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Joint FAO/1AEA

PROGRAMA

PROGRAMA DE PRODUCCION Y
SALUD ANIMAL

PROGESTERONA

RIA KIT

Estos kits y protocolos fueron preparados por la unidad de produccion animal, laboratorios de Agricultura,
agencias de laboratorios, Seibersdorf, Austria, en colaboración de la corporación de productos de
diagnostico, Los Angeles U.S.A. con el soporte de los programas de producción animal y sección de
salud de el articulo FAO/IAEA. Division nuclear y técnicas relacionadas en alimento y agricultura.
1. INTRODUCCION
El kit Radioinmunoensayo de Progesterona (RiA) de la FAO y el OIEA fue
desarrollado y validado para el ganado en colaboración con la Corporación de
Productos de Diagnóstico para cumplir los siguientes criterios:

- Alto rendimiento y fiabilidad en condiciones extremas.


- Realizable con un conjunto mínimo de equipos en laboratorios de
contrapartida
- Aplicable a diferentes especies de ganado domesticado (es decir, ganado,
búfalo, ovinos, caprinos, camélidos, porcinos y equinos)
- Adecuado para plasma sanguíneo, suero y leche descremada.
- Rápido, simple, directo (ensayo no extractivo.

El método depende de la competencia entre la progesterona en muestras de


plasma, suero o leche descremada y de progesterona marcada con 126l "para un
número limitado de eslabones de unión sobre un anticuerpo específico de
progesterona inmovilizado (" revestido ") en las paredes internas de los tubos de
ensayo, ("Fase sólida") La proporción de progesterona marcada con 126l unida al
anticuerpo está inversamente relacionada con la concentración de progesterona
presente en el plasma / suero o leche descremada.

La técnica en fase sólida, en conjunto con la progesterona marcada126 como


trazador, es la combinación óptima para realizar progesterona RIA con alta precisión
en condiciones de laboratorio relativamente simples con un equipo mínimo, ya que la
separación de fracciones unidas a la forma libre implica sólo un Paso de decantación
simple, no se requiere centrifugación.
Después de la reacción y separación de la hormona libre, es posible calcular las
concentraciones de progesterona en la sangre o en la leche a partir de una curva
estándar derivada de la leche descremada o los estándares de suero.
La metodología del tubo revestido ofrece ventajas significativas sobre los ensayos
en fase líquida:
-Hay sólo dos reactivos para dispensar –la muestra y trazador(o estándar o QC) .
-No se require centrifugacion.
-No se require ni extraccion ni predilucion.
-El tiempo de incubación es corto; Sólo 4 horas a temperatura ambiente
(15 *C - 35 *C), o durante la noche en el refrigerador (4*C).
-sin pasos de lavado; Los tubos se pueden decantar vigorosamente sin pérdida de
material unido a anticuerpo. Esto da como resultado una clara separación de la
hormona libre, con una ligación (union) no específica despreciable.
- Los coeficientes de variación intra e interensayo son inferiores a los aceptables
para los inmunoensayos, es decir, <10% - y <15%, respectivamente.
-El antisuero es muy específico para la progesterona; La reactividad cruzada con
otros compuestos es muy baja.
-El kit ha sido validado en diferentes condiciones ambientales desfavorables y se ha
comprobado su estabilidad bajo altas temperaturas.
2. MATERIALES SUMINISTRADOS

A.Tubos recubiertos de anticuerpos de progesterona (en bolsas zip-lock “con


cierre”).
Los tubos de polipropileno recubiertos con anticuerpos de progesterona se
proporcionan con el kit RIA. Están envasados en bolsas con cierre cada 100 tubos.
Los tubos revestidos deben almacenarse refrigerados (2-8 *C): se mantienen
estables cuando se almacenan entre estas temperaturas durante 1 año si se
mantienen secos. Las bolsas deben sellarse con cuidado después de abrirlas.

B. Progesterona 125I tamponada (líquido amarillo).


El kit proporciona 105 ml de progesterona 125l tamponada en una botella de vidrio
con un tapón de goma. Esto debe almacenarse refrigerado a 2-8 *C (ver sección
4A).
C. Muestras de Control de Calidad Externo (EQC) (suministradas
periódicamente)
De vez en cuando, se incluirán en las normas dos muestras líquidas de suero bovino
EQC de diferentes concentraciones de progesterona (A y B) y dos muestras de leche
descremada liofilizadas (X y Y). Se recomienda que se analizen un mínimo de tres
veces en un ensayo (tubos duplicados de cada concentración al principio, medio y al
final del ensayo).
Un Servicio de Control de Calidad Externo fue iniciado en 1938 por el Laboratorio de
Agricultura del OIEA para ayudar a los laboratorios de contraparte a ganar confianza
en la exactitud del kit de progesterona FAO / IAEA. Las contrapartes deben
asegurarse de que el formulario de reporte que acompaña a las muestras de la EQC
se complete y devuelva a Viena antes de la fecha límite establecida. El laboratorio
enviará a cada laboratorio un informe confidencial (ver figura 4, página 25) sobre la
aceptabilidad de los valores de progesterona presentados y, cuando sea necesario,
aconsejará a la contraparte sobre las posibles formas de mejorar sus procedimientos
de ensayo para que sean más propensos a ajustarse A resultados analíticos
aceptables a nivel internacional.

D. Normas de progesterona en suero sanguíneo (también utilizadas para la


medición de muestras de plasma).
El kit contiene siete viales de estándares de progesterona en suero humano
procesado; Contienen azida sódica y gentamicina como conservantes. La
reconstitución de las normas no es necesaria; Están listos para ser utilizados en el
recibo. Las normas deben almacenarse refrigeradas; Son estables a 2-8 ° C durante
al menos 30 días después de la apertura. Los estándares proporcionados (Tabla 1)
cubrirán el rango fisiológico de concentración de progesterona prevalente en el
suero o plasma sanguíneo de la mayoría de las especies ganaderas domesticadas.
Para convertir nmol / litro en ng / ml (nanogramos por mililitro) dividir por 3.18.

Tabla 1. Normas de progesterona en suero suministradas con el kit de


radioinmunoensayo FAO / IAEA (en nmol / L y ng / mL)
E. Normas de progesterona en leche descremada.

El kit contiene siete viales de estándares de progesterona liofilizados en leche


descremada procesada (Cadbury's "Marvel"); Contienen azida sódica como agente
antibacteriano. Para reconstituir estas normas, añada exactamente 1 ml de agua
destilada (pH 6,5-7,5) a cada vial, deje reposar durante un mínimo de una hora en el
banco y luego agite suavemente. Las normas deben almacenarse refrigeradas; Son
estables a 2 a 8 ° C durante al menos 30 días después de la reconstitución. Los
estándares proporcionados (Tabla 2) cubrirán el rango fisiológico de concentración
de progesterona prevalente en la leche descremada de la mayoría de las especies
de ganado domesticado. Para convertir nmol / litro en ng / ml (nanogramos por
mililitro) dividir por 3,18.

Tabla 2. Normas de progesterona en leche descremada suministrada con el kit de


radioinmunoensayo FAO / IAEA (en nmol / L y ng / mL)

3. EQUIPO NECESARIO PARA REALIZAR EL ENSAYO


A. Una pipeta de microlitro (preferiblemente un tipo de volumen fijo con puntas
de plástico desechables) para suministrar 100 μl de patrones y muestras en los
tubos de ensayo.
B. Se requiere un instrumento dispensador múltiple manual (por ejemplo, una pipeta
Eppendorf 4780) o un dispensador de pipeta-diluyente adecuado para suministrar 1
ml de agua destilada (para reconstituir la preparación de leche desnatada estándar
liofilizada) y para suministrar 1 ml de la progesterona 125l.
C. A foam decantation rack to hold the coated tubes for the pipetteting steps, and
for decanting the excess reagents after the reaction can be provided upon request
from the Agency's Laboratories.
D. Un mezclador “Vortex”
E. Un contador gamma manual de un solo pozo para laboratorios que ensayan
<200 muestras por semana. Para los laboratorios que analizan un mayor número de
muestras por semana, se recomienda un contador manual de múltiples pozos.

4. MANEJO DEL KIT


A. En recibo
Registre el número de lote y la fecha de llegada en un libro de registro adecuado, e
inspeccione su contenido para ver si hay daños en el envio.
Guarde los componentes del kit a 2-8 *C en un refrigerador diseñado para materiales
radiactivos entrantes.

B. Consideraciones de seguridad
El kit contiene material radiactivo y otros ingredientes que requieren ciertas
precauciones:
1). Se ha añadido azida sódica a concentraciones de 0,2 g / dl o menos a
ciertos componentes como agente anti-bacteriano. Para evitar la
acumulación de azidas metálicas explosivas en las tuberías de plomo y
cobre, los reactivos deben desecharse en las aguas residuales sólo si se
diluyen y se enjuagan con grandes volúmenes de agua. Utilizar sistemas
de drenaje sin cobre y sin plomo cuando sea posible y contaminar
ocasionalmente con hidróxido de sodio al 10%, o comercialmente
neutralizar, por ejemplo, Fisher NeutrAzide (Cat No. CS-208).

2). El personal de laboratorio debe estar familiarizado con las precauciones estándar
para el uso de materiales radiactivos, es decir, la protección radiológica, la
manipulación, la eliminación y los procedimientos para completar en caso de
derrames de dichos materiales. En el Apéndice I se ofrece información básica sobre
el tratamiento y la eliminación de 126I.

3). Una Hoja de Datos de Seguridad de Materiales relativa a los componentes del kit
se puede encontrar en el Apéndice II.

5. RECOMENDACIONES PARA LA COLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DE


MUESTRAS
A. MUESTRAS DE SANGRE
La sangre se extrae de la vena yugular o de la cola del ganado, lo cual se consigue
más convenientemente utilizando tubos evacuados sin conservante (para el suero) o
con heparina o EDTA como anticoagulantes (para el plasma).
Las muestras de sangre para la recolección de plasma deben almacenarse a 4 *C
(en un baño de hielo) inmediatamente después de la recolección (se debe tener
cuidado para evitar la congelación). Con el fin de minimizar la degradación
enzimática de la progesterona, la sangre debe ser centrifugada dentro de 4 horas, a
aproximadamente 2.000G (véase la fórmula siguiente) durante 15 a 20 minutos, y el
plasma congelado.
Las muestras de sangre para la recolección de suero deben coagularse antes de
enfriar y posteriormente procesarse como se ha indicado anteriormente.

Es poco probable que la hemólisis leve influya en los valores de progesterona.

Fórmula: Estimación de la fuerza centrífuga relativa (RCF).

Donde,

RCF = relative centrifugal force (G) fuerza centrifuga relativa


r = rotating radius (cm) radio de rotacion
N = rotating velocity (rpm) velocidad de rotacion
Se recomienda utilizar rotores horizontales y cubos de ángulo libre. Cuando se
utilizan rotores fijos, se debe tener cuidado de no aspirar las células sanguíneas.

C. Muestras de leche
El muestreo y el procesamiento de la muestra pueden tener una influencia
importante en las concentraciones de progesterona en la leche. Para
obtener resultados fiables, por lo tanto, es de suma importancia aplicar un
esquema de muestreo lo más coherente posible:
i) Utilizar muestras de leche de la misma etapa de ordeño (preferiblemente
leche compuesta o strippings”o partes”).
ii) Añadir un conservante [1 comprimido de sodio-azida (100 mg) o 1 dicromato
(100 mg) por 10 ml] en la leche entera.
iii) Centrifugar la leche a 2.000G (para el desnatado de la grasa) a la misma
temperatura cada vez (preferiblemente 4 * C, si se dispone de centrífuga refrigerada)
durante 15 minutos. La centrifugación debe hacerse lo antes posible después del
muestreo; Sin embargo, pueden transcurrir unos pocos días entre la recogida y la
centrifugación sin afectar negativamente al valor de progesterona de una muestra.
iv) Saque la leche descremada de la siguiente manera:
a) Si la leche se centrifuga a temperatura ambiente, se coloca en el refrigerador
durante 15 minutos para endurecer la capa de grasa.
b) Utilizar una varilla de vidrio para perforar la capa de grasa.
c) Transfiera toda la muestra de leche descremada al vial de almacenamiento
usando una pipeta pasteur.
v) Las muestras de leche desnatada con conservante se pueden almacenar de
una de las siguientes maneras:

 4°C estable durante almenos 3 meses


 Profundamente congelado Indefinidamente La leche entera no debe
ser congelada
 Rm. Temp. Estable a 37 ° C durante 2 semanas

D. MANTENIMIENTO DE REGISTROS

1) MUESTRAS
En el momento de la recolección de las muestras es importante registrar el
número de animal y la fecha en el tubo de recolección (no en la tapa) además
en un diario permanente junto con la información pertinente que se utilizará
más adelante para evaluar el estado reproductivo Del animal. La cantidad
mínima de información que debe registrarse es la fecha del calendario y el
número de identificación del animal. Siempre que sea posible, se registrará
información adicional, como la edad, el sexo, la raza y cualquier otra
información pertinente sobre la historia del animal, como la fecha de cría, la
fecha de parto, el celo observado, etc.

Además, la siguiente información podría ser considerada para el libro de


registro del ensayo, dependiendo de la naturaleza del experimento, o la razón
para recolectar muestras:

Hora del dia Si se va a recoger más de una muestra en un día determinado, o si


hay razón para esperar una variación diurna significativa en la concentración
hormonal.

Numero o código del proyecto- Si se está realizando más de un proyecto en


un laboratorio dado.

Nombre o código del operador si más de un operador es responsable de


recoger las muestras.

Tratamiento experimental- Si se está llevando a cabo un experimento en el que


se tratan animales de tratamiento y de control, es esencial un código para el
tratamiento dado al animal. Para evitar el sesgo en el ensayo de las muestras, es
apropiado codificar los tratamientos para que el ensayo no sepa qué tratamientos
se asignaron a qué animal. Una alternativa es que las asignaciones de tratamiento
se registren sólo en el libro de datos principal, y utilizar sólo el número de
identificación de los animales para el registro del ensayo.

2) Resultados del ensayo

Es importante mantener registros completos de los resultados del análisis para


consultas futuras. Siempre que sea posible copias deben hacerse de los resultados
y estos se presentan en otro lugar. Vea a continuación (sección 7) para la
explicación de los cálculos del ensayo y la grabación.

3) Control de calidad interno

Sólo se puede asegurar un buen rendimiento de ensayo consistente si se realizan


controles periódicos del equipo (pipetas y contadores gamma) y de los valores de las
muestras internas de control de calidad que se incluyen en cada ensayo. (Véase
más adelante, sección 8)

6 .PROCEDIMIENTO RADIOINMUNOENSAYO

A. Asegúrese de que las muestras y otros componentes del ensayo estén a


temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo.
B. Etiquetar los tubos con recubrimiento de anticuerpos para los estándares, IQC (y
EQC cuando están incluidos) y muestras como se indica en la Figura 1. Se deben
usar tubos de plástico normales (no tubos recubiertos de anticuerpos) para los tubos
Total Count (TC). Utilice dos tubos para cada punto de curva estándar, TC y valor de
control de calidad.
Complete las secciones pertinentes de la hoja de registro de un ensayo (véase el
ejemplo, Figura 2, página 23).
C. Mezcle cuidadosamente (no agite) las muestras de suero, plasma o leche
descremada, los estándares y el control de calidad antes del ensayo.
125| Standar o
Tube No. contenido - P4
muestra

1 TC 1000
2 TC 1000
3 B 1000 100
4 B 1000 100
5 STD # 2 ~ B 1000 100
6 STD # 2 ~ 1000 100
7 STD
B #3 ~C 1000 100
8 STD # 3 ~ C 1000 100
9 STD # 4 ~ D 1000 100
10 STD # 4 ~D 1000 100
11 STD #5 ~ E 1000 100
12 STD # 5 ~ E 1000 100
13 STD # 6 ~ F 1000 100
14 STD # 6 ~ F 1000 100
15 STD # 7 ~ G 1000 100
16 STD # 7 ~ G 1000 100
17 !OC ! 1000 100
18 !OC ! 1000 100
19 !OC ! 1000 100
20 !OC ! 1000 100
desconocido 1000 100
!OC ! 1000 100
!OC ! 1000 100
!OC ! 1000 100
!OC ! 1000 100
desconocido 1000 100
!OC ! 1000 100
!OC ! 1000 100
199 !OC ! 1000 100
Dax 200 !OC! 1000 100

Figura 1. Lista de componentes a añadir a cada tubo de ensayo, y el volumen (en


uL)

E. Pipetear 100 μl de cada uno de los estándares, QC y muestras en el fondo


de los tubos correspondientes.
Use los estándares de leche descremada para medir la concentración de
progesterona en la leche y los estándares de suero cuando se mide la
concentración de progesterona en plasma o suero.

Para obtener los mejores resultados, asegúrese de tocar la punta de la


pipeta contra la pared lateral del extremo inferior del tubo antes de
retirarla.
tubos de ensayo con recubrimiento de anticuerpo

E. Pipetear 1 mL de 126l-progesterona a cada tubo en los 5 minutos siguientes a


la adición de las normas, QC y muestras. Si se dispone de un sistema de
pipeta dispensador-diluidor, es posible añadir normas, QC o muestras
simultáneamente con la radiomarcadora.
En este ensayo, los ligandos competidores (progesterona no marcada y
progesterona marcada con 126) se exponen a sitios de anticuerpos más o
menos al mismo tiempo, y la competencia para los sitios de unión es
esencialmente igual.
Esto es distinto de un ensayo "secuencial" en el que se permite a los
antígenos no marcados el acceso a los sitios de unión del anticuerpo muy
antes del antígeno radiomarcado. Dicho ensayo "secuencial" requiere que
el antígeno radiomarcado sea capaz de retirar competitivamente (es decir,
desvincular) una cierta proporción del antígeno no marcado, que
normalmente tarda más (24 a 48 hrs) a conseguir.
Con la práctica puede usarse una única "curva estándar" para ensayar 200
tubos sin causar un error significativo debido al cambio (denominado
deriva) en las características del ensayo.

F. Cubrir los tubos con parafilm o papel de aluminio e incubar durante la noche
en un refrigerador (4 * c).
Es importante que las condiciones de incubación sean consistentes de
ensayo a ensayo.
En los casos en que se necesita información rápidamente, la etapa de
incubación puede acortarse a 4 horas a temperatura ambiente; Sin embargo,
la variación puede aumentar, y los errores en las estimaciones de muestras
desconocidas y controles de calidad pueden ser más altos de lo normal.
Overnight refrigerated: refrigerado durante toda la noche
Or: o
4 hours room temperature: 4 horas a temperatura ambiente

G. Después de la incubación, decantar vigorosamente todos los tubos (excepto


TC que debe colocarse en un estante separado) en un recipiente de
eliminación de residuos radiactivos apro Sosteniendo el bastidor boca abajo,
golpee los tubos bruscamente hacia abajo sobre papel absorbente. Dejar
escurrir durante 2 a 5 minutos y volver a golpear bruscamente hacia abajo
para eliminar las gotas residuales.
Permanecerá algo de humedad, pero no es necesario intentar limpiar el
interior de los tubos.

Hard: duro, dificil

H. Contar la radioactividad en todos los tubos durante un tiempo fijo (50 segundos o
un minuto) en un contador gamma. Si se utiliza un contador manual de un pozo,
asegúrese de que la posición de los tubos en el pozo se mantenga constante.

El número de conteos dependerá de la eficiencia del contador gamma. La eficiencia del


contador debe medirse a intervalos mensuales usando una fuente de calibración 125I
simulada (por ejemplo, barra 291-NES 211S-New England Nuclear) y un registro
permanente de los valores mantenidos en un libro de registro. (Véase en el Apéndice III una
guía sobre cómo medir la eficacia contraria).

I. Calcular el porcentaje máximo de unión en el ensayo (Bmax) dividiendo los


recuentos medios por minuto (cpm) de los dos tubos cero y estándar (B0) por el
promedio de cpm de los dos tubos TC y multiplicar por 100 Véase la ecuación).
Average: promedio
Of: de

TC es una medida del estado del trazador. Un valor de recuento total inferior a
12.000 - 15.000 cpm indica una necesidad de precaución en la interpretación de los
resultados del ensayo
B máx. Es una medida de lo bien que funciona el ensayo (es decir, cómo se une la
progesterona al anticuerpo recubierto sobre los tubos). Si este valor se modifica por
debajo del 20-25%, el rendimiento del ensayo debe considerarse insatisfactorio y el
ensayo se deroga.

J. Calcule el porcentaje de valores de unión para todos los estándares, muestras y


tubos de QC dividiendo cada cpm de estos tubos con el de los tubos estándar cero y
multiplicando por 100 (vea la ecuación)
Donde B / Bo es el porcentaje del estándar, muestra, para QC unido por el
anticuerpo en comparación con Bmax.

K. Usando el papel gráfico logit-log suministrado con los kits, trace el porcentaje
promedio de unión (B / Bo) en el eje vertical (y) y la concentración estándar de
progesterona en el eje horizontal (x). Dibuje una línea recta (mejor ajuste) a través
de los puntos del gráfico.
No dibuje una línea recta entre cada coordenada x, y dibuje una mejor recta a través
de todas las coordenadas. Las concentraciones de progesterona de las muestras y
los Controles de Calidad pueden entonces medirse leyendo su porcentaje de valores
enlazados e interpolando desde la curva estándar hasta la concentración de
progesterona en el eje x (Ver Figura 3).
Alternativa. Se puede utilizar un programa informático apropiado para calcular los
resultados.
Simple: muestra
Percent bound: limite porcentual
Quality control parameters: pzrametros de control de calidad
Samples: muestras
Binding:union

Figura 2. Ejemplo de una hoja de datos de ensayo para registrar resultados


con datos de un ensayo de plasma.
Figura 3. Esto ilustra la hoja gráfica logit-log suministrada con el kit RIA FA0 / 1AEA. Para calcular las
concentraciones de progesterona del QC y las muestras desconocidas, trace el porcentaje de unión para
cada duplicado de la curva estándar a lo largo del eje y, y la dosis estándar de progesterona a lo largo del
eje x. Dibuje una línea recta que mejor se ajuste a los puntos a lo largo de la curva. Las concentraciones
de progesterona desconocidas de las muestras pueden entonces estimarse colocando un borde recto en el
gráfico en el porcentaje de unión de la muestra particular, y luego girando el borde recto en el punto donde
intersecta la línea de la curva estándar. El valor a lo largo del eje horizontal es la concentración de
progesterona, en nanomolares de progesterona por litro (o, si esa figura está dividida en 3,18, nanogramos
por ml).

Run number: numero de ejecucion

Figura 4 Ejemplo de gráficos de control de calidad internos para las muestras ICC I y
II
Figura 5. Ejemplo de informe de control de calidad externo
(EQC). La muestra de plasma, que contenía 7,70 nmoI / L de
progesterona, fue enviada a laboratorios de contrapartida. El
valor medio reportado por estos laboratorios fue de 7,77
nmol / L (línea horizontal sólida), con intervalos de
confianza (2SD) de 6,53 y 8,89 (líneas horizontales rotas).
Los laboratorios individuales están codificados (números en el
eje horizontal) y están representados por estrellas y
cuadrados en el gráfico. Los laboratorios con resultados fuera
de los intervalos de confianza (outliers) están representados
en el gráfico por cuadros
7. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Concentraciones de progesterona
Las concentraciones de progesterona sérica, plasmática o láctea pueden
utilizarse como una ayuda para controlar el inicio de la pubertad, la actividad
ovárica posparto, los ciclos de celo y el embarazo en animales domésticos.
Se sugiere que los investigadores establezcan sus propias pautas para estos
propósitos basándose en la correlación entre la concentración de progesterona
y los datos fisiológicos / clínicos obtenidos de los registros, la observación del
estro, el apareamiento o Al, la palpación rectal, la ecografía, etc.
La investigación sugiere que existen diferencias en las concentraciones de
progesterona en diferentes estados fisiológicos tanto dentro como entre
diferentes especies y razas. Por lo tanto, no es prudente extrapolar los
hallazgos de un laboratorio a otro. Es una buena idea para cada laboratorio
establecer concentraciones de progesterona indicativas de la función del
cuerpo lúteo en sus propios rebaños animales. Por ejemplo, las
concentraciones de progesterona tienden a ser más bajas en Zebu que en el
ganado europeo, y aún más bajas en los búfalos que en los bovinos tipo Zebu.
8. GARANTÍA DE CALIDAD DE ENSAYOS

El propósito de la garantía de calidad es minimizar la posibilidad de resultados


erróneos al alertar al investigador sobre posibles inexactitudes o problemas en
la medición de los niveles hormonales. Implica el control de calidad de equipos,
reactivos y procedimientos de ensayo.
Aunque las técnicas de radioinmunoensayo son muy sofisticadas y confiables,
es posible que funcionen mal, y el investigador siempre debe cuestionar la
validez de sus resultados. Si un ensayo da valores incorrectos, se pueden
sacar conclusiones erróneas, y se pueden tomar decisiones de manejo
inapropiadas.
El control de calidad de los procedimientos de ensayo, los reactivos y el equipo
se consigue mediante la precisión y exactitud de la monitorización.

A. Control de calidad de ensayos


1) Precision
La precisión de un ensayo se define como: "Una medida de la variación en
la estimación de una muestra, por ejemplo, el coeficiente de variación
dentro del ensayo (dentro del ensayo)" (véase más adelante la definición).
Alternativamente, esto puede ser explicado como el rango de valores
posibles obtenidos por un ensayo para el valor verdadero de, 1 muestra. Si
la variación del ensayo es grande, entonces el rango de valores obtenidos
para el valor verdadero será grande. Es decir, si el valor real de una
muestra es 10, y el ensayo varía tanto como 20%, los valores de ensayo
obtenidos pueden variar de 8 a 12 para esa muestra.
El coeficiente de variación intra-ensayo se mide generalmente analizando un numero
de muestras (pueden ser muestras reales, o muestras del "control de calidad") varias
veces, y calcular el coeficiente de variación para cada una de las muestras. La
variación aceptable dentro del ensayo es <10% (véase página 32).
El coeficiente de variación se define como: "La desviación estándar de las
estimaciones múltiples de una muestra, dividida por la media de las
estimaciones múltiples, multiplicada por 100".
PROMEDIO DE Veinte Repeticiones DESVIACION ESTANDAR
6.9 0.61
%CV= (0.61/6.9) X 100 =8.8

2) PRECISION

La precisión de un ensayo se define como: "La capacidad de un sistema de ensayo


para evaluar el verdadero valor de una muestra". Es decir, la capacidad de estimar la
concentración de una hormona en una muestra que es idéntica a la concentración
real de hormona en la muestra, de acuerdo con los mejores métodos disponibles
que sirven como patrones de referencia. Puesto que pocos métodos son absolutos
en sus determinaciones, un método aceptable para probar el acuerdo entre los
valores de una muestra obtenida por radioinmunoensayo y el "verdadero valor" de la
muestra es preparar una muestra grande de la piscina y evaluar el valor de la
muestra por una variedad De los métodos y compararlos. Si hay un acuerdo
razonable entre diferentes métodos, entonces el valor obtenido debe ser
aceptablemente cercano al "valor verdadero" (ver comparación de métodos en la
sección 9).

3) VARIACION ENTRE ENSAYOS

El "inter-ensayo" o entre la variabilidad del ensayo es extremadamente


importante ya que su control es la única manera de asegurar que los
valores de progesterona de una serie de muestras procedentes de un
animal reflejan su "condición clínica" y no la variación debida a la deriva
entre ensayos. Para abordar esta cuestión, se alienta a las contrapartes a
redactar gráficos 'inter-ensayos IQC' para los siguientes parámetros:
Recuentos totales; B9 - unión máxima; 20%, 50% y 80% de los valores de
enlace del gráfico logit-log; Pendiente o el gráfico logit-log;
Concentraciones absolutas de progesterona de 9 IGC I (bajo) e IQC
II (medio) muestras.
Con el fin de hacer muestras de control interno de calidad (IQC), se deben
recoger dos grandes charcos de sangre o leche (por ejemplo, 1 litro por
piscina) de las especies de ganado en estudio. Normalmente, las piscinas
nixed deben hacerse a partir de varios animales en diferentes condiciones
reproductivas De tal manera que las piscinas tienen probabilidades de tener
concentraciones "bajas" o "medianas" de progesterona.
La reserva baja debe tener un valor cercano al utilizado para diferenciar entre
la presencia y la ausencia de actividad lutel. La piscina media debe tener un
valor cercano al esperado durante la fase media de lutel.
El material debe ser tratado y centrifugado de la misma manera que las
muestras desconocidas. Alícuotas de un ml del suero.
El plasma o la leche desnatada se pipetean a continuación en botellas / viales
tapados adecuados y 1) se congelan por congelación (-18 * C) o 2) se congelan
y se congelan (-10 * 0) dependiendo de las instalaciones. Luego, cada vez que
se realice un ensayo, se descongelará o reconstituirá un vial de cada una de
estas muestras de IQC con 1 ml de agua destilada según sea apropiado. Estas
muestras se incluirán entonces en cada ensayo de rutina (al principio y al final
del tubo de muestra Secuencia) y los valores de progesterona trazados en un
simple gráfico de series de tiempo. (Ver Figura 4).

Evidentemente, cuando el valor de la muestra de control interno de calidad


varía considerablemente con respecto al valor medio, debe existir alguna duda
sobre la calidad del ensayo y, por tanto, debe repetirse. Los límites aceptables
(media ± 2 DE) sólo pueden calcularse después de haber completado un
mínimo de 10 ensayos. Por lo tanto, grandes volúmenes de material IQC
necesitan ser recolectados, tratados y divididos en alícuotas para asegurar que
se puedan realizar chequeos internos de calidad a largo plazo.
B. Control de calidad del equipo
Las verificaciones regulares de las pipetas se pueden hacer fácilmente
pipetando el agua en un pequeño vaso colocado en un equilibrio tared. Las
pipetas se suministran normalmente con pistones internos de repuesto,
resortes y juntas y por lo tanto cuando se detectan imprecisiones / no
confiabilidad, las partes de trabajo internas de la pipeta pueden ser
reemplazadas. Tenga en cuenta el orden de las partes internas de la pipeta al
desmontar, y asegúrese de calibrar después de volver a montar.

La eficacia del contador gamma 3 tiende a disminuir con la edad y el uso. En


Apendice III de este protocolo se encuentra una guía práctica para el recuento de
126L utilizando el Detector Mini 6-20 Weil. La única pieza de equipo necesaria para
medir la eficiencia de un contador gamma es una varilla de calibración que puede
adquirirse del OIEA. La eficiencia del contador gamma debe ser superior al 50%;
Cuando la eficacia del contador disminuya 10 por debajo del 40%, debe informarse
al Oficial Técnico del OIEA y debe considerarse la posibilidad de adquirir una unidad
de reemplazo.