Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Profesor Co-Patrocinante
Dr. Alejandro Reyes Pinto
Instituto de Microbiología y Bioquímica
Facultad de Ciencias
VALDIVIA – CHILE
2013
II
AGRADECIMIENTOS
pesar de todas las adversidades, me ayudaron a llegar a la meta de este largo proceso.
Agradezco a Paola Andrea Romero Ojeda por ser el apoyo moral fundamental
A la señora Rosa María Carrasco Fuentes por todos los consejos y gratas
conversaciones.
hongo.
A los profesores Mariela Horzella Rademacher y Alejandro Reyes Pinto por ser
Esta tesis fue financiada por el proyecto DID S-2012-46 y por el proyecto Fondef
CA12i10022
III
INDICE GENERAL
Capítulo Página
1 RESUMEN 1
1.1 ABTRACT 2
2 INTRODUCCIÓN 3
2.4 Fitasas. 10
2.9 Hipótesis 24
3 MATERIALES Y METODOS 25
3.2 Microorganismos 26
3.5.1 Screening 27
de fitasa.
ultrafiltrados. 39
temperatura. 39
y Nitrógeno. 40
V
4 RESULTADOS 43
4.1.1 Screening. 43
temperatura.
5 DISCUSIÓN 61
ultrafiltrados.
respecto a la temperatura.
5.2 Conclusiones. 68
6 BIBLIOGRAFÍA 69
7 ANEXOS 85
VII
por fitasa.
Figura 3: Estructura molecular de fitasas tipo: (a) HAP; (b) BPP y (c) 13
PAP.
temperatura.
liberado.
candidum en canola.
LISTA DE ABREVIATURAS
1. RESUMEN
presencia de altas cantidades de ácido fítico (AF) en estas materias primas ha traído
para los peces, encontrándose grandes obstáculos para ello. Estas fitasas sólo
funcionan de forma óptima a temperaturas de entre 40-60 °C, muy por sobre las
presentes en los peces y zonas de crianza, anulándose así casi por completo la
que potencialmente sintetizara una fitasa extracelular con alta actividad a bajas
enzimática entre los rangos de 100kDa y 30kDa. También fue posible caracterizar la
una mayor actividad enzimática, y que a 14°C la actividad sólo representa un 15,8%
1.1 SUMMARY
The use of plant feed-stuff in monogastric animal feeding, especially fish, has
had serious consequences for them and their environment. The presence of high
amounts of phytic acid (PA) in this material has brought economic and environmental
proliferation of unwanted algae and microorganism. To correct the problem, it has been
assimilable by fishes, it has been great obstacles to do so. These phytases work best at
temperatures of about 40-60 °C, above than those found in fish and breeding areas, so
the activity of phytase is very low. The aim of this work was to select and cultivate a
low temperature (~ 14 °C). The results show that, by cultivating the fungus identified as
and the activity at 14 °C, represents just a 15.8% of relative activity of 45 °C.
3
2. INTRODUCCION
necesidad de obtener alimentos a bajo costo y de alta calidad nutritiva. Pero el uso de
estos materiales se limitaba sólo para animales rumiantes, debido a la presencia del
ácido fítico (AF) o fitato (molécula no digerible por monogástricos) presente en altas
En cerdos y pollos, debido a las propiedades químicas del AF, su alta ingesta y
en los lugares de descarga de excretas (Rao et al., 2009; Onyango et al., 2005).
de buen valor nutricional, pero comenzaron a observarse los mismos problemas que
ocurrieron con los cerdos y pollos. Los peces desarrollaron las mismas patologías, mal
del ácido fítico y falta de fósforo disponible en la dieta (Yao et al., 2011; Rao et al.,
2009; Lall y Lewis-McCrea, 2007; Gatlin et al., 2007; Greiner y Konietzny, 2006; Refstie
excretan directamente hacia las aguas junto con parte de fósforo mineral suplementado
utilización de esta enzima es mucho más limitada (Kumar et al., 2011; Bohn et al., 2008;
cerealera como derivados o desechos de la soya, maíz, canola, girasol, sésamo, trigo,
arroz, etc. Gradualmente año tras año, la industria acuícola aumentó su utilización para
Las cantidades de fósforo total y fósforo fítico en las distintas materias primas
aprecian los valores medios que se han determinado para una gran cantidad de
Canola debido al origen canadiense del aceite (Canadian oil) y de las cepas de colza.
Por las propiedades de la canola, la parte residual también es alta en nutrientes, posee
Desde la primera mitad de la década de los noventa cada vez fue mayor su uso
6
Pi total (g/kg): Gramos de fosfato inorgánico por kilogramo de materia prima. Pi fítico
(g/kg): Gramos de fosfato inorgánico (proveniente del ácido fítico) presente por
(proveniente del ácido fítico) en todo el fosfato inorgánico del material (Kumar et al.,
2011).
8
para alimentar peces, como salmones, truchas, bagres, carpas, tilapias, percas y
harina de soya, más usado en forma rutinaria en todo el mundo en las industrias
no sea óptimo su aprovechamiento por los peces, debido a que sus condiciones
suplementación de sus dietas con fitasas exógenas (Newkirk, 2009; Verlhac et al.
2007).
a cada uno de sus seis carbonos, a raíz de lo cual, la IUPAC nombró oficialmente este
Interacciona fácilmente con moléculas con carácter positivo como las sales minerales,
Na+, K+, Ni2+, Co2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ y Cr3+. Algunos de estos
disminuyendo aún más la cantidad disponible para los peces (Turner et al., 2002).
del punto isoeléctrico de las proteínas, este interactúa con los aminoácidos cargados
molecular del AF, un anillo de inositol el cual tiene acoplado un grupo de ortofosfato a
y absorción de estos mismos, que finalmente pasan por el tracto digestivo sin ser
degradados.
mal formaciones, y debilidades generales (Debnath et al., 2005; Bretti et al., 2012).
forma de fitato, y otros menos solubles son depuestos en las aguas de las zonas de
principales efectos secundarios por alimentar a los peces con harina de canola, soya,
2.4 Fitasas.
La figura grafica las interacciones que ocurren en el tracto digestivo de los animales,
las fosfatasas que catalizan la hidrolisis de los ortofosfatos desde el AF. Hasta la fecha
calabaza, lilia, arroz, trigo, soya, maíz, canola, de microorganismos como la E. coli,
fitasas” (EC 3.1.3.8) de origen microbiano cortan en los fosfatos de los carbonos 1 o 3; y
las “5-Fitasa” (EC 3.1.3.72) cortan en el fosfato del carbono 5 (Li et al., 2010).
codificada por un gen de 1,4 kb y tiene un peso molecular de 80 kDa con 10 lugares de
caracterizan por ser mucho más variadas y versátiles, pudiendo actuar desde pH´s 2,0
hasta 8,0 y a temperaturas entre 20 y 80°C. Respecto de las “6-fitasas” por lo general
2004).
“BPP”) y (c) Fosfatasas ácidas purpura (Purple acidic phosphatases “PAP”) (Yao et
al., 2011).
14
dipeptídico HD. Este grupo de enzimas cataliza la hidrolisis del AF en dos pasos: un
fosfoéster objetivo y luego la protonación del grupo saliente por parte del residuo de
alcalinas, poseen un sitio con seis lugares específicos de unión a iones de Calcio, la
que a su vez le confiere una termoestabilidad muy alta. Otros tres sitios inespecíficos de
et al., 2012; Kim et al., 2010). Hasta ahora, las BPPs de la especie Bacillus han sido las
a la lista de fitasas (Protein Tyrosin Phosphatases, “PTP”) (Chu et al., 2004; Yao
15
et al., 2011). Además, se han aislado PAP’s 5-fitasas desde alfalfa, porotos, arvejas,
Selenomonas ruminantium y del polen de la lilia (Chu et al. 2004; Mehta et al., 2006).
AF. Una unidad de actividad fitásica (FTU) se define como la cantidad de enzima con
capacidad de liberar 1 mol de fosfato inorgánico (Pi) por minuto, a las condiciones de
donde actúan. Siendo esto así, los métodos analíticos se han basado en medir el
presencia de Pi liberado.
medible a 820nm (Mittal et al., 2011; Li et al., 2008; Kim et al., 1998). Taussky y Shorr
molibdeno reducido por FeSO4, y detectable a 660 nm (Bogar et al., 2003), que fue el
16
de Holman (1943) (Huang et al., 2009a; Huang et al., 2006). El método del Vanado-
(SSF) y cultivo o fermentación en estado sumergido (SmF). Por su parte, las bacterias y
resulta ser un proceso costoso (Bogar et al., 2003). Es posible y además conveniente la
producción de Fitasas por medio de SSF usando hongos filamentosos (Spier et al.,
2008). La SSF tiene varias ventajas por sobre el SmF: menos utilización de líquidos;
requiere menor energía; se puede realizar con medios de cultivo mucho más simples;
con o sin un pequeño tratamiento, significando una gran ventaja. Además, se debe
medio del SSF debido a los altos rendimientos y la demostrada obtención de enzimas
17
Fitasas, al utilizar derivados agroindustriales como medio de cultivo (Sabu et al., 2005;
Aspergillus ficuum NRRL 3135 se obtienen rendimientos muy altos de actividad por
no solo en canola sino también en salvado de trigo, soya, y otros (Dahiya, 2009; Bogar
et al., 2003).
La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) es el único pez que hasta ahora presenta
liberar Pi desde el AF y digerir hasta un 50% del fitato ingerido en la dieta, pero
los peces es casi nula (Ellestad et al., 2002; Tanami et al., 2008, Greiner y Konietzny,
2006).
por la microbiota del rumen, pero en los monogástricos y agástricos no. Se ha descrito
18
presentan actividad fitásica, pero esta es muy baja. En peces se ha reportado que esta
y de la temperatura ambiente de los peces. Peces de aguas menos frías como el labeo
roho (Labeo rohita), catla (Catla catla), mrigal (Cirrhinus mrigala), bata (Labeo bata),
kalbasu (Labeo calbasu), tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), perca trepadora
5% del fitato ingerido, y el robalo rayado y la carpa común sólo entre un 1 - 2% (Kumar
Las fitasas nativas, presentan niveles variables de actividad, hay mayores niveles
a 55°C; el salvado de arroz pose 70 - 190 FTU/kg a pH 4,5 y a 40°C; gluten de maíz 45
FTU/kg a pH 5,0 y 55°C; el salvado de trigo 1700 y 3090 FTU/kg a pH 5,15 y 55°C; la
Konietzny, 2006; Bohn et al, 2008). Estas actividades son casi completamente
destruidas debido a los procesos a altas temperaturas que estos alimentos son
intracelulares a excepción del género Bacillus, y las de levaduras son mixtas (Kaur et
animal. Por ejemplo fitasas desde microorganismos como: Aspergillus niger presenta
actividad de 50 - 103 U/mg a pH 5,5 y a 55°C; Aspergillus terreus posee 142 - 196 U/mg
U/mg a pH 6,5 - 7,5 y a 70°C; Cladosporium posee 909 U/mg a pH 3,5 y a 40°C;
Peniophora Icyii posee 1080 U/mg a pH 5,5 y a 58°C; Candida krusei posee 1210 U/mg
a pH 4,6 y a 40°C; Escherichia coli posee 811 - 1800 U/mg a pH 4,5 y a 55°C;
Citrobacter braakii posee 3457 U/mg a pH 4,0 y a 50°C (Mukhametzyanova et al., 2012;
trigo, llegándose a obtener actividades enzimáticas tan altas como las actividades
existentes en extractos directos de los microorganismos (Rao et al., 2009; George et al.,
niger); Bio-Feed Phytase (P. Icyii); AMAFERM, SP, TP, SF, Phyzyme, Ronozyme y
Roxazyme (A. oryzae); globalmente estos estudios indican que existe una relación
1500 FTU/kg de alimento son suficientes para hacer que los peces puedan usar el
fósforo fítico de la harina de soya o canola (Baruah et al., 2007; Kumar et al., 2011),
alrededor de un 20% del fósforo fítico puede hacerse biodisponible cuando se usa entre
500 y 1000 FTU/kg de alimento, y a actividades más altas, se pueden alcanzar hasta un
90% cuando se usan hasta de 4000 FTU/kg de alimento (Cao et al., 2007). El uso de
atlántico, trucha arcoíris, carpa común, etc, (Kumar et al., 2011; Nwanna, 2007;
Debnath et al., 2005; Liebert y Portz., 2007; Liebert y Portz., 2005; Papatryphon y
Soares, 2001). Bajos niveles de fitasas pueden facilitar la absorción de elementos como
tripsinas y amilasas por parte del AF, debido a una baja en las interacciones
para truchas arcoíris y otros (Kumar et al., 2011; Forster et al., 1999; Mwachireya et al.,
1999).
Las tasas de crecimiento de los peces cuyo alimento ha sido suplementado con
alimentos compuesta de soya y canola (Cao et al., 2008; Nwanna y Schwarz, 2007), a
peces como: pez gato africano; trucha arcoíris; lubina rayada; tilapia del Nilo; carpa
común, labeo roho y otros (Kumar et al., 2011; Nwanna et al., 2005; Nwanna y Schwarz,
2007; Baruah et al., 2007; Papatryphon y Soares, 2001; Vielma et al., 2000; Weerd et
por exceso de nutrientes en las aguas, aminorando la sobrecarga ambiental por fósforo
hasta un 60%. Este impacto depende de las condiciones en las que son criados estos
peces, debido a que estas cifras son muy mayores en estudios realizados para peces
de aguas cálidas como las tilapias, carpas, labeo roho o salmón del atlántico, que para
peces de aguas más frías como la trucha arcoíris o el salmón del pacifico (Cao et al.,
Por otro lado, se han documentado estudios en salmón del atlántico y pargo
japones (Pagrus major), donde la incubación del alimento con fitasas no mostró
algunos son gástricos que presentan pH’s bajos en sus estómagos, y otros son
agástricos con un pH de 6,5 – 8,4 en todo el tracto digestivo, significando que las fitasas
22
manera clásica de suministrar las fitasas a los peces gástricos es rociando la fitasa en
forma de solución estabilizada con MgSO4 (Vielma et al., 2004), después de que el
alimento haya sido tratado industrialmente a altas temperaturas para generar pellets de
soya, canola y demás. Esto pues, las altas temperaturas destruye las fitasas no
incubada con las fitasas para que exista actividad fuera del pez, y luego suministrarla al
pez (Cao et al., 2007; Verlhac et al., 2007). Pero con el desarrollo de fitasas
como Pichia pastoris, se pueden obviar estos procesos de postratamiento del alimento
(Kumar et al., 2011; Garrett et al., 2004; Han y Lei, 1999). Se han desarrollado fitasas
se han logrado clonar fitasas tipo BPP de cepas del genero Bacillus en Pichia pastoris
que presenta alta termoestabilidad a 90 °C por hasta 10 minutos, y alta actividad a altas
2011; Kumar et al., 2011; Vohra y Satyanarayana, 2003). Hasta la fecha, la limitante
resistentes con alta actividad a temperaturas elevadas, que puedan resistir y a su vez
temperaturas pueden oscilar desde 0 a 15 °C, las fitasas comerciales pierden hasta un
Estudios como estos indican que existen microorganismos productores de fitasas con
zonas donde la crianza de peces es a temperaturas bajo 15°C. Por esto, es necesario
temperaturas tan bajas con el fin de aprovechar al máximo la proteína vegetal, para
2.9 Hipótesis
Objetivo General
térmicamente.
Objetivos Específicos
temperaturas medias (~25 °C) y bajas (~14 °C), y que sea productor de fitasa con
torta de canola.
5. Identificar el microorganismo.
25
3. MATERIALES Y MÉTODOS
- Casaminoácido (Merck)
3.2 Microorganismos.
- Medio F1
- Medio F2
- Medio 3
- Medio 4
- Medio de Ureasa
- Centrífuga (HITACHI)
- Placas Petri
placa ELISA. Para el screening se colocó 200 uL de “Medio F1”. Cada microorganismo
esporas de estos en cada pocillo por cuadruplicado según el orden que se aprecia en la
Tabla II. Se incubó 7 días a 14°C y se midió crecimiento por densitometría a 450 nm.
se colocó 200 uL de “Medio F2” a diferentes pH (3,0 - 6,5) para determinar las
orden de inoculación y pH’s se aprecia la Tabla III. Se incubó 7 días a 14°C y se midió
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
E PD PD HDA HMP HMP HMP HNG HNG HNG HNG LRV BMP
F PD PD HDA HMP HMP HMP HNG HNG HNG HNG LRV BMP
G PD PD HDA HMP HMP HMP HNG HNG HNG HNG LRV BMP
H PD PD HDA HMP HMP HMP HNG HNG HNG HNG LRV BMP
cada una de los 24 microorganismos en una placa de ELISA. Los códigos que se
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
A
3,0 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9
pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
B
3,5 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9
pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
C
4,0 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9
pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
D
4,5 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9
pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
E
5,0 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9
pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
F
5,5 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9
pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
G
6,0 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9
pH HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG HNG
H
6,5 3 3 3 4 4 4 11 11 11 9 9 9
entrar en contacto con fosfato inorgánico (Pi) torna la mezcla de un color amarillo al
y Farouk, 2007; Heinonen y Lathi, 1981; Pavlova et al., 2008; Soni et al., 2007; Spier et
al. 2011).
3.6.1 Soluciones y reactivos. (Preparación anexo 7.1). Las siguientes son parte de
- Acetona.
mezcla. Se realizó por triplicado utilizando el rango de 0,05 a 2,5 μmol de Pi, y
utilizando el promedio de las pendientes para los análisis (Tabla IV). Ecuación obtenida
H2Od (L) 50 40 30 20 10 0
AF: solución de ácido fítico 10mM; CRS: Color Reagent Solution, es la solución
proporción de 1:1:2.
32
1,200
A400nm media
1,000
0,800
A 400nm
0,600
0,400
0,200
0,000
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500
Pi(umol)
- 50 L de la muestra
- 50 L de la muestra
de agregar el C.R.S.
( ) ( )
( )
( )
sustrato):
( ) ( )
( ) ( )( )
620 nm. Las mediciones se realizaron en placas ELISA, con patrones de una solución
3.8.1 Preparación de inóculos. Para aumentar la cantidad del hongo, se cultivó vía
“Suspensión 2” con 5,7 mg/mL (mg/mL = miligramos de hongo por mililitro de buffer
Petri de 16 cm de diámetro con 70 gramos de canola c/u (estéril) que fueron inoculadas
H2Od - 10 L
Para cuantificar las proteínas de una muestra se realizó el mismo procedimiento, pero
1 0,2 0,230
2 0,4 0,408
3 0,6 0,517
4 0,8 0,649
5 1,0 0,734
6 1,2 0,764
7 1,4 0,835
⁄ ( ) √ ⁄
38
- una como control negativo inoculada solo con buffer citrato 0,2 M pH 3,5 (estéril).
(miligramos de hongo por gramo de canola), con un desfase de 2 días c/u (X3).
de humedad con una cantidad de 5,7 mg/mL de hongo resuspendido en buffer citrato
0,2 M y pH 3,5 equivalente a 8,55 mg/g (miligramo hongo por gramo de canola). La
eluídas con una solución de tritón X100 al 0,1% (estéril) en la proporción de 5:1, luego
se agitaron a temperatura ambiente a 250 rpm por 3 horas, y centrifugadas a 7500 rpm
en 3.7.
ensayos a temperaturas de 5, 14, 25, 37, 45, 55, 65, 75, 85 y 95°C, bajo las condiciones
Boekhout, 1998).
superficie del agar. Luego, con un aza estéril, se le inoculó gotas de un cultivo líquido
del hongo HNG-3 por los bordes de las estrías y fueron cubiertas con un cubreobjeto
estéril (Figura 5). Se incubó 25C por 48 horas. Se extrajo el cubreobjeto, se colocó
hidrolizar la urea y alcalinizar el pH del medio dejándolo de color rojo. Se inoculó hongo
suspensión del hongo HNG-3 sobre una placa Petri con medio C para auxonograma.
Con una pinza estéril fueron dispuestos sobre el agar los discos de D-xilosa y celobiosa
(Figura 6). Se incubó a 25°C por 48 horas. El crecimiento del hongo indica la utilización
Cubreobjeto
(encima)
Estrías
de APD
(debajo)
distribuyeron las estrías de agar papa dextrosa (pedazos de APD, cortados con el
bisturí) sobre el resto del agar, y encima de las estrías se logra ver el cubreobjeto.
42
Disco
Celobiosa
X
Z
Disco
D-Xilosa
muestra la forma en que fueron dispuestos los discos de azucares sobre el agar al que
4. RESULTADOS
4.1.1 Screening:
Con un n=4 para cada una de las 24 cepas de microorganismos aislados de las
costas de Osorno y Valdivia, y utilizando el medio fítico selectivo F1, se obtuvo que sólo
4 cepas de hongos tuvieron las capacidad de crecer a 14°C. Se logra apreciar las 4
curvas de crecimiento de cada uno de los 4 hongos. El hongo código HNG-3 tuvo un
pendiente en su fase exponencial de 2,5212 d-1 y R2= 1 (Figura 7). La cepa HNG-4
2,0086 d-1 y R2= 0,9464 (Figura 7). La cepa HNG-9 creció al 4to día, con una pendiente
en su fase exponencial de 1,5363 d-1 y un R2= 0,9331. La cepa HNG-11 creció al tercer
día, con un a pendiente en su fase exponencial de 0,5344 d-1 y un R2= 0,9783 (Figura
7).
crecimiento.
44
y = 0,0043e2,5212x
10000,000 R² = 1
HNG-3
HNG-4
1000,000 HNG-11 y = 0,0012e2,0086x
HNG-9 R² = 0,9464
100,000 y = 0,0014e1,5363x
R² = 0,9331
10,000
y = 0,0875e0,5344x
R² = 0,9785
1,000
0 1 2 3 4 5 6 7
0,100
0,010
0,001
resultados.
Según el análisis de crecimiento, con un n=3 para cada uno de los 4 hongos, se
obtuvo que sólo 3 de los hongos crecieron utilizando medio Fítico (F2) a 14°C.
de 3,035 d-1 y R2= 1 (Figura 8). El hongo código HNG-4 mostró óptimo crecimiento a
pH 5,0 con una pendiente en su fase exponencial de 1,2139 d-1 y R2= 0,997 (Figura 8).
pH´s, siendo su óptimos a pH 4,0, con pendiente en su fase exponencial de 2,3224 d-1 y
100
y = 3E-05e2,3224x
10 R² = 1
1
0 1 2 3 4 5 6 7
0,1
y = 0,0001e1,2139x
0,01 R² = 0,997
0,001
0,0001
0,00001
0,000001
Tiempo de incubación (Días)
crecimiento para ellos, usando los medios selectivos F2. Las líneas de colores
en el apartado 3.8.2, al 4to día (96 horas) de incubación se detectó una máxima de
(mU/gs) el 3er (72 horas) de incubación, también a las tres temperaturas de incubación
realizadas, las cuales a su vez, decrecieron en los días posteriores (Figura 9B).
Tabla VII: Valores obtenidos en la evolución de la producción de actividad neta de fitasa durante 6 días.
horas mU/gs 14°C mU/gs 37°C mU/gs 55°C mU/gs 14°C mU/gs 37°C mU/gs 55°C
0 0,08 ± 0,33 0,25 ± 0,45 0,51 ± 1,79 0 ± 0,52 0,25 ± 0,9 0,51 ± 0,89
24 0,25 ± 1,05 5,95 ± 2,50 6,73 ± 4,11 1,68 ± 0,49 3,36 ± 3,23 5,17 ± 3,90
48 1,42 ± 0,54 4,14 ± 3,88 18,63 ± 3,23 9,66 ± 0,83 47,37 ± 1,55 79,73 ± 3,58
72 9,44 ± 0,98 34,68 ± 2,73 61,61 ± 3,23 30,63 ± 0,15 109,76 ± 1,79 189,49 ± 3,10
96 25,24 ± 0,72 93,97 ± 2,80 176,55 ± 9,10 18,94 ± 0,4 68,08 ± 2,05 120,63 ± 4,11
120 16,78 ± 1,95 61,09 ± 3,67 120,63 ± 5,88 11,17 ± 0,61 48,66 ± 5,09 73,52 ± 3,23
144 5,47 ± 0,71 25,88 ± 25,1 60,06 ± 10,19 5,30 ± 1,01 27,44 ± 3,99 43,49 ± 14,82
Los valores indican las actividades netas obtenidas en el proceso de evolución de la actividad fitásica al cultivar el
hongo HNG-3 en canola de la forma en que se describió en el apartado 3.8.2. Los ensayos para determinar la actividad
neta de cada una de las 42 muestras se realizaron por triplicado y a 3 temperaturas distintas (14°C, 37°C y 55°C).
49
A 250
150
100
50
0
0 24 48 72 96 120 144
Tiempo (horas)
B 250
Actividad Neta (mU/gs)
200
150
100
50
0
0 24 48 72 96 120 144
Tiempo (horas)
suspensión número 2. Para (A) y (B): las barras corresponden a los análisis de
cultivo número 1. Los resultados de los análisis de actividad fitásica de los procesos
El resultado muestra que se logró obtener una mayor cantidad de actividad neta
30kDa. La Tabla VIII y Figura 10B muestran y esquematizan gráficamente los valores
obtenidos, en donde se aprecia que se retuvo la actividad enzimática por sobre los
ECM1 (0,45um): Extracto crudo microfiltrado obtenido a partir del cultivo número 1;
A 300 300
250 250
200 200
150 150
100 100
50 50
0 0
ECM1 R1(100kDa) F1(100kDa) R2(100kDa) D1(100kDa)
Muestras
B 500 500
400 400
300 300
200 200
100 100
0 0
F1(100kDa) R1(30kDa) F1(30kDa) R2(30kDa) D1(30kDa)
Muestras
En (A) y (B), las barras corresponde a actividad neta, y las barras corresponden
a actividad específica.
53
cultivo número 2. Los resultados de los análisis de actividad fitásica de los procesos
Tabla IX. Los resultados muestran que nuevamente se logró obtener una mayor
(100kDa).
sobre lo 30kDa.
54
ECM2 (0,45um): Extracto crudo microfiltrado obtenido a partir del cultivo número 2;
A 350 350
300 300
250 250
200 200
150 150
100 100
50 50
0 0
ECM2 R1(100kDa) F1(100kDa) R2(100kDa) D1(100kDa)
Muestras
B 350 350
300 300
250 250
200 200
150 150
100 100
50 50
0 0
F1(100kDa) R1(30kDa) F1(30kDa) R2(30kDa) D1(30kDa)
Muestras
En (A) y (B), las barras corresponde a actividad neta, y las barras corresponden
a actividad específica.
56
temperatura.
Para este análisis se utilizó el extracto concentrado R2 (30kDa) del cultivo número 1
actividad neta y específica a 45 °C, mientras que a bajas temperaturas como 5 y 14°C,
Actividades relativas, tomando como 100% la actividad obtenida a 45°C por ser la
máxima.
58
500 500
450 450
400 400
Actividad Neta (mU/gs)
350 350
300 300
250 250
200 200
150 150
100 100
50 50
0 0
5 14 25 37 45 55 65 75 85 95
Temperatura ( °C )
realizados usando el extracto R2 (30kDa) del cultivo número 1 indicado en la Tabla VI. Las
específica.
59
morfológica se apreció:
D).
Geotrichum sp.
A B
D-Xilosa
Celobiosa
C D
X40 X100
5. DISCUSIÓN
Algunos autores como Howson y Davis (1983) realizan análisis similares aplicado
en placas de Petri con agar selectivo utilizando “sal dicálcica de ácido fítico” como única
fuente de fósforo para los microorganismos, a pesar de la menor pureza del nutriente
limitante (comparado con el sal dipotásica de ácido fítico), estos miden el diámetro del
microorganismo, ya que los microorganimos pueden crecer hasta cierto punto, usando
el fósforo incluido en la impureza del reactivo, pero los que efectivamente presentan
actividad fitásica pueden seguir creciendo hasta tamaños de colonia con el triple de
diámetro.
usar buffer citrato, entre pH 3,0 y 6,5, efectivamente se pudo obtener mejores
parámetros de crecimientos que en él primer screening, lo cual indica que los hongos
código HNG-3 y hongo código HNG-9 crecieron mucho mejor a pH´s 3,5 y 4,0
62
respectivamente, presentando pendientes de 3,035 d-1 para HNG-3 y 2,322 d-1 para
HNG-9, siendo los microorganismos con más altos parámetros de crecimiento de los 24
Por otro lado solo 3 de los 4 hongos seleccionados lograron crecer, el hongo
código HNG-11 no logro crecer a ningún pH, y el hongo código HNG-4 creció a un ritmo
menor en todos los pH’s, lo cual podría indicar que el buffer estaría influyendo en el
Todos los análisis de curvas de crecimiento fueron realizados a pH’s ácidos, esto
indica que la fitasa funciona eficazmente a pH’s bajos, pudiendo ser de cualquier clase,
neutros o levemente básicos (Huang et al., 2009b), además son producidas por
bacterias del género Bacillus y no por hongos. Marcando así la tendencia de los análisis
seleccionado para esta tesis fue el hongo código HNG-3, identificado finalmente como
Geotrichum candidum.
sustrato sólido (SSF). Del análisis de las curvas de evolución de actividad fitásica
versus días de incubación se puede ver que al utilizar un inoculo mayor, de 8,55 mg de
hongo por gramos de canola, se puede llegar a determinar una máxima actividad
enzimática neta al 3er día, comparado cuando se inoculan 5,9 mg de hongo por gramos
de canola, dando un máximo de actividad neta al 4to día de incubación, se obtuvo una
63
Costa et al., 2009 ha indicado que al cultivar el hongo como Aspergillus ficuum,
una meseta al menos hasta el 6to día de cultivo. En cambio Xiaolou y Dacui (2005),
indica que la actividad fitásica al cultivar hongos que no presentan síntesis constitutiva
actividad.
Por otro lado cabe señalar que hay estudios en lo que al cultivar Geotrichum
Geotrichum candidum usando como medio torta de canola, no ha sido realizada. Sólo
sintéticos.
seriada, al ultrafiltrar los extractos crudos microfiltrados (ECM1 y ECM2) con cartuchos
fitásica en los filtrados (F1) 79,73 ± 5,45 mU/gs para el cultivo N° 1 y 87,501 ± 7,004
mU/gs para el cultivo N°2. Esto es confirmado al realizar las diafiltraciones (D1) en la
que parte de la actividad retenida sobre 100kDa, 54,88 ± 3,23 mU/gs (para Retenido 1
del Cultivo N°1) y 62,64 ± 11,01 mU/gs (para Retenido 1 del Cultivo N°2), disminuyen a
25,37 ± 6,27 mU/gs y 30,03 ± 10,87 mU/gs respectivamente. Mientras que en los
no despreciable de 25,37 ± 3,10 mU/gs y 29,51 ± 12,13 mU/gs para el cultivo N°1 y n°2
respectivamente.
de 30kDa, se observó que la actividad era retenida casi en su totalidad por sobre los
30kDa.
Para esta etapa se tomó los filtrados F1 (para ambos cultivos) obtenida en la
cartuchos de 30kDa, obteniéndose en los retenidos (R1 para ambos cultivos) una
en el caso del cultivo número 1 y 7,5 veces para el caso del cultivo número 2.
proteínas entre uno y otro cultivo, mostrando más concentración en el cultivo número 2.
superior a 100kDa, como la de Aspergillus ficuum descrita por Costa et al., (2010) y
Dvorakova (1998). Mientras que indica la posibilidad que esta enzima tenga un peso
Aspergillus nigger que tiene un peso molecular de 80kDa (Lei y Porres, 2003), o podría
ser una fitasa de bajo peso molecular como la de Pichia pastoris 43kDa (Blanco et al.,
2007).
Xiaolou y Dacui 2005, indica que Geotrichum candidum produce una de las
actividades de fitasa más bajas, comparada con Aspergillus nigger. Ellos obtuvieron
Geotrichum candidum, solo ha habido ensayos para determinar actividad pero solo a
relativa de 100% la actividad obtenida a 45 °C. Así se obtuvo que a 5°C la actividad
una pequeña hidrolisis espontanea del reactivo sal dipotásica de ácido fítico.
significativo, pero también hay autores, que han descrito obtener fitasas con actividades
relativas de 40% a 10°C y 24% a 5°C. (Huang et al., 2009a; Verlhac et al., 2007).
67
china (Marcellino et al., 2001; Fredrikson et al., 2002; Liu et al., 2011).
especie candidum es liberar esteres con aroma de frutas (Goto et al.,1975; Pinotti et al.,
2006). Del análisis de la colonia se observa que Geotrichum candidum produce colonias
lisas blancas o pardas claras, mientras que Trichosporon posee normalmente colonias
blancas o pardas pero verrugosas, por lo que estos resultados coinciden con los
medio. Además estos autores han indicado que este hongo sintetiza esta enzima de
5.2 Conclusiones.
torta de canola.
Geotrichum candidum.
30kDa.
- La enzima fitasa obtenida presenta una temperatura óptima de actividad entre los
45 y 55 °C.
la obtenida a 45°C.
69
6. BIBLIOGRAFIA
Ali, M., Shuja, M. N., Zahoor, M. and Qadri, I. (2010). Phytic acid: How far have we
Baruah, K, Sahu, N.P. Pal, A.K. and Debnath, D. (2004). Dietary Phytase: An ideal
approach for a cost effective and low-polluting aquafeed. NAGA, WorldFish Center
Baruah, K., Sahu, N.P., Pal A.K., Debnath D., Yengkokpam S. and Mukherjee S.C.
(2007). Interactions of Dietary Microbial Phytase, Citric Acid and Crude Protein
Bhavsar, K., Kumar, R.V. and Khire, J.M. (2012). Downstream processing of
two phase extraction for its simultaneous partitioning and purification. Process
Biswas, A.K., Kaku, H., Ji, S.C., Seoka, M. and Takii, K. (2007). Use of soybean meal
and phytase for partial replacement of fish meal in the diet of red sea bream,
Blanco, L.R., Olazarán, M.G. & Salvadó, V.J. (2007). Producción de una fitasa
Bogar, B., Szakacs, G., Linden, J.C., Pandey, A. and Tengerdy, R.P. (2003).
Bohn, L., Meyer, A.S., and Rasmussen, S.K. (2008). Phytate: impact on environment
Bretti, C., Cigala, R.M., Lando, G., Milea, D., and Sammartano, S. (2012). Sequestering
Burns I.G. and Hutsby, W. (1986). Communications in Soil Science and Plant Analysis
Critical comparison of the vanadomolybdate and the molybdenum blue methods for
the analysis of phosphate in plant sap. Commun. In Soil Sci. Plant Anal., 17(8), 37–
41.
58–64.
Cao, L., Wang, W., Yang, C., Yang, Y., Diana, J., Yakupitiyage, A. and Luo Z., (2007).
Application of microbial phytase in fish feed. Enzyme and Microbial Technology, 40,
497–507.
71
Cao, L., Yang, Y., Wang, W.M., Yakupitiyage, A., Yuan, D.R., and Diana, J.S. (2008).
14(2), 99–109.
Carter, C.G., and Hauler, R.C. (2000). Fish meal replacement by plant meals in extruded
Chu, H.M., Guo, R.T., Lin, T.W., Chou, C.C., Shr, H.L., Lai, H.L., Tang, T.Y., et al.
persulfated phytate: DSP phytase fold and mechanism for sequential substrate
Correll, D.L. (1999). Phosphorus: a rate limiting nutrient in surface waters. Poultry
Costa, M., Lerchundi, G., Villarroel, F., y Torres, M. (2009). Producción de enzima fitasa
Costa, M., Torres, M., Magariños, H., y Reyes, A. (2010). Producción y purificación
12(2), 163–175.
Dahiya, S., Singh, N., and Rana, J.S. (2009). Optimization of growth parameters of
phytase producing fungus using RSM. Journal of Scientific & Industrial Reasearch,
68, 955–959.
Debnath, D., Sahu, N.P., Pal, A.K., Baruah, K., Yengkokpam, S., and Mukherjee, S.C.
Denstadli, V., Storebakken, T., Svihus, B., and Skrede, A. (2007). A comparison of
diets for Atlantic salmon (Salmo salar L.) reared in cold water. Aquaculture, 269(1-
4), 414–426.
Dionisio, G., Brinch-Pedersen, H., Welinder, K.G., and Jørgensen, M. (2011). Different
Ellestad, L.E., Angel, R., and Soares, J.H. (2003). Intestinal phytase II : A comparison of
activity and in vivo phytate hydrolysis in three teleost species with differing digestive
Forster, I., Higgs, D.A., Dosanjh, B.S., Rowshandeli, M., and Parr, J. (1999). Potential
for dietary phytase to improve the nutritive value of canola protein concentrate and
Fredrikson, M., Andlid, T., Haikara, A. and Sandberg, A.S. (2002). Phytate degradation
Garrett, J.B., Kretz, K.A., Donoghue, E.O., Kerovuo, J., Kim, W., Barton, N.R.,
Hazlewood, G.P., Short J.M., Robertson D.E. and Gray K.A. (2004). Enhancing the
Gatlin, D.M., Barrows, F.T., Brown, P., Dabrowski, K., Gaylord, T.G., Hardy, R.W., and
George, T.S., Richardson, A.E., Li, S.S., Gregory, P.J., and Daniell, T.J. (2009).
Greiner, R., and Konietzny, U. (2006). Phytase for Food Application. Food Technol.
Greiner, R., Lim, B.L., Cheng, C. and Carlsson, N.G. (2007). Pathway of phytate
Yamanashi., 519–525.
Han, Y., and Lei, X.G. (1999). Role of glycosylation in the functional expression of an
Heinonen J.K., and Lathi R.J. (1981). A New And Convenient Colorimetric Determination
Hernández, G., and Godoy, S. (2005). Phytates, Phytases Activity and Phosphorus
Holman, W.I. (1943). A new technique for the determination of phosphorus by the
Huang, H., Luo, H., Wang, Y., Fu, D., Shao, N., Yang, P and Yao, B. (2009a). Novel
Huang, H., Shao, N., Wang, Y., Luo, H., Yang, P., Zhou, Z., and Yao, B. (2009b). A
novel beta-propeller phytase from Pedobacter nyackensis MJ11 CGMCC 2503 with
Huang, H., Luo, H., Yang, P., Meng, K., Wang, Y., Yuan, T. and Yao, B. (2006). A novel
Kaur, P., Kunze, G., and Satyanarayana, T. (2007). Yeast phytases: present scenario
Kim, O.H., Kim, Y.O., Shim, J.H., Jung, Y.S., Jung, W.J., Choi, W.C., and Oh, B.C.
Kim, Y.O., Lee, J.K., Kim, H.K., Yu, J.H., and Oh, T.K. (1998). Cloning of the
thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp. DS11 and its overexpression in
Khachatourians, G.G., & Gowthamana, M.K. (2001). Fungal solid state fermentation - an
Konietzny, U., and Greiner, R. (2004). Bacterial phytase: potential application, in vivo
function and regulation of its synthesis. Brazilian Journal of Microbiology, 35, 11–18.
Kumar, V., Sinha, A.K., Makkar, H.P.S., De Boeck G., and Becker, K. (2011). Phytate
and phytase in fish nutrition. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 96,
335 – 364.
Kurtzman, C.P., Fell, J.W., and Boekhout, T. 4a Ed. (1998). The yeasts: a taxonomic
Lall, S.P., and Lewis-McCrea, L.M. (2007). Role of nutrients in skeletal metabolism and
Lei, X.G., and Porres, J.M. (2003). Phytase enzymology, applications, and
Lerchundi, G.N. (2006). Obtención de enzima fitasa a partir de una cepa del hongo
Austral de Chile.
Leytem, A.B., Kwanyuen, P., and Thacker, P. (2008). Nutrient excretion, phosphorus
characterization, and phosphorus solubility in excreta from broiler chicks fed diets
Li, X.Y., Liu, Z.Q., and Chi, Z.M. (2008). Production of phytase by a marine yeast
Li, R., Zhao, J., Sun, C., Lu, W., Guo, C., and Xiao, K. (2010). Biochemical properties,
Liebert, F., and Portz, L. (2005). Nutrient utilization of Nile tilapia Oreochromis niloticus
fed plant based low phosphorus diets supplemented with graded levels of different
Liebert, F., and Portz, L. (2007). Different sources of microbial phytase in plant based
low phosphorus diets for Nile tilapia Oreochromis niloticus may provide different
Liu, L., Gou, Y., Qiu, S.Y., and Zhou, H.X. (2011). Study on improving the nutritive value
Marcellino, N., Beuvier, E., Grappin, R., Guéguen, M., and Benson, D. R. (2001).
4759.
Mehta, B.D., Jog, S.P., Johnson, S.C., and Murthy, P.P.N. (2006). Lily pollen alkaline
Mittal A, Singh G, Goyal V, Yadav A, Aneja K.R, Kumar G.S, Kumar A.N. (2011).
Mullaney, E.J., and Ullah, A.H. (2003). The term phytase comprises several different
312(1), 179–184.
Mwachireya, S.A., Beames, R.M., Higgs, D.A., and Dosanjh, B.S. (1999). Digestibility of
canola protein products derived from the physical, enzymatic and chemical
Nakashima, B., McAllister, T., Sharma, R., and Selinger, L.B. (2007). Diversity of
Nwanna, L.C. (2007). Effect of dietary phytase on growth, enzyme activities and
Nwanna, L. C., and Schwarz, F.J. (2007). Effect of supplemental phytase on growth,
Nwanna, L.C., Fagbenro, O.A. and Adeyo, A.O. (2005). Effects of different tratments on
dietary soybean meal and phytase on the grouth and mineral deposition in african
80
catfish Clarias gariepinus. Journal of Animal and Veterinary Advances, 4(12), 980 –
987.
Oh, B.C., Choi, W.C., Park, S., Kim, Y., and Oh, T.K. (2004). Biochemical properties and
Olstorpe, M., Schnürer, J., and Passoth, V. (2009). Screening of yeast strains for
Omemu, A.M., Oyewole, O.B., and Bankole, M.O. (2007). Significance of yeasts in the
Escherichia coli phytase in diets of broiler chicks. Poultry science, 84(2), 248–55.
Papatryphon, E.J., and Soares, J.H. (2001). The effect of phytase on apparent
digestibility of four practical plant feed-stuff fed to striped bass, Morone saxatilis.
Pavlova, K., Gargova, S., Hristozova, T., and Tankova, Z. (2008). Phytase from antarctic
Pinotti, T., Carvalho, P.M.B., Garcia, K.M.G., Silva, T.R., Hagler, A.N. and Leite, S.G.
(2006). Media components and amino acid supplements influencing the production
81
498.
Rao, D.E.C.S., Rao, K.V, Reddy, T.P., and Reddy, V.D. (2009). Molecular
Refstie, S. and Storebakken, T. (2001). Vegetable protein sources for carnivorous fish :
195–204.
V., Parada, J.L., and Soccol, C.R. (2010). Recovery of phytase produced by solid-
Sabu, A., Kiran, G.S. and Pandey, A. (2005). Purification and Characterization of Tannin
Acyl Hydrolase from Aspergillus niger ATCC 16620. Food Technol. Biotechnol.,
43(2), 133–138.
Salvadó, V., María, J., López, G., Antonio, J., and Olazarán, G. (2011). Diseño y
Selle, P.H., Ravindran, V., Caldwell, A, and Bryden, W.L. (2000). Phytate and phytase:
Soni, S.K., Magdum, A, and Khire, J.M. (2010). Purification and characterization of two
distinct acidic phytases with broad pH stability from Aspergillus niger NCIM 563.
Spier, M. R., Greiner, R., Rodriguez-León, J. A., Woiciechowski, A. L., Pandey, A.,
Soccol, V. T., and Soccol, C. R. (2008). Phytase production using citric pulp and
Spier M.R., Fendrich R.C., Almeida P.C., Noseda M., Greiner R., Konietzny U.,
Woiciechowski A.L. and Soccol V.T., (2011). Phytase produced on citric byproducts
Tanami, R., Sabyasachi, M. and Kumar, R.A. (2009). Phytase-producing bacteria in the
digestive tracts of some freshwater fish. Aquaculture Research, 40, 344 – 353.
Taussky, H.H., and Shorr, E. (1953). A microcolorimetric method for the determination of
Turner, B.L., Papházy, M.J., Haygarth, P.M., and McKelvie, I.D. (2002). Inositol
Verlhac, V., Vielma, J. and Gabaudan, J., (2007). The use of phytase in aquatic feeds.
Vielma, J., Mäkinen, T., Ekholm, P., and Koskela, J. (2000). Influence of dietary soy and
Vielma, J., Ruohonen, K., Gabaudan, J., and Vogel, K. (2004). Top-spraying soybean
meal-based diets with phytase improves protein and mineral digestibilities but not
Viveros, A., Arija, I., Centeno, C., and Brenes, A. (2002). Efecto de la administración de
Von Arx, J.A. (1970). The genera of fungi sporulating in pure culture. The genera of
Weerd, J.H., Khalaf, K.H.A., Aartsen, F.J., and Tijssen, P.A.T. (1999). Balance trials with
African cat fish Clarias gariepinus fed phytase-treated soybean meal-based diets.
Xiaolou, L., and Dacui, L. (2005). The Screening of Fungus Produced by Phytase and
College, 3, 050.
Yao, M.Z., Zhang, Y.H., Lu, W.L., Hu, M.Q., Wang, W., and Liang, A.H. (2011).
7 ANEXOS
Para 1 litro mezclar 310 mL de Citrato trisódico 0,2 M + 690 mL de ácido cítrico
0,2 M
(Ácido cítrico: 0,2M: para 500 mL pesar 21 g y aforar con agua desionizada)
(Citrato trisódico: 0,2M: para 500 mL pesar 24,9 g y aforar con agua desionizada)
Para 100 mL pesar 0,73622 g de la sal y aforar con buffer citrato 0,2 M pH 3,5.
Para 1 litro tomar 136,1 mL de Ac. Sulfúrico 98,3% y aforar con agua
desionizada.
- Solución estándar (KH2PO4) 50 mM: Para 100 mL pesar 0,6 g y aforar con
agua desionizada.
86
- Medio Fítico general: Glucosa 10 g/L, (NH4)2SO4 4 g/L, ácido fítico 1 g/L,
solución de sales minerales 10 ml/L, Casamino 2 g/L, “KCl” 1,4 g/L, Vitaminas
10ml/L.
- Medio F1: Medio fítico general disuelto en Buffer Acetato 0,2 M pH 5,15.
- Medio F2: Medio fítico general disuelto en Buffer Citrato 0,2 M, a pH: 3,0; 3,5;
- Medio de Ureasa: Urea 20 g/L, KH2PO4 9,1 g/L, Na2HPO4 9,5 g/L, extracto de
- Medio C para Auxonograma: (NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 0,5 g/L,
Agar-agar 20 g/L.
87
C1 C2 C (-)
en canola.
de 100kDa y 30kDa.