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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS


DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS Y
PRODUCTOS AGROPECUARIOS
INFORME N°1
DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

Curso : Alimentación y Nutrición Humana

Profesora : Dra. Ritva Repo-Carrasco Valencia

Integrantes: Llactacondor Orccori, Noemí


Mamani Abad, Janet
Maucaille Rojas, Malory Rocío
Pablo Ñaupari, Flora Patricia
Pacora Ibarra, Eric Gabriel

Grupo : C* (Miércoles de 11:00 – 1:00 pm)

Mesa : “2”

Fecha del experimento: 29/08/18

Fecha de entrega de informe: 05/09/18

2018 – II
I. INTRODUCCIÓN

Los antioxidantes naturales presentes en las plantas han cobrado gran interés en las últimas
dos décadas puesto que el estrés oxidativo (un desbalance entre las sustancias oxidantes y
prooxidantes) está implicado en un gran número de afecciones de salud. Se ha demostrado
que el daño oxidativo causado por los radicales libres está relacionado con una amplia
gama de enfermedades y desordenes incluyendo: fallo cardiaco, inflamaciones cataratas,
daños cerebrales. Entre otros (Youngson, 2003).
Los antioxidantes impiden que otras moléculas se unan al oxígeno, al reaccionar-interactuar
más rápido con los radicales libres del oxígeno y las especies reactivas del oxígeno que con
el resto de las moléculas presentes, en un determinado microambiente como en la
membrana plasmática, citosol, núcleo o liquido extracelular. La acción del antioxidante es
de sacrificio de su propia integridad molecular para evitar alteraciones de moléculas como
lípidos, proteínas, ADN (Reitter, 1995).
Los flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales y que protegen al
organismo del daño producidos por agentes oxidantes, como los rayos ultravioletas, la
polución ambiental, sustancias químicas presentes en los alimentos, etc. Están ampliamente
distribuidos en plantas, frutas, verduras y en diversas bebidas y representan componentes
sustanciales de la parte no energética de la dieta Humana. Los flavonoides contienen en su
estructura química un número variable de grupos hidroxilo fenólicos y excelentes
propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, lo que les confiere una
gran capacidad antioxidante. Por ello, desempeñan un papel esencial en la protección frente
a los fenómenos de daño oxidativo, y tienen efectos terapéuticos en un elevado número de
patologías, incluyéndola cardiopatía isquémica, la aterosclerosis o el cáncer. Sus
propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia los radicales hidroxilos
y superóxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de
peroxidación lipídica (Jovanovic et al., 1998).
Los objetivos de la siguiente practica son; conocer una técnica de determinación de la
capacidad antioxidante en frutas y verduras y comparar la capacidad antioxidante de
diferentes productos (las muestras utilizadas en la práctica fueron la mora y fresa).
II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son un conjunto de sustancias de diferente composición y estructura
química, los cuales son capaces de neutralizar los radicales libres, grupos químicos
altamente inestables debido normalmente a la presencia de electrones desapareados. Estos
radicales libres pueden tener su origen en factores ambientales y biológicos. Entre los
factores ambientales se encuentran: radiaciones de media y alta energía (rayos ultravioletas,
rayos X y rayos gamma), componentes atmosféricos como el ozono, la polución, tabaco,
etc. ()

El sistema de defensa antioxidante está constituido por un grupo de sustancias que al estar
presente en concentraciones bajas con respecto al sustrato oxidable, retrasan o previenen
significativamente la oxidación de este. Como sustrato oxidable se pueden considerar casi
todas las moléculas orgánicas o inorgánicas que se encuentran en las células vivas, como
proteínas, lípidos, hidratos de carbono y las moléculas de ADN. Los antioxidantes impiden
que otras moléculas se unan al oxígeno, al reaccionar-interactuar más rápido con los
radicales libres del oxígeno y las especies reactivas del oxígeno que con el resto de las
moléculas presentes, en un determinado microambiente (membrana plasmática, citosol,
núcleo o líquido extracelular) (Venereo, 2002).

La capacidad antioxidante celular está dada por mecanismos a través de los cuales la célula
anula la reactividad y/o inhibe la generación de radicales libres. El antioxidante al
colisionar con el radical libre le cede un electrón oxidándose a su vez y transformándose en
un radical libre débil no tóxico y que en algunos casos como la vitamina E, puede
regenerarse a su forma primitiva por la acción de otros antioxidantes. Estos mecanismos
son adecuados a la muy corta vida media de los radicales libres y comprenden moléculas
pequeñas, endógenas y exógenas con capacidad antioxidante. (Rodríguez et al, 2001).
2.2. CLASIFICACIÓN DE LOS ANTIOXIDANTES

De las numerosas clasificaciones de los antioxidantes, se recomienda adoptar la que los


divide en: exógenos o antioxidantes que ingresan a través de la cadena alimentaria y
endógena que son sintetizados por la célula como se puede apreciar en el cuadro 1.

Cuadro 1. Clasificación de los antioxidantes.

Antioxidantes
Exógenos Endógenos
Vitamina E Glutatión
Vitamina C Coenzima Q
Betacaroteno Ácido tióctico
Flavonoides
Licopeno Cofactores Enzimas
Cobre Superóxido
Zinc Dismutasa
Magnesio Catalasa
Hierro Peroxidasa
Selenio
Fuente: .Rodríguez et al (2001).

Los antioxidantes exógenos provienen de la dieta, y dentro de este grupo se incluyen la


vitamina E, la vitamina C y los carotenoides. La vitamina C constituye el antioxidante
hidrosoluble más abundante en la sangre, mientras que la vitamina E es el antioxidante
lipofílico mayoritario. El selenio, el más tóxico de los minerales incluidos en nuestra dieta,
actúa junto con la vitamina E como antioxidante. La vitamina E se encuentra presente en
aceites vegetales, aceites de semilla, germen de trigo, maní, carnes, pollo, pescados y
algunas verduras y frutas, en tanto la vitamina C se puede encontrar en frutas y verduras.
Los carotenoides son compuestos coloreados tales como los betacarotenos, presentes en
verduras y frutas amarillas y anaranjadas, y en verduras verdes oscuras, los alfacarotenos en
la zanahoria, los licopenos en el tomate, las luteínas y xantinas en verduras de hojas verdes
como el brócoli, y las beta criptoxantinas en frutas cítricas (Avello & Suwalsky, 2006).
2.3. FRESA

La fresa es un fruto perteneciente a la familia Rosaceae. Se considera alimento


nutraceútico, por ser una buena fuente de compuestos antioxidantes especialmente
hidrosolubles, como antocianinas, ácidos fenólicos, vitamina C, entre otros, que tienen
funciones específicas como protectores de la oxidación de muchos organelos. Se ha
encontrado, en ratas, que una buena suplementación con jugos de fresa reduce la
propagación de tumores del esófago. El ácido elágico y sus derivados, de alta concentración
en la fresa, son preventores químicos que actúan estimulando la detoxificación de enzimas
y previniendo la interacción de especies carcinogénicas con el ADN (Restrepo et al, 2010).

El contenido de sustancias activas, entre ellas los antioxidantes, está controlado


genéticamente, pero su expresión fenotípica está condicionada por variables ambientales
como la luz, la temperatura, la humedad o el nivel de fertilización. Wang citado por
Carvajal et al (2012) evaluó el efecto de 4 combinaciones diferentes de temperatura
día/noche sobre la capacidad antioxidante de 2 variedades de fresa de día largo y
encontraron que las plantas que crecen en días fríos y noches frías (18/12 °C) generalmente
tienen menos ácidos fenólicos, flavonoides y antocianinas; un incremento en la temperatura
nocturna de 12 a 22 °C con la temperatura del día constante en 25 °C tiene como resultado
un incremento significativo en ácidos fenólicos, flavonoides y antocianinas; lo cual resulta
en un incremento significativo de la actividad antioxidante. (Carvajal et al, 2012).

2.4. MORA

Tarin (2015) expone que la mora (Morus sp.) es una fruta muy rica en compuestos
fitoquímicos, especialmente en polifenoles, como ácidos fenólicos y flavonoides. Las
moras presentan una fuente rica de ácidos orgánicos y compuestos monoterpénicos, dentro
del grupo de compuestos fenólicos, las clases más importantes son flavonoles (rutina,
quercetina, hiperósido) y antocianinas, seguido por los ácidos cinámicos (clorogénico,
cumárico, ferúlico), catequinas y ácidos benzoicos (ácido gálico y elágico).
La mora pertenece a la familia de las Moráceas y se encuentra distribuida por amplias áreas
de Asia, la cuenca mediterránea y zonas subtropicales de América y África. Dentro del
género Morus existen 24 especies, una subespecie y más de cien variedades, siendo las más
importantes la mora blanca (Morus alba), la mora negra (Morus nigra) y la mora roja
(Morus rubra). Tradicionalmente, el cultivo de la mora tenía como fin la producción de
seda y no ha sido hasta tiempos recientes cuando se han ampliado las posibilidades de
empleo de esta planta y sus frutos, siendo consumidos tanto en fresco como procesados
(Cervera, 2016).

Las hojas, ramas y corteza de la mora blanca (Morus alba) han sido utilizadas desde la
antigüedad en la medicina tradicional china para tratar la fiebre, mejorar la vista, fortalecer
las articulaciones, como diurético, para proteger el hígado y para disminuir la presión
sanguínea. Estudios con extractos de hojas de mora han mostrado alta actividad
hipoglucémica, hipolipidémica y antiaterogénica. Otras investigaciones muestran que el
consumo del fruto de la mora es beneficioso para la salud, especialmente contra la diabetes
tipo 2. Estos beneficios han sido relacionados con el alto contenido en polifenoles de la
mora, por lo que la posibilidad de extraer estos componentes para ser empleados como
nutracéuticos o como nuevos ingredientes para la fortificación y formulación de otros
alimentos, aumentando así su potencial antioxidante y con ello los beneficios para la salud
del consumidor, es un aspecto interesante a considerar (Cervera, 2016).

De esta forma, las fresas y las moras pueden tratarse de un claro ejemplo de alimentos
funcionales debido a que son alimentos que se consumen como parte de una dieta normal y
contienen componentes biológicamente activos, ofreciendo beneficios para la salud y
reduciendo el riesgo de sufrir enfermedades.

2.5. CONSERVACIÓN DE LOS ANTIOXIDANTES

Tarin (2015) nos explica que tanto la fresa como la mora presenta una vida útil y
estacionalidad corta, dificultando en gran medida el consumo de estas frutas durante todo el
año, además las condiciones de almacenamiento y distribución adversas hacen a los
compuestos bioactivos vulnerables a la degradación, causando una reducción en su
funcionalidad y disponibilidad. La extracción, encapsulación de compuestos bioactivos y
elaboración de nutracéuticos puede ser una posible solución a dicho problema. Los
procesos de encapsulación han sido utilizados como respuesta a la pérdida de viabilidad de
aquellos componentes activos que se encuentran en los alimentos funcionales, teniendo
como objetivo protegerlos de las condiciones del medio el cual hace que disminuya su
efecto beneficioso. Dicho proceso consiste en proteger un material activo que puede estar
en estado sólido, líquido o gas, cubriéndolos con un agente encapsulante.

Una de las opciones que Tarin (2015) nos da para la elaboración de nutracéuticos es
emplear la técnica de liofilización. Durante la liofilización, el producto se congela
convirtiendo la mayor parte del agua a estado sólido (hielo) que posteriormente es
eliminado mediante la sublimación a baja temperatura y presión, obteniendo finalmente un
producto en polvo concentrado con baja actividad del agua (aw). De esta forma, eliminando
el agua se retardan o inhiben los procesos de degradación bioquímicos del producto y por
consecuencia aumenta su estabilidad. Se trata de un método de deshidratación con un
especial interés debido a la sencillez del proceso, a la reducción de volumen del producto,
facilidad de manejo, y por ofrecer una calidad superior de producto final .Al llevarse a cabo
a bajas temperaturas se preserva el sabor, color y apariencia, asimismo reduce al mínimo la
degradación de la calidad nutricional del producto al no someterse a tratamientos térmicos.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES
 Muestras:
Fresas.
Moras.
 Materiales:
Tubos de ensayo.
Tubos Falcon.
Bolsitas negras.
Mortero.
Micropipeta de 20-200 µL.
Micropipeta de 100-1000 µL.
Papel tissue.
 Reactivos:
Metanol.
2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH)
 Equipos:
Agitador orbital.
Balanza analítica.
Centrífuga.
Espectrofotómetro.
3.2. MÉTODOS
 Extracción:
1. Tomar 5g de muestra (fresa/mora) y añadir 25 mL de metanol, HOMOGENIZAR.
2. Colocar en un tubo Falcon protegido de la luz y AGITAR por 15 minutos en un
agitador orbital.
3. CENTRIFUGAR el homogenizado por 15 minutos a 40 rpm.

a) b)

Figura 1: a) Centrifugado de la fresa, b) Centrifugado de la mora


 Reacción:
4. Tomar 2 alícuotas de 150 mL del extracto y añadir 2850 µL de DPPH.
5. Permitir que la muestra REACCIONE con el DPPH durante 15 minutos protegido
de la luz.

Figura 2: Reacción de las dos alícuotas de la muestra de fresa al adicionar el DPPH pasado
los 15 minutos
 Medición:
6. Transferir la solución a una cubeta y REALIZAR LA LECTURA a 515 nm.
7. Hacer un blanco con 150 mL de metanol.
3. RESULTADOS Y DISCUSIONES

El cuadro 2 muestra los resultados obtenidos de la medición de absorbancias a 515 nm del


blanco (metanol + DPPH) y de las muestras (mora y fresa). Se promedió en aquellas
muestras que se realizaron dos repeticiones. El método empleado fue de Brad –Williams et
al., (1995) el cual consiste en la reacción de compuestos de actividad antioxidante con el
radical estable (DPPH*) en una solución de metanol.

Cuadro 2. Registro de las absorbancias de las muestras obtenidas mediante el


espectrofotómetro a 515 nm.
Muestra A1 A2 Promedio
Blanco 1.002 - 1.002
Mora 0.078 0.076 0.077
Fresa 0.095 - 0.095

El cuadro 3 muestra los resultados de la disminución de la absorbancia debido al efecto


antioxidante (DPPHd - Am) como también la estimación de la actividad antioxidante en
equivalente de trolox (μg. eq. Trolox/g muestra) y el porcentaje de inhibición del radical
DPPH ((ΔA/DPPHd) *100).

Cuadro 3. Disminución de la absorbancia por el efecto antioxidante, equivalente de trolox


y porcentaje de inhibición del radical.
Muestra ΔA Equivalente de % de Inhibición del
Trolox radical
Mora 0.925 1286.06 92.32
Fresa 0.907 1261.17 90.52
Fresa
La fresa es un fruto perteneciente a la familia Rosaceae. Se considera alimento
nutraceútico, por ser una buena fuente de compuestos antioxidantes especialmente
hidrosolubles, como antocianinas, ácidos fenólicos, vitamina C, entre otros, que tienen
funciones específicas como protectores de la oxidación de muchos organelos (Kuskoski et
al 2005). Su contenido en estos compuestos está influenciado por diversos factores tales
como el genotipo, el grado de madurez, factores ambientales y las condiciones de
almacenamiento (Tarín 2015).

La capacidad antioxidante de la fresa se midió mediante la actividad atrapadora del radical


libre DPPH, el cual es un radical estable de color violeta, cuya absorbancia obtenida
mediante espectrofotometría disminuye al ser reducido por un antioxidante (Restrepo et al
2010). Asimismo, esta reacción se verificó al observarse una decoloración de la disolución
metanólica de DPPH. Según Restrepo et al (2010), para el método DPPH, cuyo mecanismo
funciona por transferencia de hidrogeno, las condiciones de pH bajas favorecen la
protonación del grupo fenólico.

El resultado obtenido para la muestra de fresa mediante el método indicado fue de 1261.17
μg. eq. Trolox/g muestra que expresado en moles del antioxidante sintético de referencia es
de 5.039 μmol. eq. Trolox/g muestra, el cual es mucho menor a los reportados por
Kuskoski et al (2005), quienes evaluaron la capacidad antioxidante de la pulpa de fresa
mediante el mismo método registrando valores de 9.2 y 10.5 μmol. eq. Trolox/g muestra a
los 30 y 60 minutos respectivamente, tiempos en los que cada muestra permaneció en la
oscuridad para su posterior medida de absorbancia. Esta diferencia entre los resultados
puede ser debido al tiempo y las condiciones a las que se tuvo la muestra evaluada. Según
Restrepo et al (2010) el factor tiempo de almacenamiento afecta significativamente la
capacidad antioxidante de las fresas, encontrándose una disminución en el contenido de
fenoles totales y en los valores TEAC por DPPH. Este fenómeno se asocia principalmente
con la degradación de compuestos propios del fruto, tales como: el ácido ascórbico y
elágico; antocianinas tipo p-cumaroil-glucosa, dihidroflavonol, quercetin-3- glucoronido,
kampferol y kampferol-3-glucoronido, y a la oxidación de los fenoles mayoritarios a bajas
presiones de oxígeno. La actividad antioxidante puede igualmente estar afectada por la
actividad del O2 el cual puede ingresar según la permeabilidad del empaque en la que
estuvo la muestra. Las enzimas polifenoloxidasas (PPO) tienen una alta actividad en fresa y
pueden consumir compuestos fenólicos, como ácido elágico, y de antocianinas tipo p-
cumaroilglucosa, dihidroflavonol, quercetin-3-glucoronido, kampferol y kampferol-3-
glucoronido, entre otros, generando productos del pardeamiento enzimático que tienen muy
poca actividad antioxidante.

Mora
En el caso de la mora, de igual manera se procedió con el método DPPH para el análisis. Se
midió por espectrofotometría la absorbancia de un blanco de reacción (solución de radical
libre sin extracto antioxidante) y la de las mezclas de reacción de las distintas muestras.
Consideramos la absorbancia del blanco como 100% y las absorbancias de las muestras se
expresan en referencia a ese valor. La pérdida de color del compuesto coloreado es
proporcional a su reducción y por lo tanto a la actividad antioxidante del extracto.
Al respecto, Cés (2016) menciona que al aumentar la concentración de Trolox, que es un
análogo soluble de la vitamina E, aumenta el porcentaje de reducción de DPPH. A efectos
prácticos se observa como el DPPH, de color azul en su estado oxidado, vira a un tono cada
vez más traslúcido, es decir, se reduce, a medida que aumentamos las concentraciones de
Trolox. Por tanto sabemos que el Trolox está provocando esta reducción, o lo que es lo
mismo está actuando como antioxidante.
En este ensayo hemos utilizado el Trolox como patrón, para así tener una referencia a la
hora de medir la capacidad antioxidante de mora.
Con el método DPPH para el análisis de mora se reportó un resultado de 1286.06 μg. eq.
Trolox/g muestra que expresado en moles del antioxidante sintético de referencia es de
5.1383 μmol. eq. Trolox/g muestra, valor que se encuentra muy cerca de lo registrado por
Kuskoski et al (2005) usando el mismo método por 60 min. El mismo autor explica que los
valores obtenidos en su estudio reflejan la cantidad y la reactividad de los antioxidantes
presentes en la muestra en determinado tiempo, se torna difícil establecer una relación
estructura-actividad y determinar los tiempos de reacción, toda vez que las muestras poseen
una composición compleja. Se hace necesario, por consiguiente, un estudio debidamente
extenso y específico en este sentido.
A pesar de la proximidad de lo reportado en contraste con la literatura, a nivel laboratorio
es muy posible que las experimentaciones arrojen datos erróneos con diferencias grandes.
Estas diferencias se puede deber a lo mencionado por Carvajal de Pavón et al. (2011) que
señala que la decoloración de la solución de DPPH aumenta regularmente con los
incrementos de la cantidad de fruta en un volumen determinado de solución. En la práctica
se usó una pequeña cantidad de fruta por lo que la decoloración no se dio rápidamente.
Carvajal de Pavón et al. (2011) nos menciona que la acción de la decoloración se atribuye
sobre todo a la presencia de polifenoles y ácido ascórbico extraídos en la solución y los
bajos valores de DPPH pueden ser debidos a la lentitud de la reacción entre este y las
moléculas del sustrato. Una serie de reacciones secundarias lentas pueden causar una
disminución progresiva de la absorbancia, por lo que puede no alcanzarse el estado
estacionario hasta al cabo de varias horas. Ciertos fenoles en el extracto tienen un potencial
Rédox más alto que el de los extractos de otras bayas. Debido a lo expuesto anteriormente,
podemos afirmar que la mora posee una gran cantidad de polifenoles y ácido ascórbico y
además reacciona satisfactoriamente ya que se obtuvo un valor cercano a la bibliografía.
Sobre su % de inhibición al DPPH, el valor obtenido en la práctica fue de 92.32%, valor no
tan cercano reportado por Torrenegra (2016) que obtuvo un valor de 79.16 ± 0.02%;
aunque los valores no estén cercanos podemos decir que la mora posee una gran capacidad
para inhibir radicales libres, probablemente la diferencia entre valores del laboratorio con lo
registrado en la bibliografía se deba a factores como el tiempo de exposición al ambiente, la
cual condujo a una disminución de la absorbancia y de la actividad antioxidante. Pokorny et
al. (2005) menciona que el contenido de polifenoles y de antocianinas presente en la mora
se encuentra en relación directa con la reacción de inhibición frente a radicales DPPH,
además tiene relación con el grado de madurez de la fruta.
4. CONCLUSIONES

- La capacidad antioxidante de la muestra de fresa se pudo cuantificar mediante el método


químico DPPH obteniéndose un resultado de 1261.17 μg. eq. Trolox/g muestra el cual fue
menor a los valores reportados por la literatura debido a las condiciones de la muestra
evaluada.

- En los valores del % inhibición de DPPH reportados en la presente práctica, tanto de fresa
como mora, están cercanos al 100%; por lo que se puede concluir que ambas bayas
presentan una gran capacidad de inhibir radicales libres por poseer una gran capacidad
antioxidante.

- Aunque la diferencia sea pequeña entre valores reportados, podemos concluir que la mora
presenta una mayor capacidad antioxidante que la fresa

VI. ANEXOS
VII. BIBLIOGRAFÍA

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