Maduraci6én del ARN El ADN se transcribe en ARN mensajero y éste se traduce en polipéptido. En células nucleadas, como las humanas, entre transcripcion y traduccién el ARN sufre diversas modificaciones no de los grandes problemas [ que tiene planteados Ia biolo- gia molecular es el de averi- ‘guar cémo eélulas que poscen el mismo juego de genes pueden fabricar lotes de proteinas diferentes. Salvo contadas ‘excepciones, es probable que todas las ceélulas de_un organismo_pluricelular contengan la misma informacién gené- tica, impresa en las cadenas de nucle6- tidos que conforman su ADN. La se- cuencia de nucledtidos del ADN pre- senta las instrucciones para fabricar las protefnas encargadas de realizar todas Jas funciones celulares. Seria I6gico pensar, por tanto, que todas las células de un organismo pluricelular fabricaran las mismas proteinas. La realidad, no obstante, es que cada tipo celular fabri- ca s6lo cierta parte de las proteinas que su. ADN determina. ,Qué tipo de con- trol se ejerce sobre el aparato genético para que cada tipo celular fabrique una serie especifica de proteinas yen las cantidades adecuadas? Las células de los organismos pluri- celulares son eucariotas, esto es, po- seen un nucleo diferenciado. En el inte~ rior del mismo, la secuencia nucleotidi- \ ca que denominamos gen (segmento de ADN que determina una proteina) se transeribe en una molécula de ARN. Posteriormente, el ARN pasa del nti- cleo al citoplasma circundante, donde se traduce en protefna. Por tanto, en células eucariotas pueden existir va~ rigs niveles de regulacion genética: por ejemplo, qué segmento de ADN se vaa itranscribir en ARN, qué secuencias de las transcritas se transportarin al cito- plasma y cual seré Ia tasa de traduccién de un ARN determinado. No. cabe duda de que en la regulaci6n de los genes eucariotas desempenia un papel importante el control en el nivel de la transcripcién y la traduccion. Sin em- bargo, hasta 1975 se sabfa muy poco de lo que le ocurre al ARN desde que se ‘transcribe, en el nicleo, hasta que se traduce en el citoplasma 30 James E. Darnell, Jr. A finales de la década de 1970 se sos- pechaba ya que el paso de ARN prima- rio, 0 recién transcrito, a ARN men- sajero (ARNm) “maduro”, tal como se requiere para la tradueci6n, ex tas_manipulaciones imprescindibles: adicién de diferentes estructuras en ambos extremos del ARN y moditica- cidn quimica de ciertos nuclestidos. Sin embargo, mucho més interesante fue descubrir que, con cierta frecuencia, tuna vez transcrita la molécula de ARN, ésta podia suftir cortes y empalmes, disminuyendo su tamaio y quedando, por tanto, ARNm mensajero més corto. A veces, incluso, una misma mo- leécula de ARN, segiin los tipos de cor- tes y empalmes que sufra, puede dar lugar a diferentes ARNm ‘maduros y, ep Val (etaae are TERTTCAACETT |. EL GEN QUE DETERMINA UNA PROTEINA es una secuencia de nuckeétdos (A, en del globina beta derton, una de las dos eadenas de 2 Secvenel informa [La secunci indicada corresponds dos que componen a hemoglabing Hs Lev Wye Asp Oys Hs Leu Gu Ser Leu. Ser ss CTTATASC TRESS por tanto, a diferentes proteinas. Estos procesos de cortes y empalmes diferen- ciales podrfan ser una forma de control genético, y en algunos casos se ha de- mostrado que Io son. Cabe también que la maduraci6n post-transeripcional sea necesaria para muchos ARNm, eto que s6lo en ciertos casos consti tuya una forma de regulacién. No obs- tante, la existencia de un proceso de maduracién del ARNm ha afiadido una nueva dimensién al fenémeno de la ex- presién génica, lo que de por sf ya es un avance significativo. Ademés, ha gene- rado interesantes hipdtesis sobre el ori- zen de genes y oélulas. ‘Como el ADN, el ARN es un polt- ‘mero cuyas unidades bisicas, o moné- ‘meros, son los nuclestidos. En el ARN Gy Aen Met deel le achat es interrumpld por dos intron” er) Al Phe TH Gly ys. Leu var tev Gi {os tres sepmentosinformativs ¢ denominan “exones” coor. Los aminadeies que compones a cade. ‘8 de globina beta eindican juno ls correspondientesnucistae, Pars que el mensaie genética sehay cuatro nuclestides: adenina, citosi- na, guanina y uracilo, abreviadamente ‘A, C, Gy U. (Enel ADN, la timina, 7, oeupa el lugar de U.) Cada nuclestido consta de una base nitrogenada y un anicar de cinco carbonos, normatmen- te designados con nimeros. La unién entre cada pareja de nucletidos veci- nos se lleva a cabo mediante un grupo fosfato, que establece un enlace entre elearbono 5 del azticar de un nucleoti- do y el carbono 3" del nucleétido adya- cente. La molécula de ARN presenta, pues, direccionalidad: un extremo es 5’ yel otro 3” \ ‘Cuando ta polimerasa de ARN copia una region de una de las cadenas del ADN, cada nuclestido afiadido a la molécula de ARN guarde una relaci6n de complementariedad con su corres- pondiente en el ADN. Dada su estruc- ura molecular, los muclestidos solo pueden formar’ enlaces de hidrogeno con uno de los otros tres. Asi, tnica- mente se pueden dar enlaces de hidré- geno entre Cy Gy entre Ay U (0 7) Son estos enlaces de hidrégeno entre bases complementarias los que permi- ten a las dos cadenas del ADN formar tuna doble hélice. Del mismo modo, un \\ segmento de ARN puede formar una ‘Transcripcién del ADN La transcripcién del ADN en ARN se lleva a cabo con el concurso de una polimerasa de ARN, enzima del que existen tres tipos en las células encario- tas, El enzima se une al ADN en el sitio preciso para iniciar la sintesis del ARN y selecciona el primer nuclestido, que se convertird en el extremo 5" de la ca- dena de ARN. A continuacién, se des- plaza répidamente por la cadena de ADN, afiadiendo los nuclestidos co- rrespondientes a la cadena de ARN. Segiin se forma, el ARN se va separan- do del ADN, comenzando por el extre- mo 5°; no obstante, hasta que no se ha egado al extremo 3° no se separa la molécula completa de ARN. ‘olécula bicatenaria con un segmento de ADN, si las bases de ambos son complementarias. Hay, por tanto, complementariedad entre el ARN y el segmento de ADN de donde se copia. Al conservar, pues, la informacion impresa en esa parte del genoma (dotacidn genética), el ARN se constituye en portador de las instruc- ciones que determinan la secuencia de aminoscidos de una proteina. Dichas instrucciones, en clave, se descifran leyendo los nuclestidos de tres en tres Cripletes"), y cada triptete de nucleo tidos, que determina uno de los 20 ami- nodcidos existentes, recibe el nombre ée codén, Durante la traduccién, a me- ida que se leen los codones, se van siiadiendo los aminodcidos correspon- dientes a la proteina gue se est for- mando, Los tres tipos de ARN EI ARN mensajero, cuya fancién es determinar proteinas, no es el tinico tipo de ARN. Hay, al menos, otros dos +tipos principales, cada uno de los cuales desempeita un papel importante en Ia sintesis de proteinas. El ARN ribosé mico (ARNr) forma parte del riboso- ‘ma, orginulo citoplasmitico que hace las veces de plataforma para la tradue- cin. Blribosoma consta de dos subu dades, denominadas grande y pequeiia Cada subunidad contiene una molécula de ARNry de25 a 50 moléculas de pro- teinas. El ARN de transferencia (ARN?) hace las veces de anzuelo mo- lecular, cuya misién consiste en colocar aminoicidos en el extremo de la protef- nna; hay muchos ARNt diferentes, y cada uno reconoce a un aminodcido concreto, En el ribosomase forma un complejo entre el ARN de transferencia, el ARN ‘mensajero y los enzimas encargados de engarzar el aminodcido correcto en la cadena proteica y hacer avanzar el complejo para leer el siguiente codén. De este modo, en la sintesis de una pro- teina, el ARNt y el ARNr desempefian papeles reiterativos, siguiendo las ins- trucciones del ARNm. En las cétulas traduzeaen protean, a informacincontenida en el ADN debe transeribirse ‘en otra molécua, de ARN. Para obtener un ARN mensajero (ARN) con it secuencainformativa correcta deben eliminarse los introes. La presencia de Introne es una caracteristicn de oe genes de ella ecariota, clues guy Feaveno ‘ARN mAacaD0. ae 5, PRIMER EJEMPLO DE MADURACION DE ARN, encontrado en ARN. En las clas de mamife- tos; lamayor parte del ARN estale se encuentra ene lena, Una canta bastante rds pequeta de [ARN estable se encuentra en el nucleol, un organulo nuclear. El tamabo de una mvéeua de ARN se tide en razsn des movildad cuando Se centrifuga a alta vlgcldad. La uniéad de tamato, cuando Ulla exe proceaiient, se exprea en S(unidades Svedborp). Los tres tpos "ARN estables sn los [ARK 18S 285 y los peuetos ARN Experimentalmente pueden Inorporarse nuceitides radactivs en las moléalas de ARN recénsintelizadas; se logra as determinar su tamaio. En ls experiments Sobre madurackn de ARN, ‘nce minatos cul de manifer se expusieron a prcursores radiactivos 0 ‘adiatividad apareia en ARN nlear de tarls tamatos 2). Tras 28 fran parte dela radbcividad se encontraba en una mlécula nuclear de 488 @), A ls el ‘ls inutos, ‘marcads fe les aid el antbicoacinomicina, que inibe la snes de ARN (2). Desapareca la radlactividad elas moléculas 485 y aparecia en el citplas en molésila 18 y 28S. EL ARN 45S parece, por tanto, lin precursor que se corta antes deakcnaar el leplsma, origina formas menores stables de ARNT. 55‘smo De corTE SSEPARADOR 6. PRECURSOR DEL ARN RISOSOMICO en cdulas eucariota. Incuye madurscin, Las auevos mé0- dos de secuondiacion de ADN y ARN han permitide mostrar deforma precisa lamanera en queef ARN prmsario, queen clulas humanas tiene una cons> ‘ante de sedimenticln de 485, se converte, tas un proceso de maduracin, ‘en ARNr de 18S y 285. La estructura general de casi todos les ARN riboséai- ‘es "espacladores” ques llminan durante escasamente duran 30 minutos en el ci- toplasma, ‘Adems de su interés tedrico, la exis- tencia de la secuencia poli(A) supuso una gran ventaja desde el punto de vista experimental, en los_trabajos sobre maduracién de los ARN men- sajeros. Y ello se debe 2 que una molé- cela de ARN puede ser “pescada” por ssucola de poli(A). Se consigue esto sin- tetizando un homopolimero (cadena formada por un solo tipo de nuclest do), y Henando una columna vertical de cristal con fibras de papel que flevan adherido dicho polimero. Normalmen- te se utiliza un homopolimero de To de U. A continuacién se hace pasar por la ‘columna todo el ARN celular. Las se- cuencias poli(A) de los extremos de los ARN hibridardn con el homopolime- 10 y quedarén retenidas en la columns, EL ARN poli(4)”, en su mayoria ARN de transferencia 0 ribossmico, atravie- sa la columna, sin ser retenido, Gracias esta técnica, denominada cromato- fgrafia de afinidad, se pudo aislar el ARNm de una célula eucariota en forma quimicamente pura idad de ARNm purifi- descubrieron otras dos etapas del pro- ceso de maduracion. En 1974, Robert P. Perry, del Instituto para la Investiga- cién del Céncer, encontré que el ARNm de células animales no contenia s6lo los cuatro nuclestidos habituales. Algunos nucledtidos de la cadena apa- recian metilados, esto es, posefan gru- pos metilos (CH) de més. Bernard ‘Moss, del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, Aaron J. Shatkin, del Instituto Roche de Biolo- gia Molecular, y Kin-Ichiro Miura, del Instituto Nacional de Genética’ del Japén, hallaron que algunos nuclesti- dos del ARNm virico también estaban metilados. Con el enzima ribonucleasa se pudo determinar dénde estaban, en el ARN ‘mensajero, las estructuras metiladas ‘més significativas, Las ribonucleasas 56 ‘SEPARADOR SEPARADOR rompen enlaces entre nuclestidos adya- centes de la cadena de ARN, produ- ciendo una coleccién de nucledtidos sueltos, cada uno de ellos unido a un fosfato. Sin embargo, cuando se afi dian ribonucleasas al ARN vitico meti- lado, ademés de muclestidos libres, sé encontraba una estructura compleja que inclufa varios grupos fosfato, Tras ser sometida a muchas pruebas quimi- cas, se conace ya la composicién de esa estructura resistente a la ribonucleasa Tal estructura, la “caperuza”, esta si- tuada en el extremo 5’ de todos los ARNm de células eucariotas observa- dos, a excepcién de ciertos ARNm de virus. El componente més caracteris co de la caperuza es una guanina (G) metilada. La guanina aparece unida al extremo 5’ del ARN mediante un enla- ‘ce que contiene tres grupos fosfato Los adenovirus nos ensefian En la misma linea de trabajo seguida con Ia historia de la poliadenilacién, nuestro grupo (ahora en la Universidad Rockefeller), junto con los de Perry y Shatkin, intents determinar sise coloca la caperuza al ARN en el nicleo. Des- cubrimos que, efectivamente, habia en- zimas que afiadian la caperuza al extre- mo 5! libre de la cadena naciente de ARN en el micleo, antes de que la poli- merasa transcribiera las primeras 20 bases. 1 grupo de Moss ha aislado re~ cientemente el enzima que aiiade la ca~ peruza, Al contrario que la cola de poli(A), todos los ARNm llevan cape~ raza, No se conoce bien la funcién que cumple ésta, aunque parece que facilita In traduccién, Como todos los ARNm Ia evan, no parece que el hecho de po- nérsela sea una forma significativa de regulacién genética. El descubrimiento de los provesos de poliadenilacion y de adicién de caperu- zas hizo centrar nuevamente nuestra atencién en la relacién existente entre ARNhn y ARNm. Se conocia ya la si- militud en la composicién de bases de Jos dos tipos de molécalas. Cuando se es ARN $385 se une al ARN 285 por ‘Tas dos formas esables de ARN gue se encuentran em los ribosomes xs primariosewcariotas es similar; tn que aqut se muestra corresponde un laces de hidrogeno, ebeniéndo- purificaron ARNhn y ARNm polisémi- co, mediante cromatografia de afi dad, se vio que ambos tipos de molécu- las llevaban caperuza en el extremo 5" y cola de poli(A) en el 3°, Por tanto, si el ARNhn era el precursor del ARNm, los extremos de la molécula debian conservarse durante el proceso de ma- uracién y transporte al citoplasma. Sin embargo, los ARNhn eran, por térmi- ‘no medio, unas cinco veces més largos ‘que los ARNm polisémicos. Esta dife- rencia se podia explicar si, a la vez que se conservaban los extremos, se elimi- nase un segmento central del ARNhn. Sin embargo, en 1976, a los bidlogos rmoleculares la idea les parecia inverosi- mil, si no imposible. En menos de dos afios, la remota po- sibilidad results ser eierta para el eas0 de las células eucariotas. Gran parte del trabajo realizado con ta intencién de demostrar que el ARNm era una versin més corta del ARNhn se hizo utilizando adenovirus como parte del sistema experimental. Los adenovirus, al igual que otros virus, producen infec- ciones del aparato respiratorio en seres humanos. El proceso de infeccién por adenovirus ha sido objeto de detenida investigacion. En particular, se. conoce bastante bien la pauta de replicacién el ADN virico en el nicleo celular, las proteinas que determina y Ia secuencia ‘con que se fabrican. Los adenovirus ran, por tanto, un buen candidato ala hora de estudiar o6mo se sintetizaba ARN espectfico del virus en el nticleo celular y mo maduraba hasta ARNm. El genoma del adenovirus es una mo- lécula de ADN bicatenario de unos 36.000 nucledtidos de largo. La posi cin de cualquier secuencia de nuclesti dos en el genoma virico se indica gene- ralmente en relacién a un mapa lineal de 100 unidades, en el que cada unidad representa 360 nuclestidos. Llamamos 0 al extremo izquierdo del mapa y 100 al derecho. A las ocho © diez horas de haber entrado el virus en una cétula bu- mana, empieza a fabricar copias de supropio ADN. Las protefnas viticas se Clasifican con relacién al momento en que se replica el ADN. Las proteinas “tempranas” se sintetizan antes de que se replique el ADN. El pequefio grupo de proteinas “intermedias” se sintetiza aproximadamente cuando se va a repli- car ol ADN. Las proteinas “tardias” lo hacen principalmente cuando la repli- cacién esté en curso. La mayoria de las proteinas que forman la estructura de la particula del virus son proteinas tar- dias. Entre éstas se citan las protefnas hhexén, as{ lamadas por formar parte, en la cépside, de estructuras hexagona- les, Son el componente mayoritario de la cubierta externa del virus. Las investigaciones sobre la madura- ion del ARN mensajero se concentra- ron sobre las proteinas tardias de los adenovirus. El trabajo se apoy6 funda- ‘mentalmente en el empleo de restricta- sas, grupo de enzimas cuyo descubri- miento, @ principios de los setenta, ‘caus6 un gran impacto en biologia mo- lecular. Cada retrictasa corta ADN 0 ARN en una secuencia especifica de ‘cuatro a seis nuclestidos de largo. Un genoma concreto tiene un nimero fijo de sitios restringibles, es decir, sitios donde el enzima corta el ADN. Por tanto, las restrictasas se pueden utilizar para cortar una molécula de ADN en fragmentos reproducibles. Cuando se ‘dentifican los sitios restringibles, los fragmentos se pueden ordenar de suer- te que cada uno de ellos ocupe una po- sicién en un mapa lineal del genoma vi rico. Por la hibridacién hacia el progreso Es obvio que disponer de una colec- cin ordenada de fragmentos de ADN incrementa enormemente el poder re- solutivo de la técnica de hibridacién molecular. Si se mezclan moléculas de ARN mareadas con un conjunto orde- nado y conocido de fragmentos de ADN, el patrén de hibridacién que re- sulta indica con gran precisiGn el sitio dl genoma a partir del cual se ha trans- crito el ARN. Con esta formidable téc- nica intentamos determinar silos ARN ‘mensajeros para proteinas tardias de los adenovirus se transcribfan dentro del miicleo celular como un largo y tinico segmento, suftiendo luego una fragmentacién en trozos menores, 0 si, por el contrario, se transeribjan ya en tunidades de tamafo aproximado al de Jos mensajeros. Una vez comenzada la transcripcién del ARN vitico, se expontan oéhulas in- fectadas con adenovirus a nuclestidos ivos por un breve periodo de mt GREP exam | mene 3 4 ‘ wopee 5 6 mv PPP AON 7. CAPERUZAS ¥ COLAS se afiaden al ARN primar durante las etapas Inia de la maduracion del ARN. Una ver que Ia polimerasa de ARN ha transerito alrededor de 20 nucleotides, ciertosenzimas nuclearesagregan una estructura molecular al etremo S ibe del ARN (I, 2). Esta “aperuza”™ ‘oust de una guanine modificada (G) unida al ARN por wn enlace formade or tres grupe estate (P)- Al avanzarlapolimeraa por el ADN, transcribe ln secvencla AAUAAA, que desempeta un papel importante ena adicién pos terior de na “cla” de nucletidor de adenina A, denominad pK) G). El [ARN sufre un corte unas 20 ases ms alld del scuencia AAUAAA (4), Se ‘ade s continual e poll), formado por 1500200 adennas, al extrem0 3 de la cadena (3) Estas estructura de os extremes se conservan en las ‘tapas posterores de a maduracn; la parte central del ARN se modifies. 7tiempo, suficiente para que sélo unos pocos precursores mareados se pudie- sen incorporar a cada cadena de ARN, En una poblacidn de células infectadas se encuentran polimerasas de ARN en casi cualquier posicién del ADN virico gue sirve de moide para transcribir el ARN, Si a estas células sc les suminis- tra nucleétidos radiactivos, la radiacti- vvidad se encontrard en los extremos de tun conjunto de moléculas de ARN de longitudes diferentes. El més corto de Jos ARN marcados tendré los nucledti- dos radiactivos muy proximos al sitio de iniciacién de la transcripcién. Tam- bign se observarén moléculas més lar- 828, y la mayor de ellas tendra Ia ra- Giactividad cerca del punto donde acaba la transcripcién. ‘Realizado el experimento, se extrajo de las células el ARN marcado, se se- paré segiin tamafios y se hibridé con tuna coleccién conocida de fragmentos de ADN del adenovirus. La hibrida- cién molecular nos permite probar la hipétesis sobre Ia génesis del ARN mensajero. Siel ARNm para proteinas tardfas se transcribia en pequefias uni dades, correspondiente a ARNm indi- viduales, obtendrfamos una pauta com- pleja de hibridacién, en la que las mo- Ikculas cortas de ARN hibridarfan con el ADN en las proximidades de cada uno de los sitios de iniciacion de la transcripcién. ‘Consideremos ahora lo que ocurti siel ARN mensajero de proteina t se transcribiese como una sola unidad, que posteriormente se cortase en tro- 20s. En este supuesto, habria sélo un sitio de iniciacin de la transcripci6n, y el mis corto de los ARN hibridaria s6l0 8. ADENOVIRUS, virus que caus lnfeeciones dl aparato respiratorio superior en sreshumanos, Se ‘muestra agui un equema de su compscin. Fst virus ha tenido un gran protagonisio e as primeras Investigaciones sobre maduracian de ARN, y= que hata enfonces ao se habia aisado adn ningin RNa de ctulas de mamifero, La cablerta externa del adenovirus ets compuesta por molculay de proteina,slendo su componente priacpal las denominadas protenashexdn, sobre todo la 2, 3,4y IX. Enel interior hay una moléeulabletenaria de ADN con una longited aproximada de 36.000 maces. ‘Una ver dentro de una edlula humana l views se replica, traserbiendace ademte un peguen numere de mmoléulas de ARNm. Posteriormente el virus usurpale maqulnaria de snes de protelna dl hospeda dor pare fabricar protenas 2 partir de sus propios ARNm. Lar protinashexon forman Parte de ‘grupo de proteinas “trdias" que se sinfetizan cuando el ADN virco ha emperado 2 repicarse, 38 EG con el fragmento de ADN proximo al tinico sitio de iniciacién, Los ARN mareados de mayor longitud hibrida- rian en las correspondientes posiciones intermedias de la unidad de transcrip- ci6a. Cuando se realizé el experimento yel ARN en cuestién se hibridé con el ‘ADN de adenovirus, el ARN mas corto hibrid6 s6lo en una posicién, junto a la unidad nimero 16 del mapa. Los ARN ‘més largos se esparcian hacia la dere- cha de la unidad 16, de acuerdo con su tamatio. Concluimos, por tanto, que el ARN mensajero para proteina tardia se transcribia como una sola unidad, em- pezando su transcripcién junto a la po- icin 16 del mapa. Cartografia genética Los experimentos realizados por dos grupos de jévenes investigadores, uno de ellos en el laboratorio de Cold ‘Spring Harbor y otro en el MIT, permi- tieron conocer el proceso de madura~ cin del ARN primario correspondien- te @ la unidad de transcripcidn de las protefnas tardias. Richard J. Roberts y Richard E, Gelinas, de Cold Spring Harbor, encontraron que todos. los ARN mensajeros de proteinas tardias de adenovirus tenfan una misma se~ cuencia de once nucleétidos junto a la caperuza 5’. En el caso del ARNm de tuna de las proteinas hex6n, Philip A. Sharp, Susan M, Berget’y Claire Moore, del MIT, encontraron que dicha secuencia comin, situada junto a Ja caperuza, se comportaba de una forma extrafta en los experimentos de hibridacién. Cuando el ARNm de la protefna hexdn se mezclaba con ADN, se formaba un hibrido, visible al mi- croscopio, de unas 4500 bases de largo, en el centro del genoma virico, Sin em- bargo, de la estructura bicatenaria cen- tral sobresalian dos colas. Por el extre-~ mo 3" destacaba la secuencia poli(A), que, segin lo previsible, no hibridaba, pues no procedia del ADN del virus. Por el otro extremo del ARN mensaje~ 10, la secuencia 5” comiin también so- bresalia del hibrido en forma de cola monocatenaria. ‘Amos grupos vieron répidamente la posibilidad de que las secuencias 5” procediesen de otra parte del genoma del adenovirus. Sharp, en el MIT, y también Thomas R. Broker y Louise T. Chow, en Cold Spring Harbor, mez ron muchos ARNm de proteinas tar- dias con Ia coleccién de fragmentos co- nocidos de ADN y obtuvieron un resul- tado inesperado: cada ARNm hibrida- ba en cuatro sitios diferentes del geno ma vitico. Formaban un hibrido en unsitio concreto y especifico, que corres- pondia a Ia secuencia determinante de ja proteina. Ademés, todos los ARNm, independientemente de la posicién que cupase la secueneia determinante, for- aban hibrides en las posiciones 16, 20 y 27. Los resultados sugerian que los ARNm de protefnas tardias eran en realidad un mosaico fabricado a partir de tres secuencias comunes a todos ellos y otra més con la informacion ge~ nética especifiea de cada uno. Gracias a los trabajos recientes de varios investigadores, entre los que se ineluyen Heschel J. Raskas, de la Fa- cultad de Medicina de la Universidad de Washington, y Joseph R. Nevins y Edward Ziff, de ia Universidad Rocke~ feller, se ha conseguido saber c6mo se forman los ARNm de adenovirus a par- tirde las secuencias comunes y las espe cificas. En estos trabajos se ha puesto claramente de manifiesto que la unidad de transcripeién correspondiente a las proteinas tardias es una pieza biol6gica de gran complejidad. Sabemos ahora que en una célula de mamffero infecta- da por adenovirus, el producto princi. pal de la transcripcién, tras la replica- cin del ADN, es la unidad de trans- cripeién correspondiente a las protei- nas tardias, y que dicha unidad leva se- cuencias que determinan la sintesis de 13 0 14 proteinas tardfas. Esta unidad de transcripcién abarca desde la posi- cién 16 del mapa, hacia la derecha, hasta casi la 100. Proximo a la unidad 16 hay una secuencia nucleotidica, de- nominada promotor tardio, cuya fun- cién es inducir el inicio de Ta transcrip- cién por parte de la polimerasa. En las posiciones 16, 20 y 27 se encuentran las secuencias comunes obscrvadas por Sharp, Broker y Chow. De la 27 a la 100 se hallan las secuencias determi- nantes o informativas (aquéllas que lle~ van la informacién especifica para cada proteina). Estas secuencias informativas estin distribuidas en cinco grupos, denomi- nados LI, L2, L3, L4 y LS (ordenados de izquierda ‘a derecha en el mapa). Cada grupo comprende las secuencias necesarias para sintetizar una “familia” de proteinas “emparentadas”. En el ex- ‘remo derecho de cada grupo existe un sitio susceptible de sufrir poliadenila- én. Por ejemplo, el grupo L2 abarca, aproximadamente, desde la posicién 40 hasta la 50, y justo ahi esta el siti donde se puede colocar una secuencia oli(A). En toda la unidad de transcrip- ‘ion hay, por tanto, un sitio para la ca- Peruza en la posicion 16, y un total de ‘cinco sitios susceptibles de poliadenila- cién. UNIDAD DE TRANSCRIPCION TARDIA > oe a a i oo ] l ] E 00 10 IL IL ° 2 “0 60 20 4 TRANSCRIPCION ¥ ADICIN DE LA CARERUZA cm | CORTE EN EL SrTiO POLADENILABLE C x > 1 Ao08 9st pow c Baw J) A prices remuras eau ww 2 Ae | tin Maun C 9, UNIDAD DE TRANSCRIPCION TARDIA DEL ADENOVIRUS, con varios sitios susepibies de polladenlaldny una ampli gama de pautasposbles de madurackn, A pari de ella se pueden fabricar ‘ensalers para mas de una docena de profetnas ards. Una unidad de ranscripelén es un segment de [ADN que ses transerto de forma contin La que nos ocupase extlende desde la postin 16 hasta cast 4 100del mapa lineal del ADN vires, en cl que cada unad representa 360 muclestdes. En todos los ARNm tardies hay secuencias complementaris a las posiiones 16, 2027. Desde a posiisn 30 hasta ‘asa 00 hay secuenclas que determinan protenastardias, agrupadas en famflas,arnadasL1,L2,13, ‘Lay LE. Cade fall condenesecuencia para varas proteins “eparentadas”. Em el extremo derecho de Cada una de las falas hay un sito susceptible de olladallackn, que es comin para todos los ‘miembros del grupo. Al poco de comenzar la anscrpein se atade a caperuza al extremo Sa poie- asa de ARN transeribed la unidad completa. Otros ensimas se encargan de elegr uno de Tos cinco posbles sito de plladenac6n, earn la cadena nuclenidca por esto elegy anaden Ia cola de pollA)- En nuestro ejemplo hemos legldo a failla 2. En este caso, seeliminan las Secunclas eompren- Sida ene las positones 16,20 27 y entre tty la familia L2” Dentro dela familia se sleclona, Sudemds, una de las posible secuencas lformativas que comlene. Se descomoce en quest basa a eeclon, ‘el sitio que se va. polladeniar y dea allerativa de maduracin que se vaa seguir. ELARNm mado onria de In capertza, las seeuenelas comunes (siuadas en 16, 20 y 27) la especfca y ln cola, Todas las secuencias que determinan la sintesis de alguna de las familias de proteinas poseen una organizacién si- milar, con zonas que se solapan. La zona donde se solapan dichas secuen- cias es la situada en el extremo derecho de cada grupo; todas ellas incluyen la secuencia de nucledtidos adyacentes al de, por tanto, una sola de las posibles secuencias informativas. La maduracién del mensajero ‘Tras muchos experimentos, ha podi- do desvelarse el proceso de maduracién del ARNm. La transcripcién se inicia sitio donde se coloca la cola de poli(4). Hacia el centro de cada grupo, sin em- bargo, la secuencia informativa diver- ge: cada miembro de Ia familia encierra tun segmento diferente de nucledtidos enel centro de Ia unidad. Cada molécu- lade ARN mensajero formado a partir de la unidad de transcripcién compren- enel promotor tardio y avanza desde la posicién 16 hacia ta derecha, Una vez transcritos los primeros nucledtidos, se afiade la caperuza al extremo 5’ del ARN que cuelga. La polimerasa avan- za hacia la posicion 100, atravesando los cinco sitios susceptibles de poliade- nilacién, Durante este proceso, ciertos 59‘enzimas cortan el ARN en uno de los sitios poliadenilables y le colocan la cola de poli(A). Por tanto, la primera molécula de ARN formada durante el proceso de maduracién inciuye todas las secuencias existentes entre la posi- cidn 16 y el sitio poliadenilable estogi- do para cortar. Por ejemplo, sil sitio elegido es el L2, el ARN incluir la se~ cuencia que va desde ta posicién 16 hhasta la 50; asi, junto con la familia de secuencias 12 iré también la LI, pero no la £3, L4y LS. El ARN mis alla de 2 (ineluyendo los grupos L3, L4y L5) parece destruirse en el nicleo y nunca se utiliza como mensajero. EI ARN nuclear poliadenilado, en este estado de maduracién, compren- de, pues, varias secuencias “separado- ras”, que no van a formar parte del ARNm maduro. Las secuencias separa- doras se climinan enziméticamente en ‘un proceso que puede durar de 20.8 30 minutos. Durante este tiempo se elimi- nan las secuencias LI y los segmentos que van de la posicin 16 a la 20 y de la 20.a1a27, quedando s6lo las secuencias Ccomunes situadas justo en las posicio- nes 16, 20 y 27. El resultado final es tuna molécula con un grupo de posibles secuencias informativas. En nuestro ejemplo habiamos elegido la familia 2, que cuenta con tres posibles se- ‘cuencias informativas. De las tres sola- mente una es la elegida, en un proceso en el que intervienen ciertos enzimas encargados de climinar de este ARN tun segmento de tamaiio variable, segin sea Ia secuencia elegida. Lo que queda al final es el ARNm maduro, con la ca- peruza 5’, las secuencias 5’ comunes, la cola de poli(A) y una sola secuencia in- formativa. Las secuencias nucleotidieas com- prendidas entre las posiciones 16 y 100, en el genoma de adenovirus, consti- tuyen un ejemplo extremo de To que es una unidad de transcripcién compleja A pattir de ella, y segtin el proceso de ‘maduracién que se siga, se puede origi- znar mas de un tipo de mensajero madu- ro. Por el contrario, una unidad de ‘transcripeién simple s6lo da lugar a un tipo de ARNm. En adenovirus, la com- binacion de varios sitios susceptibles de poliadenilaci6a junto con un mecanis- mo de maduracién diferencial puede dar lugar a una considerable coleccién de proteinas tardias a partir de una sole sunidad de transcripeién. Es obvio que Ia existencia de malt ples sitios poliadenilables, o bien una maduracién diferencial, pueden, por sf solos, dar lugar a una unidad de trans- cripeién compleja. En oélulas eucario- tas se han encontrado muy pocas unida- des de este tipo, y todas, excepto una, evan exclusivamente varios posibles sitios de poliadenilacién. Solo una pose, ademés, un mecanismo de ma- duracién diferencial: la unidad corres- pondiente a la cadena pesada dela pro- ‘eina miosina de la mosca de la fruta En el genoma de rata, Ronald Evans, Michael Rosenfeld y su colegas, del Instituto Salk de Estudios Biol6si- [7 sraieecvomn —Tarcbefennvere ; ee La SI wow een ey a) T Lee eee Merl sopeonesatra eer Muster ay (Sh; (She tay ¥ Pecan aeanieanieasccesecnerasanid neces ry MUCHOS ARNm DE =a Er SERS EES 10. UNIDAD DE TRANSCRIPCION SIMPLE, a partir dela cal slo produce un tipo de ARN. Ata lageerda se esquematina cl proceso de maduracin; 4 la derechs, algunes ejemplos ls organismos ‘donde se han encontrado. Lz trancripcion comienza en sl sto de iniinion” acaba en elt de termina EL sto poiadenilable «el punto donde se empalma la cola 3” de poi). A veces Polmerasa de ARN se para ene sito polladenlabe en otras Ia transeriplon va mas alla de aicbo sitio 2). fen ln moléulatraocrta cnet secvencias uo tnformativs intercaladas (rpacadore) = pueden produce corts yempalmes, rigndndese un ARN maduro ms cart (3). La mayria de les Undades de trunseripein encontradas en fll 60 ‘de manifers son simples, como la aq indicads. cos, han encontrado una unidad de transcripei6n con dos sitios potiadenila- bles. La unidad incluye secuencias in- formativas para dos proteinas: la hor mona cakitonina, sintetizada en el roides, y un neuropéptido recién descu- bierto, ‘una hormona del sistema ner- vvioso sintetizada en la pituitaria. Las dos proteinas poseen idéntica “cabeza” (elextremo amino de la protefna), aun- que diferentes “colas” (el extremo car- boxilo). En las células de la glandula ti- roides se selecciona el primero de los sitios poliadenilables, fabricindose la calcitonina. En las céfulas de la glandu- Ia pituitaria se selecciona el segundo, y se fabrica el neuropéptido. Los trabajos realizados desde 1975 han puesto de manifiesto que, en las o&- Tulas eucariotas, la regulacién de los genes podria efectuarse a través de la maduracién del ARN. No esté claro, sin embargo, el grado de importancia de este mecanismo como forma de re- gulacién genética. Para la mayor parte de los genes cucariotas, la. principal forma de regulacién parece seguir sien- do el control de la transcripcion. Ade~ més, la mayoria de las unidades de ‘ranscripcién cucaridticas_conocidas son unidades simples, que determinan una sola protefna. Exones ¢ intrones El proceso de maduracién afecta in- cluso a las unidades de transcripcién simples, en cuanto es necesario elimi- nar las’ secuencias separadoras. Una ver abjerto el camino con los trabajos de los adenovirus, se pudo comprobar ‘que en los genes eucariotas las secuen- cias que se expresan (exonés) también aparecen a veces interrumpidas por se- cuencias de nuclestidos que no se tra- ducen (intrones). Este tipo de genes fragmentados se han encontrado en eu- carioras tan poco emparentados como las levaduras y el hombre, En todas las células se necesita un mecanismo de “cortar_y empalmar” (maduracién) para obtener ARN mensajero sin intro~ nes y con los exones correctamente tni- dos y listos para la traduccién. Los me- ccanismos de maduracién del ARN tie- nen, por tanto, una ampli difusion entre los eucariotas. Los genes fragmentados eucariotas representan una diferencia notable con respecto a los genes de los procariotas. En las células procariotas los genes no cstin fragmentados, y los fragmentos adicionales de ADN que se puedan en- contrar son répidamente desechados del genoma, La idea, largamente man-tenida, de que los eucariotas evoluci naron 2 partir de organismos unicelula- res parecidos a las actuales eélulas pro- cariotas implicarfa, de ser cierta, que fos intrones. se introdujeron en los genes procariotas durante el curso de la evolucién, No obstante, Carl R. Woese yy sus coleges, de la Universidad de IUi- nois en Urbana-Champaign, han pro- puesto que los eucariotas no descien- Gen de los procariotas y que existen dos lineas evolutivas procariGticas igual- ‘mente antiguas. Woese argumenta que las tres lineas evolutivas distintas des- cienden de un tinico precursor, que 1 denominé progenote (“anterior a la cé= Tula”). El andlisis detallado de los intrones, de genes eucariotas apoya la tesis de que los eucariotas no han evolucionado a partir de los proceriotas. En primer lugar, los intrones de algunos genes eu- cariotas se encuentran alli desde hace muchisimo tiempo. Por ejemplo, en la hemoglobin, molécula portadora de oxigeno, hay dos tipos de cadenas pro- teicas: las globinas alfa y beta. Las se~ cueneias de aminoscidos de las dos ca- denas difieren, aunque ambas estin plegadas adoptando una estructura si- milar en la molécula de hemoglobina. Sus estructuras son también muy pare- idas a Ia de la mioglobina, proteina que capta oxigeno en las eélulas muscu- leres. ‘A pesar de sus analogias estructura les, las diferencias en la secuencia de aminodicidos de las globinas alfa, beta y la mioglobina sugieren que los genes de las tres proteinas divergieron a partir de un precursor comiin hace quizé 1000 millones de afios. Los tres genes poseen ‘tres exones separados por dos intrones en posiciones idénticas en los tres casos. Mientras que las secuencias dé aminodcidos han divergido, 1a ordena- cién de los intrones parece haberse conservado, por lo que los intrones po- ddrfan muy bien estar en su sitio desde hace 1000 millones de afios. ‘Es més, cuando se examina la estruc- tura tridimensional de una proteina, a menudo se encuentra que la cadena de proteina se puede dividir en segmentos funcionalmente diferentes; tales seg- ‘mentos se denominan regiones funcio- nales. Muchos intrones dividen a tos, ‘genes en segmentos, cada uno de los ‘cuales determine una regién funcional diferente. Por tanto, si los intrones se hubieran introducido al azar en un ge noma preexistente, tuvieron el notable efecto de dividir a los genes en segmen- tos funcionalmente diferentes. Parece as probable que los intrones estuvie~ remor wnimicen = 7 fresno ae oF eGR 5 aa Ay As T cscs ators sR 3 ; & met ca See 11, UNIDAD DE TRANSCRIPCION COMPLEJA, a partir de la cual se puede produc més de un [ARNe y, por tanto, mis de una proteins La presencia de dos ms sos polladenllables pueden deter ‘minar na anidad complela (DSi a unidad se corta pore primer sto polidenabe, se fabrica un 'ARNm se carta por el oto, se fabrica otro ARNm diferente. Ea una unidad de transcripcin con wh tole si pliadenlable puede darse mas de un tipe de madura tipo de maduracion que se elja 2). Las unidades comple con EL ARNm qu se fabriea depende del de un sito pliadenilable som comt- ‘es en virus han encontrado también en clas de mamifros. Enos views se han observado unidades ‘cm astemat de madurachn deren se esas silo hay un easo conocido en elas eucarotes. Las tnidades de transcripcioncomplea, como las aq deserts, pueden inegrarse en genes dels clas Iospedadarasyexpresarse umto con los genes de éts. (Las dbus son de Jerome Kuhl € sen donde estin quiz desde el princi- pio de la evoluciOn y que los exones, responsables de las regiones funciona- les, evolucionaran independientemente unos de otros. Encl principio fue el ARN Apoyados en estos y otros experi- mentos, W. Ford Doolittle, de la Uni- vyersidad de Dalhousie, Nueva Escocia, Darryl C. Reanney, de la Universidad de Latrobe, Australia, y el autor han propuesto la hip6tesis segiin la cual ya fen tiempos precelulares la informacin para fabricar proteinas no se disponia de forma continua. Aunque en las eélu- las actuales las secuencias que determi nan proteinas se hallan contenidas en el ADN, utilizandose el ARN como inter- mediario, esté ampliamente aceptada Ia idea de que el primer dcido nucleico con capacidad informativa fue en reali- dad el ARN y no el ADN. Corrobora esta idea el hecho de que las cadenas primitives de ARN pudieron haberse sintetizado sin necesidad de enzimas. ‘Ademés, el ARN puede contener se~ cuencias informativas y es necesario para la traduccién. Si la evolucién del ARN sce inici6 a partir de cadenas nu- cleotidicas aleatorias, cabe muy bien la posibilidad de que la informacién til ‘no estuviese organizada en forma conti- nua. Por ello es posible que desde los principios de la evolucién existiese un mecanismo para cortar y empalmar Arba) ARN, cuya funci6n seria unir fragmen- tos informativos dispersos, Reciente- mente, Thomas R. Cech, de la Univer sidad de Colorado en Boulder, ha de- mostrado que ciertos ARN pueden rea lizar auténomamente el proceso de ma- duracién, sin el concurso de enzimas. Este es el caso, al menos, en el proto- 200 Tetrahymena. Por tanto, no es im= posible que las secuencias espaciado- ras, 0 intrones, existiesen desde los tiempos més remotos, y que la madura- cién de ARN fuese una caracteristica temprana en el fenomeno de la expre- sion génica Estas especulaciones evolutivas tar~ darén algin tiempo en resolverse Mientras tanto, quedan por aclarar al- sgunas cuestiones importantes. Se esta realizando un gran esfuerzo para lograr identiicar los enzimas implicados en el proceso de la maduracin. Cuando se fencuentren se resolverd el cardcter se~ lectivo de su accién y por qué se elige tun determinado sitio poliadenilable y no otro. A un nivel mas amplio podre- mos preguntarnos sobre el papel que corresponde al mecanismo de madura- cidn del ARN en el fendmeno de la re~ gulacién genética en general. Cuales- quiera que sean las respuestas a tales preguntas, las investigaciones sobre los ‘mecanismos de maduracién del ARN continuarén ejerciendo una profunda incidencia en nuestros conocimientos sobre la expresién de los genes en célu- las eucariotas a