para cada uno de los 4 hongos, se

obtuvo que sólo 3 de los hongos crecieron utilizando medio Fítico (F2) a 14°C.

Al comparar las curvas de crecimiento de las 3 cepas. El hongo código HNG-3

presentó un óptimo crecimiento a un pH 3,5 con una pendiente en su fase exponencial

de 3,035 d-1 y R2= 1 (Figura 8). El hongo código HNG-4 mostró óptimo crecimiento a

pH 5,0 con una pendiente en su fase exponencial de 1,2139 d-1 y R2= 0,997 (Figura 8).

El hongo código HNG-9 mostró crecimiento estadísticamente significativo a todos los

pH´s, siendo su óptimos a pH 4,0, con pendiente en su fase exponencial de 2,3224 d-1 y

R2= 1 (Figura 8).

Apoyado por estos resultados, por la rapidez de crecimiento de la cepa HNG-3

cuyas pendientes en sus fases exponenciales, tanto en el primer screening como en la

confirmación, fueron superiores a la de las demás cepas. Por esto, se seleccionó el

microorganismo HNG-3 para realizar los cultivos y análisis posteriores.


46

10000 HNG-3 pH 3,5


y = 4E-06e3,035x
1000 HNG-4 pH 5,0 R² = 1
HNG-9 pH 4,0
A 450nm (escala logaritmica)

100
y = 3E-05e2,3224x
10 R² = 1

1
0 1 2 3 4 5 6 7
0,1
y = 0,0001e1,2139x
0,01 R² = 0,997

0,001
0,0001
0,00001
0,000001
Tiempo de incubación (Días)

Figura 8: Curvas de crecimiento de cepas con mejores parámetros de crecimiento

en medio selectivo F2. El gráfico corresponde a las curvas de crecimiento de los 3

microorganismos seleccionados para la confirmación de la mejor cepa y el mejor pH de

crecimiento para ellos, usando los medios selectivos F2. Las líneas de colores

representan la pendiente en la fase exponencial de crecimiento de los 3

microrganismos que lograron crecer. Una mayor pendiente indica que el

microorganismo creció más rápido. La temperatura de incubación fue de 14°C.


47

4.2 Evolución de producción de actividad fitásica en el tiempo.

A continuación se presentan los resultados de los cultivos de hongo HNG-3 en

torta de canola donde se evaluó la producción de fitasa en el tiempo.

La Tabla VII muestra los valores de Actividad Neta obtenidos en la evaluación de

la evolución de la actividad fitásica durante 6 días.

Para el primer set de cultivos, con la “suspensión número 1” de HNG-3 descrita

en el apartado 3.8.2, al 4to día (96 horas) de incubación se detectó una máxima de

actividad neta (mU/gs) de fitasa a las tres temperaturas de incubación realizadas, la

cual a su vez, decreció en los días posteriores (Figura 9A).

También se aprecia que para el segundo set de cultivos inoculado con la

“suspensión número 2” del hongo HNG-3, se alcanzó un máximo de actividad neta

(mU/gs) el 3er (72 horas) de incubación, también a las tres temperaturas de incubación

realizadas, las cuales a su vez, decrecieron en los días posteriores (Figura 9B).

Ambos resultados indican que es posible detectar actividad fitásica en cultivos

del HNG-3, usando canola como medio sólido.


48

Tabla VII: Valores obtenidos en la evolución de la producción de actividad neta de fitasa durante 6 días.

Evolución de actividad neta (cultivo 1). Evolución de actividad neta(cultivo 2).

horas mU/gs 14°C mU/gs 37°C mU/gs 55°C mU/gs 14°C mU/gs 37°C mU/gs 55°C

0 0,08 ± 0,33 0,25 ± 0,45 0,51 ± 1,79 0 ± 0,52 0,25 ± 0,9 0,51 ± 0,89

24 0,25 ± 1,05 5,95 ± 2,50 6,73 ± 4,11 1,68 ± 0,49 3,36 ± 3,23 5,17 ± 3,90

48 1,42 ± 0,54 4,14 ± 3,88 18,63 ± 3,23 9,66 ± 0,83 47,37 ± 1,55 79,73 ± 3,58

72 9,44 ± 0,98 34,68 ± 2,73 61,61 ± 3,23 30,63 ± 0,15 109,76 ± 1,79 189,49 ± 3,10

96 25,24 ± 0,72 93,97 ± 2,80 176,55 ± 9,10 18,94 ± 0,4 68,08 ± 2,05 120,63 ± 4,11

120 16,78 ± 1,95 61,09 ± 3,67 120,63 ± 5,88 11,17 ± 0,61 48,66 ± 5,09 73,52 ± 3,23

144 5,47 ± 0,71 25,88 ± 25,1 60,06 ± 10,19 5,30 ± 1,01 27,44 ± 3,99 43,49 ± 14,82

Los valores indican las actividades netas obtenidas en el proceso de evolución de la actividad fitásica al cultivar el

hongo HNG-3 en canola de la forma en que se describió en el apartado 3.8.2. Los ensayos para determinar la actividad

neta de cada una de las 42 muestras se realizaron por triplicado y a 3 temperaturas distintas (14°C, 37°C y 55°C).
49

A 250

Actividad Neta (mU/gs) 200

150

100

50

0
0 24 48 72 96 120 144

Tiempo (horas)

B 250
Actividad Neta (mU/gs)

200

150

100

50

0
0 24 48 72 96 120 144

Tiempo (horas)

Figura 9: Evolución de actividad total de fitasa durante 6 días. (A): corresponde a la

curva de evolución de actividad fitásica obtenida desde el set de cultivos número 1,

preparada con la suspensión número 1. (B): corresponde a la curva de evolución de

actividad fitásica obtenida desde el set de cultivos número 2 preparada con la

suspensión número 2. Para (A) y (B): las barras corresponden a los análisis de

actividad realizados a 14°C; las barras corresponde a análisis de actividad hechos a

37°C y las barras corresponde a 55°C.


50

4.3 Semipurificación y concentración extractos enzimáticos.

4.3.1 Ultrafiltración y diafiltración de extractos enzimáticos provenientes del

cultivo número 1. Los resultados de los análisis de actividad fitásica de los procesos

de microfiltración y ultrafiltraciones respectivas se presentan en la Tabla VIII, donde se

muestran los valores de actividad neta y específica existentes en el extracto crudo

microfiltrado, y los correspondientes extractos ultrafiltrados y diafiltrados a través de

cartuchos de retención de partículas de 100 kDa y 30kDa, provenientes del cultivo de

HNG-3 en canola (número 1). Mientras que en la Figura 10A, se representa

gráficamente los valores de la Tabla VIII.

El resultado muestra que se logró obtener una mayor cantidad de actividad neta

y específica bajo los 100kDa, en el filtrado F1 (100kDa), y al lavar el retenido R1 (100kDa) se

logró obtener actividad en el Diafiltrado D1 (100kDa).

Para el proceso de ultrafiltración y diafiltración a través de cartuchos de retención

de partículas de 30kDa se tomó el extracto ultrafiltrado F1 (100kDa), y se ultrafiltró por

30kDa. La Tabla VIII y Figura 10B muestran y esquematizan gráficamente los valores

obtenidos, en donde se aprecia que se retuvo la actividad enzimática por sobre los

30kDa tanto para F1 (30kDa) como para D1 (30kDa).


51

Tabla VIII: Valores de Actividad de Ultrafiltrados y Diafiltrados a través de

cartuchos de 100kDa y 30kDa, del cultivo número 1

Actividad Neta Proteínas Actividad Específica


Muestras
(mU/gs) (mg/ml) (mU/mg)

ECM1 (0,45um) 138,75 ± 11,72 0,842 ± 0,0002 164,66 ± 13,91

R1 (100kDa) 54,88 ± 3,23 1,979 ± 0,0006 27,72 ± 1,63

F1 (100kDa) 79,73 ± 5,45 0,404 ± 0,0002 197,31 ± 13,49

R2 (100kDa) 25,37 ± 6,27 0,898 ± 0,0004 28,22 ± 6,98

D1 (100kDa) 25,37 ± 3,10 0,198 ± 0,0001 127,87 ± 15,65

R1 (30kDa) 250,07 ± 13,21 0,695 ± 0,0002 359,51 ± 18,99

F1 (30kDa) 8,80 ± 3,23 0,234 ± 0,0008 37,55 ± 13,79

R2 (30kDa) 234,02 ± 2,37 0,603 ± 0,0001 387,53 ± 3,92

D1 (30kDa) 0,51 ± 1,55 0,016 ± 0,0001 31,27 ± 93,82

ECM1 (0,45um): Extracto crudo microfiltrado obtenido a partir del cultivo número 1;

R1 (100kDa): 1er retenido de 100kDa. (Se ultrafiltró ECM1 (0,45um))

F1 (100kDa): 1er filtrado de 100kDa. (Se ultrafiltró ECM1 (0,45um));

R2 (100kDa): 2do retenido de 100kDa. (Se lavó R1 (100kDa));

D1 (100kDa): 1er diafiltrado de 100kDa. (Se lavó R1 (100kDa));

R1 (30kDa): 1er retenido de 30kDa. (Se ultrafiltró F1 (100kDa));

F1 (30kDa): 1er filtrado de 30kDa. (Se ultrafiltró F1 (100kDa));

R2 (30kDa): 2do retenido de 30kDa. (Se lavó R1 (30kDa));

D1 (30kDa): 1er diafiltrado de 30kDa. (Se lavó R1 (30kDa)).


52

A 300 300

250 250

200 200

150 150

100 100

50 50

0 0
ECM1 R1(100kDa) F1(100kDa) R2(100kDa) D1(100kDa)

Muestras

B 500 500

400 400

300 300

200 200

100 100

0 0
F1(100kDa) R1(30kDa) F1(30kDa) R2(30kDa) D1(30kDa)

Muestras

Figura 10: Ultrafiltraciónes y Diafiltraciones de extractos crudos a través de

cartuchos de 100kDa y 30kDa, cultivo 1. (A): Procesos de ultrafiltrados a través de

cartuchos de 100kDa. (B): Procesos de ultrafiltrados a través de cartuchos de 30kDa.

En (A) y (B), las barras corresponde a actividad neta, y las barras corresponden

a actividad específica.
53

4.3.2 Ultrafiltración y diafiltración de extractos enzimáticos provenientes del

cultivo número 2. Los resultados de los análisis de actividad fitásica de los procesos

de microfiltración y ultrafiltraciones se presentan en la Tabla IX. Se muestra los valores

de actividad neta y específica existentes en el extracto crudo microfiltrado, y los

correspondientes extractos ultrafiltrados y diafiltrados a través de cartuchos de

retención de partículas de 100kDa y 30kDa, provenientes del cultivo de HNG-3 en

canola (número 2). En la Figura 11A, se representa gráficamente los valores de la

Tabla IX. Los resultados muestran que nuevamente se logró obtener una mayor

cantidad de actividad neta y específica bajo los 100kDa, en el filtrado F1(100kDa), y al

lavar el retenido R1 (100kDa) nuevamente se logró obtener actividad en el Diafiltrado D1

(100kDa).

Para el proceso de ultrafiltración y diafiltración a través de cartuchos de retención

de partículas de 30 kDa se tomó el extracto ultrafiltrado F1(100kDa), y se ultrafiltró por

30kDa. La Tabla IX y Figura 11B muestran y esquematizan gráficamente los valores

obtenidos, en donde nuevamente se aprecia que se retuvo la actividad enzimática por

sobre lo 30kDa.
54

Tabla IX: Valores de Actividad de Ultrafiltrados y Diafiltrados a través de

cilindros de 100kDa y 30kDa, del cultivo número 2.

Muestras Actividad Neta Proteínas Actividad Específica

(mU/gs) (mg/ml) (mU/mg)

ECM2 (0,45um) 169,30 ± 7,00 1,347 ± 0,0003 200,91 ± 5,19

R1 (100kDa) 62,64 ± 11,01 2,991 ± 0,0012 31,64 ± 3,68

F1 (100kDa) 87,50 ± 7,00 0,828 ± 0,0005 216,53 ± 8,44

R2 (100kDa) 30,03 ± 10,87 1,155 ± 0,0013 33,41 ± 9,41

D1 (100kDa) 29,51 ± 12,13 0,648 ± 0,0000 148,75 ± 18,71

R1 (30kDa) 277,00 ± 10,87 1,521 ± 0,0012 398,22 ± 7,14

F1 (30kDa) 9,83 ± 5,88 0,721 ± 0,0010 41,97 ± 8,14

R2 (30kDa) 263,02 ± 11,20 1,352 ± 0,0004 435,55 ± 8,27

D1 (30kDa) 0,51 ± 2,37 0,028 ± 0,0002 31,27 ± 84,20

ECM2 (0,45um): Extracto crudo microfiltrado obtenido a partir del cultivo número 2;

R1 (100kDa): 1er retenido de 100kDa. (Se ultrafiltró ECM2 (0,45um))

F1 (100kDa): 1er filtrado de 100kDa. (Se ultrafiltró ECM2 (0,45um));

R2 (100kDa): 2do retenido de 100kDa. (Se lavó R1 (100kDa));

D1 (100kDa): 1er diafiltrado de 100kDa. (Se lavó R1 (100kDa));

R1 (30kDa): 1er retenido de 30kDa. (Se ultrafiltró F1 (100kDa));

F1 (30kDa): 1er filtrado de 30kDa. (Se ultrafiltró F1 (100kDa));

R2 (30kDa): 2do retenido de 30kDa. (Se lavó R1 (30kDa));

D1 (30kDa): 1er diafiltrado de 30kDa. (Se lavó R1 (30kDa)).


55

A 350 350

300 300

250 250

200 200

150 150

100 100

50 50

0 0
ECM2 R1(100kDa) F1(100kDa) R2(100kDa) D1(100kDa)

Muestras

B 350 350

300 300

250 250

200 200

150 150

100 100

50 50

0 0
F1(100kDa) R1(30kDa) F1(30kDa) R2(30kDa) D1(30kDa)

Muestras

Figura 11: Ultrafiltraciónes y Diafiltraciones de extractos crudos a través de

cartuchos de 100kDa y 30kDa, cultivo 2. (A): Procesos de ultrafiltrados a través de

cartuchos de 100kDa. (B): Procesos de ultrafiltrados a través de cartuchos de 30kDa.

En (A) y (B), las barras corresponde a actividad neta, y las barras corresponden

a actividad específica.
56

4.4 Caracterización de actividad fitásica respecto a temperatura.

A continuación se presentan los resultados obtenidos en el proceso de

caracterización de la actividad enzimática de la enzima concentrada respecto a la

temperatura.

Para este análisis se utilizó el extracto concentrado R2 (30kDa) del cultivo número 1

indicado en la Tabla X. Los resultados indican que se obtuvo un mayor rendimiento en

actividad neta y específica a 45 °C, mientras que a bajas temperaturas como 5 y 14°C,

se logró obtener valores de actividad de sólo 9,7 y 15,8% (respectivamente) de

actividad relativa a la alcanzada a los 45 °C. En la Figura 12 se aprecia gráficamente

los valores de la Tabla X.


57

Tabla X: Valores de Actividad enzimática del extracto concentrado R2 (30kDa) del

cultivo número 1, frente a diferentes temperaturas.

Temperatura Actividad Neta Actividad Específica Actividad

(mU/gs) (mU/mg) Relativa (%)

5°C 22,81 ± 4,89 35,12 ± 7,53 9,7

14°C 37,31 ± 3,16 57,44 ± 4,87 15,8

25°C 74,59 ± 10,4 114,84 ± 16,12 31,7

37°C 117,04 ± 7,34 180,21 ± 11,31 49,7

45°C 235,09 ± 3,92 361,96 ± 6,03 100,0

55°C 226,46 ± 4,51 348,68 ± 6,94 96,3

65°C 96,33 ± 3,16 148,32 ± 4,87 40,9

75°C 39,72 ± 5,70 61,16 ± 8,78 16,8

85°C 16,60 ± 7,34 25,56 ± 11,31 7,0

95°C 26,26 ± 9,84 40,44 ± 15,15 11,1

Actividades relativas, tomando como 100% la actividad obtenida a 45°C por ser la

máxima.
58

500 500
450 450
400 400
Actividad Neta (mU/gs)

350 350
300 300
250 250
200 200
150 150
100 100
50 50
0 0
5 14 25 37 45 55 65 75 85 95

Temperatura ( °C )

Figura 12: Caracterización de la actividad enzimática respecto de la temperatura.

El grafico esquematiza y compara las actividades enzimáticas obtenidas a diferentes

temperaturas (entre 5 y 95 °C, con intervalos de 10 °C) a partir de ensayos de actividad

realizados usando el extracto R2 (30kDa) del cultivo número 1 indicado en la Tabla VI. Las

barras representan la actividad neta y las barras representan la actividad

específica.
59

4.5 Identificación del hongo código HNG-3 seleccionado.

4.5.1 Resultados de la observación de la morfología. Respecto a la observación

morfológica se apreció:

- Características macroscópicas: Colonias de crecimiento rápido, blancas, planas, de

bordes lisos (Figura 13A).

- Otras características: Suave olor a frutas característico del género.

- Características microscópicas y descripción de claves taxonómicas: Mediante

observación de estructura micótica se observó la presencia de hifas hialinas septadas y

dicotómicas, además se observó artroconidos rectangulares cortos organizados en

hileras (vagones de tren).

Los rasgos micromorfológicos observados son característicos de Geotrichum sp.

No se observaron blastoconidios, por tanto se descarta Trichosporon sp. (Figura 13C y

D).

4.5.2 Asimilación de fuentes de nitrógeno y carbono específicas. Los resultados

de las asimilaciones de fuentes de nitrógeno y carbono son los siguientes.

- Asimilación de Urea: Negativa, descartando Trichosporon sp. y confirmando

Geotrichum sp.

- Auxonograma de carbono: La asimilación es positiva para D-Xilosa y negativa para

Celobiosa. Indicando y confirmando que se trata de la especie candidum (Figura 13B).


60

A B

D-Xilosa
Celobiosa

C D

X40 X100

Figura 13: Morfología y bioquímica de Geotrichum candidum. (A): Colonias de

Geotrichum candidum en agar papa dextrosa (APD); (B): pruebas de asimilación de

fuentes de carbono D-xilosa y Celobiosa, usando agar C para auxonograma y discos de

las respctivas azucares; (C): Micromorfología de Geotrichum candidum, la imagen al

microscopio óptico está aumentada X40; (D): Micromorfología de Geotrichum

candidum, la imagen al microscopio óptico está aumentada X100.


61

5. DISCUSIÓN

5.1 Discusión de los resultados.

5.1.1 Curvas de crecimiento. Al cultivar los microorganismos en los medios selectivos

F1 y F2, en donde la característica fundamental es que la única fuente de fósforo es el

AF se obtuvieron las curvas de crecimiento (puntos 4.1.1 y 4.1.2). Estas representan un

primer acercamiento confiable hacia la identificación de microorganismos con posible

producción de alguna enzima con la característica de poder degradar ese compuesto

clave, presente en el medio. De otro modo, los 24 microorganismos analizados en el

screening también habrían mostrado crecimiento.

Algunos autores como Howson y Davis (1983) realizan análisis similares aplicado

en placas de Petri con agar selectivo utilizando “sal dicálcica de ácido fítico” como única

fuente de fósforo para los microorganismos, a pesar de la menor pureza del nutriente

limitante (comparado con el sal dipotásica de ácido fítico), estos miden el diámetro del

microorganismo, ya que los microorganimos pueden crecer hasta cierto punto, usando

el fósforo incluido en la impureza del reactivo, pero los que efectivamente presentan

actividad fitásica pueden seguir creciendo hasta tamaños de colonia con el triple de

diámetro.

En la confirmación de mejor cepa y mejor pH de crecimiento se pudo observar al

usar buffer citrato, entre pH 3,0 y 6,5, efectivamente se pudo obtener mejores

parámetros de crecimientos que en él primer screening, lo cual indica que los hongos

código HNG-3 y hongo código HNG-9 crecieron mucho mejor a pH´s 3,5 y 4,0
62

respectivamente, presentando pendientes de 3,035 d-1 para HNG-3 y 2,322 d-1 para

HNG-9, siendo los microorganismos con más altos parámetros de crecimiento de los 24

analizados en ambos sondeos.

Por otro lado solo 3 de los 4 hongos seleccionados lograron crecer, el hongo

código HNG-11 no logro crecer a ningún pH, y el hongo código HNG-4 creció a un ritmo

menor en todos los pH’s, lo cual podría indicar que el buffer estaría influyendo en el

desempeño del crecimiento.

Todos los análisis de curvas de crecimiento fueron realizados a pH’s ácidos, esto

indica que la fitasa funciona eficazmente a pH’s bajos, pudiendo ser de cualquier clase,

exceptuando la de hélice enrollada, ya que estas actúan preferentemente a pH’s

neutros o levemente básicos (Huang et al., 2009b), además son producidas por

bacterias del género Bacillus y no por hongos. Marcando así la tendencia de los análisis

posteriores, a pH’s ácidos.

Por las pendientes obtenidas en ambos sondeos, el microorganismo

seleccionado para esta tesis fue el hongo código HNG-3, identificado finalmente como

Geotrichum candidum.

5.1.2 Análisis de curvas de evolución de producción de fitasa y fermentación en

sustrato sólido (SSF). Del análisis de las curvas de evolución de actividad fitásica

versus días de incubación se puede ver que al utilizar un inoculo mayor, de 8,55 mg de

hongo por gramos de canola, se puede llegar a determinar una máxima actividad

enzimática neta al 3er día, comparado cuando se inoculan 5,9 mg de hongo por gramos

de canola, dando un máximo de actividad neta al 4to día de incubación, se obtuvo una
63

diferencia en 1 día de cultivo.

Costa et al., 2009 ha indicado que al cultivar el hongo como Aspergillus ficuum,

que si es productor de fitasa exógena, también se obtienen máximos de actividad

enzimática al 4to día de incubación. Al inocular una mayor cantidad de hongo, es de

esperar que la aparición del máximo de actividad pueda ser antes.

Además, al comparar las curvas de evolución de actividad fitásica de Aspergillus

ficuum, que es un productor constitutivo de la enzima, la actividad enzimática de días

posteriores al 4to día no se ve afectada mayormente (Lerchundi, 2006), manteniendo

una meseta al menos hasta el 6to día de cultivo. En cambio Xiaolou y Dacui (2005),

indica que la actividad fitásica al cultivar hongos que no presentan síntesis constitutiva

de tal enzima, la actividad declina drásticamente después de alcanzada la máxima

actividad.

Khachatourians y Gowthamana (2001), indicaron que es posible el cultivo de

Geotrichum candidum, utilizando derivados industriales como medio de cultivo para

fermentación en sustrato sólido, inoculando a pH bajos.

Por otro lado cabe señalar que hay estudios en lo que al cultivar Geotrichum

candidum junto a otros microorganismos, en torta de canola, se logra mejorar la calidad

del alimento, encontrándose que la degradación del AF presente alcanza hasta un

43,13% (Liu et al., 2011).

5.1.3 Análisis de semipurificación y concentración de extractos ultrafiltrados. No

se registra en la literatura, análisis similares a los realizados en esta tesis. La obtención

de extractos semipurificados y concentrados de fitasa provenientes de un cultivo de


64

Geotrichum candidum usando como medio torta de canola, no ha sido realizada. Sólo

Howson y Davis (1983) registran cultivos de Geotrichum en medios sólidos, pero

sintéticos.

De los resultados de la semipurificación y concentración mediante ultrafiltración

seriada, al ultrafiltrar los extractos crudos microfiltrados (ECM1 y ECM2) con cartuchos

de retención de partículas de 100kDa, se logra obtener mayor cantidad de actividad

fitásica en los filtrados (F1) 79,73 ± 5,45 mU/gs para el cultivo N° 1 y 87,501 ± 7,004

mU/gs para el cultivo N°2. Esto es confirmado al realizar las diafiltraciones (D1) en la

que parte de la actividad retenida sobre 100kDa, 54,88 ± 3,23 mU/gs (para Retenido 1

del Cultivo N°1) y 62,64 ± 11,01 mU/gs (para Retenido 1 del Cultivo N°2), disminuyen a

25,37 ± 6,27 mU/gs y 30,03 ± 10,87 mU/gs respectivamente. Mientras que en los

análisis de actividad de las muestras de diafiltrado se obtiene una cantidad de actividad

no despreciable de 25,37 ± 3,10 mU/gs y 29,51 ± 12,13 mU/gs para el cultivo N°1 y n°2

respectivamente.

En la etapa de ultrafiltraciones a través de cartuchos de retención de partículas

de 30kDa, se observó que la actividad era retenida casi en su totalidad por sobre los

30kDa.

Para esta etapa se tomó los filtrados F1 (para ambos cultivos) obtenida en la

etapa (ultrafiltración por cartuchos de retención 100kDa), y se ultrafiltraron por los

cartuchos de 30kDa, obteniéndose en los retenidos (R1 para ambos cultivos) una

actividad de 250,07±13,21 mU/gs y 277,00±10,87 mU/gs (Cultivo N°1 y N°2 respect.), y

al diafiltrar, se confirmó que la actividad es retenida sobre los 30kDa.


65

Las muestras de extractos crudos microfiltrados fueron concentradas 4,5 veces

en el caso del cultivo número 1 y 7,5 veces para el caso del cultivo número 2.

Cabe señalar que hubo una diferencia sustancial en las concentraciones de

proteínas entre uno y otro cultivo, mostrando más concentración en el cultivo número 2.

Por lo cual las actividades específicas se vieron disminuidas en gran medida

comparado con el cultivo número 1.

Estos valores descartarían la posibilidad que la enzima tuviese un tamaño

superior a 100kDa, como la de Aspergillus ficuum descrita por Costa et al., (2010) y

Dvorakova (1998). Mientras que indica la posibilidad que esta enzima tenga un peso

molecular similar a la gran mayoría de fitasas descritas en la literatura, como la de

Aspergillus nigger que tiene un peso molecular de 80kDa (Lei y Porres, 2003), o podría

ser una fitasa de bajo peso molecular como la de Pichia pastoris 43kDa (Blanco et al.,

2007).

Xiaolou y Dacui 2005, indica que Geotrichum candidum produce una de las

actividades de fitasa más bajas, comparada con Aspergillus nigger. Ellos obtuvieron

mayores concentraciones de enzima al cultivar el hongo en medios sólidos sintéticos,

usando como única fuente de fosfato la sal dicálcica de ácido fítico.

Cabe señalar que, se han descrito investigaciones en las que al cultivar

microorganismos como Geotrichum candidum, en medios sólidos se logra obtener

cantidades relativamente altas de actividad fitásica, mientras que esos mismos

microorganismos, al ser cultivados en medios líquidos no se logra obtener altas

cantidades de actividad enzimática (Olstorpe et al., 2009).


66

5.1.4 Análisis de la caracterización de la actividad enzimática respecto a la

temperatura. No se ha descrito la temperatura optima de la fitasa sintetizada por

Geotrichum candidum, solo ha habido ensayos para determinar actividad pero solo a

55°C (Xiaolou y Dacui, 2005).

La actividad máxima se logró alcanzar a una temperatura de 45 °C mientras que

a temperaturas más altas, la actividad decreció rápidamente, al igual que a

temperaturas más bajas.

El porcentaje de actividad relativa se obtuvo tomando como actividad base

relativa de 100% la actividad obtenida a 45 °C. Así se obtuvo que a 5°C la actividad

obtenida es de un 9,7% equivalente a la de 45 °C, a 14°C la actividad relativa es de un

15,8 %, a 25 °C la actividad equivale a un 31,7 °C, a 37 °C se obtiene un 49,7%, a 55°C

se obtuvo un 96,3%, a 65°C la actividad decrece hasta solo un equivalente de 40,9%, a

75°C muestra un 16,8%, a 85°C queda un 7% y a 95°C muestra un 11,1 %.

Cabe destacar que el pequeño aumento de actividad a 95°C podría deberse a

una pequeña hidrolisis espontanea del reactivo sal dipotásica de ácido fítico.

Al obtener estos resultados se puede decir que la temperatura óptima de

actividad de esta fitasa se encuentra entre 45 y 55°C, muy similar a la temperatura

optima de la gran mayoría de fitasas ya descritas (Mukhametzyanova et al., 2012;

Greiner y Konietzny, 2006; Konietzny y Greiner., 2004).

Sin embargo, el retener un 15,8 % de su actividad a 14°C es algo muy

significativo, pero también hay autores, que han descrito obtener fitasas con actividades

relativas de 40% a 10°C y 24% a 5°C. (Huang et al., 2009a; Verlhac et al., 2007).
67

5.1.5 Análisis de la identificación del microorganismo. El microorganismo

identificado como Geotrichum candidum, es un hongo cosmopolita, se encuentra bien

distribuido por todo el mundo. Industrialmente se utiliza para la síntesis de lipasas,

maduración de quesos, y se ha probado como aditivo en pellets de animales y peces en

china (Marcellino et al., 2001; Fredrikson et al., 2002; Liu et al., 2011).

Una característica distintiva del genero Geotrichum, y especialmente de la

especie candidum es liberar esteres con aroma de frutas (Goto et al.,1975; Pinotti et al.,

2006). Del análisis de la colonia se observa que Geotrichum candidum produce colonias

lisas blancas o pardas claras, mientras que Trichosporon posee normalmente colonias

blancas o pardas pero verrugosas, por lo que estos resultados coinciden con los

entregados por Kurtzman et al., (1998).

Del análisis microscópico cabe señalar que las artroconidias cortas,

rectangulares y de esquinas rectas son de característica propia de Geotrichum

candidum, a diferencia de Geotrichum fici que presenta artroconidias largas,

rectangulares y de esquinas rectas (Goto et al., 1975).

De las pruebas bioquímicas cabe señalar que Geotrichum candidum es el único

de su género que degrada D-Xilosa pero no Celobiosa (Kurtzman y Boekhout, 1998).

Howson y Davis (1983), y Vohra y Satyanarayana, 2003 mencionan que

Geotrichum candidum puede degradar el fitato a través de la liberación de una fitasa al

medio. Además estos autores han indicado que este hongo sintetiza esta enzima de

forma no constitutiva, sino inducible.

Cabe señalar también que Geotrichum fermentans, a diferencia de G. candidum,

no puede degradar el AF (Omemu et al., 2007).


68

5.2 Conclusiones.

- Geotrichum candidum crece en medio selectivo, a baja temperatura (~14°C)

donde la única fuente de fosfato es el ácido fítico.

- La producción de fitasa, de Geotrichum candidum, es posible ser llevada a cabo

mediante una fermentación en sustrato solido (SSF), usando como medio, la

torta de canola.

- Las técnicas de ultrafiltración y diafiltraciónes aplicadas, son adecuadas para

lograr un extracto semipurificado y concentrado de la fitasa sintetizada por

Geotrichum candidum.

- El peso molecular de la fitasa en cuestión se encuentra entre los 100kDa y

30kDa.

- La enzima fitasa obtenida presenta una temperatura óptima de actividad entre los

45 y 55 °C.

- A 14°C la enzima obtenida retiene un importante 15,8% de la actividad relativa a

la obtenida a 45°C.
69

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7 ANEXOS

7.1 Preparación de reactivos para análisis de actividad enzimática.

- Buffer citrato 0,2 M a pH 3,5:

Para 1 litro mezclar 310 mL de Citrato trisódico 0,2 M + 690 mL de ácido cítrico

0,2 M

(Ácido cítrico: 0,2M: para 500 mL pesar 21 g y aforar con agua desionizada)

(Citrato trisódico: 0,2M: para 500 mL pesar 24,9 g y aforar con agua desionizada)

- Solución 10 mM de sal dipotásica de ácido fítico:

Para 100 mL pesar 0,73622 g de la sal y aforar con buffer citrato 0,2 M pH 3,5.

- Solución (NH4)6Mo7O24 x 4H2O 5% (p/v):

Para 1 litro pesar 50 g y aforar con agua desionizada.

- Ácido sulfúrico 2,5 M:

Para 1 litro tomar 136,1 mL de Ac. Sulfúrico 98,3% y aforar con agua

desionizada.

- Solución Reactiva Colorimétrica (CRS):

Preparar siempre en fresco mezclando: Ácido Sulfúrico 2,5M + Molibdato de

amonio 5% + Acetona en proporciones de 1:1:2.

- Solución estándar (KH2PO4) 50 mM: Para 100 mL pesar 0,6 g y aforar con

agua desionizada.
86

7.2 Medios de cultivo sintéticos usados en esta tesis.

- Medio Fítico general: Glucosa 10 g/L, (NH4)2SO4 4 g/L, ácido fítico 1 g/L,

solución de sales minerales 10 ml/L, Casamino 2 g/L, “KCl” 1,4 g/L, Vitaminas

10ml/L.

- Medio F1: Medio fítico general disuelto en Buffer Acetato 0,2 M pH 5,15.

- Medio F2: Medio fítico general disuelto en Buffer Citrato 0,2 M, a pH: 3,0; 3,5;

4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 y 6,5.

- Medio 3: Glucosa 16 g/L, extracto de levadura 3,2 g/L.

- Medio 4: APD agar papa dextrosa.

- Medio de Ureasa: Urea 20 g/L, KH2PO4 9,1 g/L, Na2HPO4 9,5 g/L, extracto de

levadura 0,1g/L, indicador Rojo Fenol 0,01g/L.

- Medio C para Auxonograma: (NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 0,5 g/L,

Agar-agar 20 g/L.
87

7.3 Reacción negativa (izquierda) y reacción positiva (derecha).


88

7.4 Curva de calibración para determinar Pi libre.


89

7.5 Cultivo líquido de Geotrichum candidum.


90

C1 C2 C (-)

7.6 Evolución de producción de enzima, fotos de cultivo Geotrichum candidum

en canola.

C1 = set de Cultivos 1; C2 = set de Cultivos 2; C(-) = Control negativo.


91

7.7 Cultivo SSF de Geotrichum candidum en torta de canola.


92

7.8 Extracto crudo antes de Ultrafiltrar.


93

7.9 Proceso de ultrafiltración a través de cartuchos de retención de partículas

de 100kDa y 30kDa.

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