P R O T O C O LO S 1

PROTOCOLO DE PRECIPITACIÓN
2-D Clean-Up Kit

Materiales

Kit de precipitación de GEHealthare:

El reactivo de Acetona debe estar al menos 1h antes a -20ºC
Solución de resuspensión de las proteínas:
 8 M Urea
 2 M Tiourea
 2 % CHAPS

Protocolo
 Añadir 3x del volumen a precipitar de la SOLUCIÓN PRECIPITANTE
Vortex inmediatamente e incubar 15’ 4ªC
 Añadir 3x del volumen a precipitar de la SOLUCIÓN CO-PRECIPITANTE
Vortex
 Centrifugar al máximo durante 10’ a 4ºC
Desechar el sobrenadante (con mucho cuidado) con la pipeta.
 Lavar el pellet con H2OmQ
Volumen que cubra el pellet
Agitar <=> sin que se disuelva el pellet.
 Sobre el pellet, añadir 1ml de de la SOLUCIÓN WASH BUFFER (-20ºC)” + 5µl de la
“SOLUCIÓN WASH ADDITIVE
Incubar a -20ºC, debe estar al menos 30’.
Agitar <=> de vez en cuando, sin que las proteínas se resuspendan
 Centrifugar al máximo durante 10’ a 4ºC
Desechar el sobrenadante (con mucho cuidado) con la pipeta.
No dejar que le pellet se seque demasiado!
 Resuspender en SOLUCIÓN DE REHIDRATACIÓN
Nunca inferior de 1/20 del vol original

Centro de Genómica y Proteómica - Unidad de Proteómica

Facultad de Farmacia - UCM - Pza Ramón y Cajal , s/n . 28040 Madrid
Tl. 91.394.16.13 – email: cai.proteomica@pas.ucm.es
 P R O T O C O LO S 2

PRECIPITACIÓN TCA-ACETONA

Reactivos

TCA 50 %
Acetona -20º C
Buffer de resuspensión

Procedimiento experimental

 Añadir TCA a la muestra a precipitar, de forma que se quede al 10 %l

 Incubar 30 minutos 4º C (o 15 minutos a -20º C)
 Centrifugar al máximo a 4º C durante 10 minutos
Retirar el sobrenadante
 Resuspender el precipitado en 20 l H2O MilliQ
 Añadir 1 ml Acetona (-20ºC). Intentar disgregar al máximo el pellet
 Incubar O/N a -20ºC
 Centrifugar al máximo a 4º C durante 10 minutos
Retirar el sobrenadante
 Resuspender en la solución adecuada

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 P R O T O C O LO S 3

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS MeOH/CLOROFORMO

La precipitación se hace en 4ºC.

Reactivos

Metanol
Cloroformo

Protocolo
1. Añadir 3 partes de MeOH: si tenemos 100µl de muestra  300µl MeOH
(Vortex)

2. Añadir 1 parte de Cloroformo: 100µl Cloroformo (Vortex)

3. Añadir 3 partes de H2O-LC: 300 µl H2O-LC (Vortex)

4. Centrífuga 5' a 4ºC a 14000 rpm

5. Quitar sobrenadante sin tocar el velo que separa ambas fases

6. Añadir 3 partes de MeOH: 300µl MeOH

7. Vortex para destruir bien el velo y que se precipiten bien las proteínas

8. Centrífuga 10' a 4ºC a 14000 rpm

9. Quitamos el sobrenadante, nos quedamos con el pellet. Dejar abierto los

tubos para secar al aire y se evapore el MeOH (>30')

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