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Artículos

https://doi.org/10.1038/s41551-018-0263-5

micropartículas poliméricas de bacteriófagos-cargado inhalados


mejoran infecciones pulmonares agudas

rachit Agarwal 1,2,7, Christopher T. Johnson 2,3, Barry R. Imhoff 4,5, Rodney M. Donlan 6, Nael A. McCarty 4,5 y Andrés J.
García   1,2 *

Las infecciones pulmonares asociadas con la neumonía, o fibrosis quística causados ​por Pseudomonas aeruginosa u otras bacterias, como resultado de la morbilidad y mortalidad
significativas, en parte debido al desarrollo de resistencia a múltiples fármacos, también en contra de último recurso anti- bióticos. Los bacteriófagos líticos (es decir, virus que matan
específicamente bacterias) pueden reducir las infecciones pulmonares asociadas, sin embargo, su uso clínico se ve obstaculizada por dificultades en la entrega de fagos activos al
pulmón profundo. Aquí, se muestra que las micropartículas poliméricas de fago-cargado depósito en todo el pulmón a través de inhalación de polvo seco y que entregan fagos activos.
roparticles MIC de fagos-cargado reducen eficazmente P. aeruginosa infecciones y la inflamación asociada en la naturaleza y tipo de la fibrosis quística trans- knockout
membrana-conductancia-regulador de ratones, y rescató a los ratones de la muerte neumonía asociada. Estas micropartículas poliméricas podrían constituir una terapia clínicamente
traducible para la erradicación de infecciones e infecciones asociadas con la fibrosis quística pulmonar adquirida en el hospital.

traducción y el cumplimiento del paciente. Para superar estas limitaciones, las formulaciones de

UN la neumonía se producen anualmente en los EE.UU., y es la causa más


común de muerte 5,6
proximadamente pormillones
enfermedad infecciosa
de casos Otro
adquiridos1 .en la comunidad
200.000 casos de neumonía resultado asociada a la salud de 36.000 muertes anuales en los EE.UU. 2
polvo seco de bacteriófagos con o sin entos excipi- también han sido probados 40 - 45 . Sin embargo, la
pérdida rápida de la actividad del fago debido a la exposición a condiciones de fabricación duras,
la falta de un vehículo adecuado para administración en el pulmón profundo y la prueba de la
. Los pulmones de pacientes con fibrosis quística (~ 29.000 al año 3 ) también se vuelven colonizado por eficacia en els mo- animales son grandes retos para la traducción clínica de la terapia de fagos
ria bactericidas patógenos, lo que resulta en la infección crónica y la inflamación 4 . Pseudomonas cuando se usa sin vehículos de suministro adecuados. micropartículas de fago-cargado
aeruginosa es el principal agente causal de la morbilidad y la mortalidad en las infecciones continuación, describimos Engineered (fago-MPS) para pulmo- nary administración a través de
pulmonares 5 , 6 . La terapia con antibióticos está limitada por la dosificación y la resistencia a múltiples inhalación de polvo seco para entregar tera- dosis de tics de fagos activos al sitio de la infección, y
drogas 4 , 5 , 7 , e incluso los antimicrobianos de último recurso 8 son ineficaces en las infecciones demuestran reducciones significativas en los recuentos bacterianos y una mayor supervivencia de
erradicación 9 - 12 . la anfitrión. Esta formulación terapéutica es estable a temperatura ambiente y puede ser traducido
a inhaladores convencionales para la facilidad de modo de gestión y una mayor conformidad del
Los fagos son agentes para el tratamiento de las infecciones bacterianas prometedores debido paciente.
a su capacidad para infectar y lisar bacterias, replicar y degradar la matriz biofilm 13 - 17 . Debido a que
los mecanismos por los cuales las bacterias fagos de destino no están relacionados con la acción de
los antibióticos, la terapia de fagos es eficaz contra las bacterias resistentes a múltiples fármacos 18 , 19 . Para la administración pulmonar, las partículas deben tener un diámetro aerodinámico ( re AER)
de 1-5 ~ μ m para la deposición eficiente al pulmón profundo 46 . los re aer está relacionada con el
El uso de mezclas de fagos reduce el desarrollo de tancia resis- contra la terapia de fagos 20 . Los diámetro físico re y la densidad ρ
fagos son específicos de uno, o unos pocos objetivo, estrechamente relacionada con las de la partícula ( re aer = re ρ ) . Para las partículas poliméricas ( ρ ~ 1,0 g cm - 3),
especies bacterianas, y no infectan la microflora mensal com- del paciente 21 , que puede ser el diámetro de partícula debería ser ~ 1-5 μ metro. partículas Sin embargo, en este rango de
gravemente perturbado por antibióticos. Además, los fagos se han demostrado para producir tamaño, los macrófagos alveolares rápidamente claras 47 , de ese modo reducciones ing el efecto
menos de endotoxina después de la lisis bacteriana en comparación con antibióticos como terapéutico. Para evitar holgura, el diá- metro de partícula debe exceder de 5 μ m-más allá de la
capacidad de captación de los macrófagos alveolares. Esto se puede lograr mediante el uso de
β - lactámicos 22 . Los fagos pueden ser diseñados para entregar enzimas biofilm que degradan, partículas más grandes que son porosos para reducir su densidad. Además, las partículas
grandes tienen agregación más bajo en comparación con las partículas más pequeñas y permiten
aumentar la eficacia de los antibióticos o proporcionar estrategias TERIAL antibac- alternativos 23 - 26 . Recientemente,
el tratamiento fago compasivo de dos pacientes con bacterias resistentes a los antibióticos en Europa la mejora de la aerosolización de formulaciones de polvo seco 46 . Tales partículas porosas se han
y los EE.UU. ha demostrado el potencial de traslación, eficacia y seguridad de fago ter- APY 27 , 28 . Varios utilizado para la entrega de diversos tics tera- 48 - 52 , pero no se ha informado de su uso para la
estudios han demostrado el potencial de la terapia de fagos para reducir las infecciones bacterianas entrega de los fagos.
pulmonares 29 - 38 . Un estudio reciente demostró que los fagos y el acto sistema inmunológico de forma
sinérgica para eliminar las infecciones pulmonares pato- génicas 39 . Sin embargo, el uso de
nebulizadores o administración sal intrana- en estos estudios limita la estabilidad del fago, clínica resultados
Fago-MPS matar efectivamente bacterias. Preparamos poli hueco
(láctico-co-ácido glicólico) (PLGA) MPs via-aceite-agua agua

1 Escuela de Ingeniería Mecánica Woodruff, Instituto de Tecnología de Georgia, Atlanta, GA, EE.UU.. 2 Petit Instituto de Bioingeniería y Bioscience, Instituto de Tecnología de Georgia, Atlanta, GA, EE.UU.. 3 Coulter
Departamento de Ingeniería Biomédica, Instituto de Tecnología de Georgia y la Universidad de Emory, Atlanta, GA, EE.UU.. 4 Departamento de Pediatría, Escuela de Medicina de la Universidad de Emory y
Salud Infantil de Atlanta, Atlanta, GA, EE.UU.. 5 Centro para la fibrosis quística y la enfermedad pulmonar Investigación, Escuela de Medicina de la Universidad de Emory y Salud Infantil de Atlanta, Atlanta, GA,
EE.UU.. 6 Biofilm Laboratorio, Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA, EE.UU.. 7 Dirección actual: Centro de BioSystems Ciencia e Ingeniería, Instituto Indio de Ciencia, Bangalore,
India. *correo electrónico: andres.garcia@me.gatech.edu

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un segundo mi

2 μ metro 2 μ metro
200 μ metro

do re F

Count (eventos)
Count (eventos)

0 25 0 25

diámetro ( μ metro) diámetro ( μ metro)


200 μ metro

Fig. 1 | MPs porosos ofrecen fagos activos y son eficaces contra P. aeruginosa. a, b, Las micrografías electrónicas de barrido de una poroso PLGA MP ( un) y una no porosa PLGA MP ( segundo). discos compactos, La

distribución de tamaño de poroso PLGA MPs ( do) y no porosa PLGA MPs ( re). e, f, Imágenes de microscopía de fluorescencia de GFP-PAO1 con descargada ( mi) y el fago-cargado ( F) MPs fluorescentes (cargados con mancha DiI).

emulsión doble (Fig. 1a, b ). Las partículas porosas se generaron mediante la inclusión de esputo sintético, para modelar el moco viscoso en el pulmón. esputo sintético se preparó 54 , y se
bicarbonato de amonio (ABC) como un efervescente en la fase acuosa interna 53 . Al monitorizaron las curvas de crecimiento en presencia y en ausencia de fago-MPS. No se
ajustar los parámetros de procesamiento, generamos MPs altamente porosas del observó crecimiento en presencia de fago-MPS, mientras que las bacterias crecieron
tamaño apropiado ( d = 8.0 rápidamente bajo las condiciones de control (Fig. Suplementaria 3). Este resultado muestra
± 4.5 μ m) y densidad (~ 0,3 g cm - 3) para producir una re aer de 2-5 μ m (Fig. 1c, d que el fago-MPS puede infectar y eficaz matar bacterias en viscoso modelo esputo. Un reto
y. complementario Fig 1). importante para el tratamiento de infecciones pulmonares ATED-aso- es la formación de
Varios fagos líticos contra P. aeruginosa ( Tabla Suplementaria 1) se amplificó, purificó por biopelículas por P. aeruginosa 5 , 55 . Pusimos a prueba la capacidad de los fagos-MPS para lisar
cromatografía líquida y se cargó en MPs por incubación en solución que contiene el fago. En las biopelículas bacterianas. El tratamiento con fagos-MPS resultó en la matanza eficaz de P.
este sistema, los fagos no se encapsulan dentro de las MPs, pero se depositan sobre la aeruginosa en las biopelículas (Fig. 2 ).
superficie de las MPs después de que las MPs están dimensionados sintetiza. Este enfoque
minimiza cualquier pérdida en la actividad del fago de los disolventes utilizados para MP
fabricación, y no se observó pérdida de actividad de fago durante la carga. MPs se cargaron Hemos preparado formulaciones de polvo seco de fago-MPS por MPs fagos cargado Lizing
con una mezcla definida de tres a cinco fagos diferentes para aumentar la actividad infectividad lyophi- suspendidas en lactosa. de polvo seco laciones formu- de fago-MPS se ensayaron para 16
y bactericida y reducir la probabilidad de desarrollo de resistencia. MPs porosas proporcionan d y sólo mostraron una ligera pérdida de título cuando se almacena a temperatura ambiente (Fig. 4
una gran superficie para la adsorción del fago, y la carga de fago fue 2,6 ± 0,2 unidades complementario). Tales formulaciones de polvo seco se pueden administrar fácilmente a los
formadoras de placa (pfu) por partícula o ~ 2,6 × 10 6 pfu mg - 1 MPS. Los niveles de endotoxina pacientes que utilizan inhaladores, tiene una larga vida útil y aumentar El cumplimiento del
para la formulación de fago-MP fueron 0.078 ± 0,003 UE (unidades de endotoxina) mg - 1; es decir, paciente. A continuación, se llevaron a cabo estudios para determinar ics la liberación kinet- de
dos órdenes de magnitud por debajo del límite del 20 por dispositivo UE estipulados por la fagos a partir de formulaciones MP polvo seco. Se observó una liberación por reventamiento inicial
Administración de Alimentos y Drogas. Como se esperaba, estos grandes de fagos-MPS de aproximadamente el 10-15% de los fagos cargados seguidas de liberación muy lenta (Fig
porosos (8,0 μ m de diámetro) exhib- itado reducida internalización por los macrófagos en complementario. 5), consistente con la deposición estable de fagos en la superficie de las
comparación con la no poroso, más pequeño (1 μ m de diámetro) partículas de fago (Fig. partículas y degrada- ción lenta del polímero PLGA utilizado 56 . Los intentos para caracterizar la
complementaria 2). Para probar la actividad bactericida de MPs de fago-cargado, MPs fagos o cinética de liberación a largo plazo no tuvieron éxito ya que esto requiere la incubación en tampón
MPs vacías se sembraron en céspedes de P. aeruginosa Express-ing proteína fluorescente acuoso y no hay pérdida de actividad del fago con el tiempo en un entorno acuoso a 37 ° C.
verde (PAO1-GFP) y se incubaron durante 16 h a 37 ° C. Se observó la lisis eficiente de
bacterias alrededor de fago-MPS, como se muestra por zonas desprovistas de fluorescencia,
mientras que MPs de control no tuvieron ningún efecto sobre los niveles de PAO1-GFP (Fig. 1e,
f ). En particular, la zona de matanza para fagos-MPS extiende más allá del área de las
partículas, lo que indica que los fagos propagan radialmente hacia fuera desde las MPs, y que Inhalados fago-MPS se distribuyen por todo el pulmón murino.
muestra que los fagos liberados de MPs pueden infectar, replicarse, propagar y matar bacterias Para la entrega al pulmón del ratón, polvo liofilizado se mezcló con la lactosa de grado de
diana más allá de aquellos en contacto directo con las MPs . A continuación, hemos probado si inhalación y aerosol usando un insuflador de polvo seco ratón. En primer lugar, se evaluó la
fago-parlamentarios pueden infectar y matar a las bacterias en seguridad y la limpieza de los parlamentarios entregados a través de la intubación
endotraqueal. ima- intravital ing con MPs marcados con colorante infrarrojo cercano mostró
que MPs se despejaron de los pulmones de ratones sanos dentro de 18 h (Fig.
suplementaria 6). Las secciones histológicas en 1 y 7 d post-parto mostraron infiltración de
leucocitos mínima y la estructura del tejido pulmonar normal

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un Vivir segundo Muerto do fusionado gramo

Live-a-muertos relación de tinción


3

100 μ metro 100 μ metro 100 μ metro P < 0,0074


2

re mi F

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100 μ metro 100 μ metro 100 μ metro

Fig. 2 | Fago-MPS son eficaces contra P. aeruginosa biopelículas. un - F, Imágenes de biopelículas PA103 tiñeron con SYTO 9 (verde, células vivas) y yoduro de propidio (rojo, células muertas) 24 h después del tratamiento con

sólo MPs ( un - do) o fago-MPS ( re - F). gramo, La cuantificación de la intensidad media de píxeles para las bacterias vivas y muertas utilizando ImageJ. Las medidas se tomaron a partir de muestras independientes ( norte = 4 para

MPs vacías y norte = 5 para fagos-MPS; media ± Dakota del Sur; De dos colas

t- prueba con corrección de Welch).

un segundo do
Corazón

100
La señal de fluorescencia (%)

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La Fig. 3 | formulaciones de polvo seco de MPs porosas para la administración pulmonar. un, Las imágenes de fluorescencia de los órganos explantados inmediatamente después de la administración MP.

segundo, La cuantificación de la señal de fluorescencia a partir de órganos después de la administración MP fluorescente ( norte = 3 ratones; media ± Dakota del Sur). Las mediciones se tomaron a partir de muestras distintas. do, imágenes de

fluorescencia de una sección criogénica de pulmón después de la insuflación MP. Los núcleos se tiñeron con DAPI. MPs están etiquetados magenta. La imagen que se muestra es representativa de un total de nueve imágenes tomadas. Los

datos se recogieron de ratones C57BL / 6 ratones sanos (no infectado) masculinos.

(Fig. Suplementario 7). No se observaron diferencias en la histología de tejido entre los Un atributo atractivo de los fagos en comparación con otros Bials antimicrobianas es la
pulmones que recibieron polvo y el control de la lactosa en polvo MP-lactosa (no MPs). capacidad de persistir y replicarse en los sitios de infección hasta que se elimine el patógeno.
Hemos establecido un modelo agudo de infección pulmonar usando diferentes dosis PAO1-GFP,
A continuación, se evaluó la distribución de polvo seco MP-lactosa fluorescente después y se evaluó la persistencia de bacterias a las 24 h después de la inoculación en ratones sanos
de insuflación a través de la intubación endotraqueal. Órganos se explantaron inmediatamente (Fig. Complementario 9). Una dosis de 5 × 10 6 unidades formadoras de colonias fue seleccionado
después del parto y la imagen para cencia fluo- total. Todo fluorescencia se localiza en los (ufc) de PAO1- GFP para los experimentos posteriores. De fago-MPS fueron entregados a ambos
pulmones (Fig. 3a, b ), y fluorescentes MPs se encuentran en todo el tejido pulmonar (Fig. 3c ). pulmones infectados con PAO1-GFP de control y, y se detectaron 3 órdenes de magnitud más
Estos resultados muestran la orientación de PM para el pulmón, así como distri- bución en altos recuentos de fagos en los pulmones GFP infectadas PAO1- comparación con el control
todo el pulmón mediante inhalación de polvo seco. Para cuantificar la entrega fago, hemos pulmones (no infectadas) a 0 h (Fig complementario. 8) y 18 h post-parto (complementario Fig.
entregado fago-MPS o fagos solos (no hay MPs) a través de insuflación. títulos altos de fagos 10). Este resultado muestra que los fagos entregados a los pulmones a través MPs pueden
(10 4 -10 5 pfu mg -1 de tejido) se recuperaron de los pulmones tratados con fago-MPS, mientras infectar y amplificar in vivo sólo en la presencia de bacterias diana.
que no se recuperaron fagos de los pulmones que recibieron los fagos libres (complementario
Fig. 8a). Estos resultados muestran que el uso de MPs signifi- cativamente mejora la entrega
de fagos activos a los pulmones. También se examinó la distribución pulmonar profunda de
MPs porosos y no porosos de fago-cargado. Los fagos fueron entregados como se describió tratamiento Phage-MP despeja la infección de ratones pulmones. Probamos la capacidad de los
anteriormente y se recogieron los pulmones profundos. se observó significativamente mayor fagos-MPS para reducir las infecciones pulmonares bacterianas agudas en ratones de tipo salvaje.
deposición de fagos en el pulmón profundo para la entrega con MPs porosos en comparación De fago-MPS y controles se entregan a través de flación insu- a ratones PAO1-GFP-infectados, y los
con MPs no porosas (complementario Fig. 8b). pulmones se analizaron para determinar los recuentos bacterianos y de fagos después de 24 h (Fig. 4a,
b ). Entrega de fagos-MPS redujo el recuento bacteriano en un orden de magnitud ( P = 0,0203) en
comparación con el grupo de bacterias + fagos, mientras

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un segundo do
P = 0,0118 100

5 5

*
80
4 4
ratones WT

Supervivencia (%) log [pfu


log [mg de pulmón ufc -1]
3 3 60 Bacterias Las bacterias +

mg de pulmón -1]
fago-MPS
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La Fig. 4 | MPs porosas de fagos-cargado reducir las bacterias en los pulmones de ratones. a, b, La eficacia antibacteriana de los fagos libres y de fago-MPS se examinó en un modelo de ratón de infección pulmonar aguda con P.

aeruginosa PAO1-GFP. Después de 24 h de tratamiento, la carga bacteriana ( un; norte = 3 ratones para MPs; norte = 11 ratones para las bacterias;

norte = 6 ratones para las bacterias + MPs; norte = 9 ratones para las bacterias + fagos; norte = 11 ratones para las bacterias + fago-MPS; media ± sd) y la carga de fagos ( segundo; norte = 3 ratones para MPs;

norte = 6 ratones para las bacterias; norte = 4 ratones para las bacterias + fagos; norte = 6 ratones para las bacterias + fago-MPS; media ± sd) en el homogeneizado de pulmón se cuantificaron. Se combinaron los datos de dos

experimentos independientes. por un, Se utilizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis de una vía para detectar diferencias estadísticas seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunn con ajuste para comparaciones

múltiples. * PAG = 0.0203. do, Porcentaje de supervivencia de ratones-GFP-inoculado PAO1 que estaban sin tratar o tratado con fago-MPS ( norte = 8 ratones por grupo). Se utilizó la prueba de Mantel-Cox para detectar diferencias

entre la supervivencia. Los datos se recogieron en ratones C57BL / 6 macho.

entrega fago libre (misma dosis que el fago-MPS) no tuvo efecto sobre los recuentos bacterianos ( PAG > tratados con fagos libres muestran niveles moderados de de infiltración de células (Fig. 5e ). Es
0,12) en comparación con los animales tratados con teria BAC- solo. Condes de fagos activos contra P. importante destacar que los ratones infectados tratados con fagos-MPS tenían niveles bajos de
aeruginosa fueron vada ele- tanto para los fagos libres y de fago-MPS. Es importante destacar que, el infiltración de células inmunes (Fig. 5e ), Indicando que este tratamiento reduce la carga bacteriana,
tratamiento de ratones infectados con fago-MPS rescató 100% de los sujetos de la muerte neumonía así como la inflamación ado infección-aso-. análisis inmunotinción sobre secciones de pulmón
asociada comparación con sólo el 13% de supervivencia para los ratones no tratados más de 6 d (Fig. 4c con- puesto firme estas observaciones (complementario Fig. 12).
). Estos resultados muestran que los fagos cargado parlamentarios reducen eficazmente P. aeruginosa infecciones
pulmonares en ratones de tipo silvestre y ratones de rescate de la muerte por neumonía asociada.
Fago-MPS matan cepas bacterianas clínicas. Para evaluar el potencial clínico de la
formulación de fago-MP, seleccionados de fagos-MPS frente a cepas clínicas de bacterias
También se examinaron los efectos de fagos-MPS en P. aeruginosa aisladas de infecciones pulmonares asociados a un hospital y los pacientes con fibrosis
infección en la fibrosis quística transmembrane- conductancia-regulador gut-corregida quística. ción El fago-MP formulación era eficaz contra todas las cepas clínicas de la
(CFTR) knockout (CFKO) mouse 57 . Este modelo imita varios aspectos de la ción condi- infección aguda y cinco de cada seis cepas clínicas de pacientes con fibrosis quística
humano fibrosis quística, incluyendo una mayor patogénesis de P. aeruginosa infecciones probados in vitro, incluyendo cepas resistentes a los antibióticos (CFBr 337 y CFBr 505 son
pulmonares 58 , 59 . Un estudio de dosificación con PAO1-GFP identificó una dosis adecuada tobramicina-resistente) (Cuadro 2). A continuación, evaluó la eficacia in vivo de fago-MPS
para obtener una infección aguda (Fig. Suplementaria 11). Una dosis de 2 × 10 6 se utilizó contra PA103 (una cepa histórico derivado del esputo de un paciente 60 ) en ratones. Un estudio
ufc PAO1-GFP. Esta dosis fue menor que la necesaria para los ratones de tipo salvaje en de la dosificación con PA103 identificado una dosis (1,6 × 10 5 ufc) adecuado para obtener una
el experimento anterior, lo que sugiere que los ratones CFKO han reducido la capacidad infección aguda en ratones de tipo salvaje (complementario Fig. 13). Para conseguir títulos
de limpiar las bacterias de los pulmones. infección PAO1-GFP y la entrega de fago-MPS altos de fagos contra PA103, nuestra biblioteca de fagos se tamizó contra PA103, y tres
se realizaron como se ha descrito anteriormente. La entrega de fago-MPS reduce fagos diferentes se eligieron y se cargó en las MPs (Tabla 3). infección PA103 y entrega de
drásticamente los recuentos de bacterias en los pulmones por tres órdenes de magnitud, MPs fagos se realizaron como se ha descrito anteriormente. La entrega de fago-MPS reduce
cerca del límite de detección del ensayo (Fig. 5a, b ). En contraste con los ratones de tipo eficazmente los recuentos de bacterias en los pulmones, que muestra la eficacia contra una
salvaje, el tratamiento con fagos solo también redujo la carga bacteriana en el pulmón de cepa bacteriana derivada del paciente (Fig. 6a, b ). Para probar si la deposición directa de los
ratones CFKO, pero niveles significativos de bacterias todavía estaban presentes. Esta fagos en MPs (en lugar de sencilla co-entrega de fagos y MPS) se requiere para eficaz in vivo
modesta eficacia podría ser el resultado de un mayor fagos relación a las bacterias como bacteriana claro- Ance, una mezcla física de fagos y MPs descargan con la lactosa de grado
las bacterias dosis administrada a ratones CFKO fue menor que para los ratones de tipo de inhalación fue evaluada. En contraste con las bacterias eficaces ción reducción con el
salvaje. Sin embargo, cuando comparaciones ing fagos libres con fago-MPS, el uso de fago-MPS, una mezcla física de fagos y MPs no cargados no reducen las bacterias se cargan
fagos-MPS resultado en ~ 1,5 órdenes de magnitud inferior recuentos de bacterias en en el pulmón (Fig. 6a ), Que muestra que sólo los fagos que se depositan directamente sobre
comparación con los fagos libres. Los fagos se detectaron en el tejido pulmonar para las MPs matan las bacterias en vivo. También probamos 10 colonias bacterianas
ambos fago-MPS y fagos libres. Se evaluaron los niveles de bacterias en el hígado de recuperadas de ratones tratados fagos-MP para el desarrollo de resistencia a los fagos contra
estos ratones para determinar si la infección se propaga a otros órganos. la mezcla de stock de fago durante la 18 h de incubación en el pulmón de ratón. Todas las
Sorprendentemente, no hay ratones tratados con fagos-MPS mostraron cualquier colonias recuperadas eran todavía sensibles a los fagos-MPS.
bacteria detectables en el hígado (0 de 7 ratones), mientras que> 5c ). Los análisis
histológicos revelaron infiltración masiva de las células inmunitarias del huésped en los
pulmones infectados no tratados (Fig. 5d ). Los ratones infectados

Fago-MPS son eficaces contra la infección de varias cepas.


Otro reto para la terapia antimicrobiana contra P. aeruginosa

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do

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50 μ metro

Fig. 5 | MPs porosas de fagos-cargado reducir las bacterias en los pulmones de ratones CFKo. a, b, La eficacia antibacteriana de los fagos libres y de fago-MPS se examinó en un modelo de ratón CFKO de infección

pulmonar aguda con P. aeruginosa ( PAO1-GFP). Después de 18 h de tratamiento, la carga bacteriana ( un; norte = 6 ratones para las bacterias y bacterias + fago-MPS; norte = 7 para las bacterias + fagos; media ± sd) y la carga de

fagos ( segundo; norte = 3 ratones para las bacterias y las bacterias + fago-MPS, norte = 4 ratones para las bacterias + fagos; media ± sd) en el homogeneizado de pulmón se cuantificaron. Se combinaron los datos de dos

experimentos independientes. Un utilizó un modelo lineal se utilizó para detectar diferencias estadísticas seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey con un ajuste para comparaciones múltiples. *** PAG <0,0001 frente

al control bacterias, $$$ PAG <0,0001 frente al grupo de bacterias + fagos. Los datos se recogieron en ambos ratones CFKO masculinos y femeninos. Las mediciones se tomaron a partir de muestras distintas. do - mi, Imágenes de

las secciones histológicas del pulmón de ratón teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) a las 18 h después del tratamiento con sólo bacterias ( do), bacterias + fagos ( re) y bacterias + fago-MPS ( mi). Las imágenes mostradas son

representativas de un total de cinco imágenes tomadas para cada grupo.

la infección es la presencia de poblaciones distintas y su diversificación en el pulmón del reducido P. aeruginosa infecciones y la inflamación asociados en ratones sanos y ratones con
paciente 61 , 62 . Para probar si el tratamiento fago-MP puede ser eficaz contra la infección que fibrosis quística, y ratones rescató de la muerte por neumonía asociada. Es importante destacar
consiste en múltiples cepas de ria bactericidas, se infectaron ratones con una mezcla de que, de fago-MPS eran tiva effec- contra las cepas clínicamente derivados, incluyendo cepas
PAO1-GFP (2.5 × 10 6 ufc) y PA103 (8 × 10 4 ufc) cepas. Los fagos enumerados en las Tablas de resistentes a los antibióticos, así como infecciones pulmonares causadas por dos cepas de
apoyo 1 y 3 se mezclaron y se cargaron en MPs. El tratamiento con fago-MPS reduce bacterias. El modelo murino de la infección aguda utilizado en nuestro estudio carece de la
eficazmente los recuentos de bacterias totales en los pulmones, que muestra eficacia frente a formación de biopelículas, el taponamiento de moco, y genética, fenotípica y la diversificación
las infecciones que comprenden ción infectividad simultánea por dos cepas de P. aeruginosa ( Higo.
espacial de cepas bacterianas 61 , 62 . Sin embargo, mostramos que el fago-MPS fueron eficaces
6c ). También probamos diez colonias TERIAL BAC- de cada cepa se recuperó de los ratones contra las cepas clínicamente derivados de las infecciones agudas y los pacientes con fibrosis
tratados con fago-MP para el desarrollo de resistencia a los fagos contra la mezcla de stock de quística, y fueron capaces de matar las bacterias que crecen en biofilms. Curiosamente, cuando
fago, y todas las bacterias recuperadas todavía eran susceptibles a fagos tratamiento MP. hemos entregado fagos gratuitas para el pulmón sano como una formulación de polvo seco y
inmediata- mente ensayaron los pulmones, que no se recuperó ningún fagos activos a partir de
homogeneizado de pulmón. Este resultado contrasta con los estu- dios anteriores 29 - 34 , donde la
administración del fago libre ha demostrado ser eficaz contra las infecciones bacterianas. Esta
Por último, para evaluar la eficacia de la terapia de fagos después de la administración discrepancia puede deberse a diferencias en el modo de administración. Todos los informes
repetida, que entregado MPs vacías y de fago-MPS en ratones ingenuos. Después de 21 d, anteriores han utilizado la administración intranasal de fagos en el líquido, mientras que se utilizó
los ratones en ambos grupos fueron infectados con PA103, y se realizó el tratamiento de una formulación de polvo seco de fagos libres. Otra razón para esta discrepancia podría ser que
fago-MP. Pre-exposición con MPs fagos no afectó a la eficacia del tratamiento en los títulos entregados por los fagos libres en nuestro experi- mento (~ 10 6 pfu mg -1 MPS) fueron
comparación con el grupo control no pre-exposición (Fig. 7 ). Además, no se detectaron títulos significativamente más bajos en comparación con los informes anteriores (10 9 -10 10 pfu). Para el
de anticuerpos en la sangre (0/5 ratones) contra fagos en cualquier puntos de tiempo modelo de infección pulmonar aguda en ratones y ratones sanos con fibrosis quística examinado
ensayados (días 0, 21 y 22). Este resultado indica que la exposición pre a fagos-MPS a en este estudio, el fago-único tratamiento tuvo una eficacia modesta en la reducción de la carga
través de administración de polvo seco no redujo su rendimiento funcional. rial bactericidas, a pesar de fagos activos se recuperaron. En contraste, el tratamiento de fago-MP
redujo significativamente la carga bacteriana, res- ratones con pautas de la muerte neumonía
asociada y previno la colonización bacteriana del hígado. Atribuimos este bactericida mejorado

Discusión
Se demuestra que los fagos se pueden entregar de manera efectiva a los pulmones utilizando
MPs poliméricos, y que los fagos MP-entregado retienen su actividad para matar bacterias
huésped. MPs fagos cargado significativamente

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un segundo do un segundo
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La Fig. 6 | De fago-MPS reducen significativamente la infección por una cepa clínicamente derivada de

bacterias en ratones de tipo salvaje. a, b, La eficacia antibacteriana de fago-MPS se examinó en un modelo de


Fig. 7 | El pretratamiento con fago-MPS no reduce la eficacia funcional del tratamiento en la limpieza de
ratón de infección pulmonar con la cepa clínica de P. aeruginosa ( PA103). Después de 18 h de tratamiento, la carga
las bacterias de los pulmones del ratón. a, b, La eficacia antibacteriana de fago-MPS se examinó en un
bacteriana ( un; norte = 13 ratones para las bacterias; norte = 6 ratones para las bacterias + fagos + MPs;
modelo de ratón de infección pulmonar después de 21 d de tratamiento previo con el fago-MPS o MPs vacíos

con PA103. Después de 18 h de tratamiento, la carga bacteriana ( un; norte = 4 ratones por grupo; media ± sd)
norte = 15 ratones para las bacterias + fago-MPS; media ± sd) y la carga de fagos ( segundo; norte = 9 ratones
y la carga de fagos ( segundo; norte = 4 ratones por grupo; media ± sd) en el homogeneizado de pulmón se
por grupo; media ± sd) en el homogeneizado de pulmón se cuantificaron. Se combinaron los datos de dos
cuantificaron. Los datos se recogieron en 6 ratones machos C57BL de tipo salvaje /. ANOVA de una vía
experimentos independientes. Se recogieron datos sobre ambos hermanos de camada CFTR de tipo silvestre
seguido de pruebas de comparación múltiple de Tukey se utilizaron para detectar diferencias estadísticas.
masculino y femenino.

do, La eficacia antibacteriana de fago-MPS se examinó en un modelo de ratón de infección pulmonar con una

mezcla de P. aeruginosa cepas (PAO1-GFP y PA103). Después de 18 h de tratamiento, la carga bacteriana ( norte

 = 4 ratones por grupo; media ± sd) en el homogeneizado de pulmón se cuantificó. Los datos se recogieron en
Además, la pre-exposición de fagos-MPS no resultó en una reducción de su
6 ratones machos C57BL de tipo salvaje /. por un, un ANOVA de una vía se utilizó para detectar diferencias
eficacia funcional a la exposición bacteriana subsiguiente. Estas diferencias en
estadísticas, seguido por la prueba de comparación múltiple de Holm-Sidak con ajuste para comparaciones
las respuestas del huésped a los fagos y la actividad del fago podría ser
múltiples. ** PAG <0,0001 frente a las bacterias controlar y PAG = 0,001 frente a la bacteria fagos grupo + +
debido a diferencias en la vía de administración (intraperitoneal frente a la
MP. por segundo y do, de un Welch de dos colas t- Se utilizó la prueba para detectar diferencias estadísticas.
insuflación de pulmón), la dosis de fago entregado y / o el uso de MPs como
Las mediciones se tomaron a partir de muestras distintas.
vehículos de entrega de fagos. Se necesitan estudios adicionales para
establecer si las respuestas adversas inmunitarias, producción de anticuerpos
y / o una reducción en la eficacia ción fago surgir cuando fago-MPS se
administran veces erales SeV. Sin embargo, las formulaciones secas de
eficacia para el fago-MPS a la entrega pulmonar mejorada ofrecida por las MPs de fago-MPS representan una alternativa prometedora a los regímenes de
ingeniería. De hecho, se requiere la deposición directa de los fagos en el MPs para efectiva antibióticos, que son severamente limita- das por dosificación ineficaz y la
en la actividad bactericida in vivo, como mezclas físi- cas de fagos y MPs no cargados no aparición de resistencia a los antibióticos.
tuvieron efectos.
Las bacterias recuperadas de los pulmones de los ratones infectados tratados con
fagos-MPS se ensayaron para determinar su susceptibilidad contra MPs fagos, y todas las
muestras de prueba todavía eran susceptibles a la infección por fagos y la lisis. Aunque este
resultado sugiere una falta de resistencia a los fagos, más análisis en profundidad en futuros métodos
estudios es necesario. El análisis se centró en ent PRESION infección pulmonar aguda en PLGA MP. MPs fueron preparados por doble emulsión de agua en aceite en agua. Algunos 200 mg de PLGA
(RG503H; Sigma-Aldrich) se disolvió en 7 ml de diclorometano (DCM). ABC (Sigma-Aldrich) se utilizó como
modelos murinos de la fibrosis quística y saludables; estudios futuros probar la eficacia de la
un efervescente para crear MPs porosas en 1 ml de fase acuosa interna en el 4% w / v. La concentración de
terapia de fago-MP a base de inhalación de polvo seco en los modelos de infección crónica
ABC se puede variar para ajustar la porosidad y la densidad de MPs. La solución se homogeneizó a
más desafiantes. terapia de fagos (por vía intranasal) ha sido recientemente demostrado ser
eficaz contra P. aeruginosa infecciones crónicas 63 . Se espera que los ratones utilizados en 3000 rpm durante 2 min y luego se mezcla con 50 ml de 1% de poli (alcohol vinílico) (PVA) (Sigma-Aldrich) y

nuestros experimentos tener varias especies bacterianas comensales 64 , sesenta y cinco . Aunque no nos se homogeneizó durante 2 min. La emulsión final se añadió a 100 ml 1% de PVA y se agitó para evaporar
todo el DCM durante 5 h. MPs se lavaron con agua desionizada 4 veces para eliminar el PVA y el polímero
investi- vestigar el efecto del tratamiento con fagos en otras especies residentes de bacterias en
libre y se liofilizó durante 16 h. MPs fluorescentes se prepararon añadiendo 1,1 ' - dioctadecil-3,3,3 ' ,
ratones pulmones, nuestro tratamiento fue capaz de reducir los niveles de las bacterias
patógenas de todo el microbioma de pulmón. A pesar de que los fagos son muy específicas de 3 ' - perclorato tetrametilindocarbocianina (DiI) o 1,1 ' - dioctadecil-3,3,3 ' ,
sus especies huésped, será importante para futuros estudios para evaluar el efecto del 3 ' - yoduro tetramethylindotricarbocyanine (DIR) colorante (Thermo Scientific) (5 mg colorante por 200 mg PLGA)

tratamiento con fagos en todo el pulmón microbioma-especialmente cómo dirigidas a un único en DCM.

ismo impactos orga- los organismos que quedan en esa comunidad. Una preocupación con la
El tamaño de partícula y la densidad. La distribución del tamaño de las MPs se caracterizó usando un
terapia de fagos es que las respuestas inmunes a los fagos podrían resultar en elevada,
contador de Multisizer 3 Coulter. Para determinar la densidad de las MPs, 1.0 mg MPs liofilizadas se
inflamación indeseable y reacciones inmunes que podrían reducir la actividad de fagos. De
suspendieron y se contaron en el contador Coulter. El volumen total de MPs en 1,0 mg se calculó usando el
hecho, intraperitoneal modo de gestión de fagos resultó en anticuerpos de fagos específicos de diámetro medio obtenido a partir del contador Coulter. La densidad se calcula mediante cálculo teórico basado
alta Titre en la sangre 18 . En el presente estudio, no observamos ninguna inflamación adverso o en masa = densidad × volumen.

elevada en respuesta al tratamiento fago-MP, ni la presencia de anticuerpos de fagos


específicos en la sangre de los ratones tratados.
microscopía electrónica de barrido de parlamentarios. Por microscopía electrónica de barrido (LEO

1550), una suspensión MP (5 μ l de 1 mg ml - 1 solución) se dispensó en un talón microscopía electrónica de barrido,


se secó al aire durante 2 h a temperatura ambiente y bombardeo iónico recubierto con 5 nm de oro para hacer la
muestra conductora. Imaging se realizó con un haz de electrones 5 KeV.

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formación de imágenes de placa fluorescente. MPs PLGA se cargaron con fago y se lavaron, y diversas diluciones se 4 ' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y faloidina-iFluor 488 (Abcam). Las muestras se obtuvieron imágenes utilizando un
sembraron con PAO1-GFP en placas de agar de tripticasa de soja. Las placas se incubaron durante 18 h a 37 ° C y microscopio de barrido láser confocal Nikon C2 a través de un 10 × objetivo. Tres imágenes de cada pocillo fueron
captación de imagen sobre una de escaneo láser confocal microscopio Nikon C2 con un 10 × objetivo. PAO1-GFP se adquiridas. fagocitosis de macrófagos se evaluó en ImageJ mediante la realización de proyecciones de máxima
excitó con un láser de 405 nm y la luz emitida se recogió a través de un cubo de 485/35 nm filtro. Las partículas se intensidad Z y umbralización el canal verde (faloidina), seguido por análisis de rastreo de partículas (con un tamaño
excitaron con un láser de 561 nm y la luz emitida se recogió a través de un cubo de 595/50 nm filtro. mínimo de 20 píxeles) para identificar el borde de la celda. azul fluorescente (DAPI) y las imágenes de color rojo (MP)
fueron entonces cubierto de oro, y MPS que caen dentro de las fronteras de células que contienen un núcleo se
contaron como habiendo sido fagocitados por las células. El número total de células dentro de un campo de imagen se
cuantificó usando el ComDet (versión 0.3.6) plugin. El porcentaje de células fagocíticas se calculó dividiendo el número
la amplificación del fago. Los fagos (Tablas suplementario 1 y 3; se ha descrito previamente 66 ) se amplificaron en de células fagocíticas en una imagen por el número total de células en la imagen.
cultivo líquido de caldo de tripticasa de soja 25% (TSB; Becton Dickinson). Los fagos se añadieron a un cultivo en
crecimiento exponencial de su respectivo huésped bacteriano en 10 7 -10 8 ufc ml - 1 y se incubaron a 37 ° C hasta que se
produjo la lisis (la cultura aclaró visiblemente). El lisado resultante se aclaró además mediante la adición de 2% v / v
de cloroformo, decantación centrifugación y filtración del sobrenadante (0,2 μ m membrana de poro).
En crecimiento in vitro de las bacterias en el esputo de la fibrosis quística sintético. Synthetic esputo fibrosis
quística se preparó como se ha descrito previamente 54 . A 50 μ l de cultivo de PA103 se hizo crecer durante 16 h en el
esputo de la fibrosis quística sintético y utilizó para inocular 3 ml del medio de esputo en presencia o ausencia de 0,1
purificación del fago. Para la purificación del fago, una columna de cromatografía de intercambio aniónico, CIM mg de fago-MPS. Los cultivos se cultivaron a 37 ° C y se tomaron mediciones regulares de densidad óptica para
Columna ml Tubo QA-8f (BIA separaciones), se utilizó 67 . La columna se une a un sistema AKTA rápida de proteínas controlar el crecimiento bacteriano.
cromatografía líquida (GE Healthcare) con un sistema de bomba P900, y se analizaron con el software UNICORN
5,01. lisado de fago se diluyó 50% con tampón Tris (40 mM Tris-HCl, pH 7,5) y se cargó en la columna. a
continuación, los fagos se lavaron con tampón Tris (20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Para la elución, un gradiente fue Actividad in vitro de fagos-MPS contra las biopelículas bacterianas. Para formar biofilms, 5 μ l de cultivo de PA103
utilizado mezclando linealmente una cantidad cada vez mayor de 1,5 M NaCl, solución 20 mM Tris-HCl con tampón se cultivó durante 16 h en 25% TSB, se utilizó para inocular 500 μ l de 25% TSB en cada pocillo de una placa de 48
20 mM Tris-HCl, y se recogieron usando un colector de fracciones. Los fagos fueron entonces dializaron con tampón pocillos y se dejaron crecer durante 24 horas a 37 ° C. Las biopelículas se lavaron cuidadosamente con PBS y se
fosfato 0,1 M suplementado con MgSO 2 mM 4, pasado a través de una columna de eliminación de endotoxina y se incubaron con 0,01 mg ml -1 de MPs o MPs fagos durante 18 horas a 37 ° C en 25% TSB. entonces Biofilms se lavaron y
almacena a 4 ° C. se tiñeron con BacLight LIVE / DEAD (Thermo Scientific) (3 μ l mezcla por ml de medio bacteriana tinte) y captación de
imagen sobre una de escaneo láser confocal microscopio Nikon C2 con un 10 × objetivo. SYTO 9 (tinción de células
vivas) fue excitado con un láser de 488 nm y la luz emitida se recogió a través de un cubo de 525/50 nm filtro. El yoduro
de propidio (para teñir las células con una membrana comprometida que se consideran muertos o moribundos) fue
contaje de fagos activos. Las preparaciones se contaron para fagos activos con ensayos de placa, utilizando el excitado con 561 nm, y la luz emitida se recogió a través de un cubo de 595/50 nm filtro. Para evitar sangrado a través
método de capa de agar superior tradicional 68 . de la señal de fluorescencia, cada fluoróforo fue excitado, y la luz emitida se recogió en serie. La imagen de cada pocillo
se analizó para determinar la intensidad de los píxeles media en canales vivos y muertos utilizando el software ImageJ
loading Phage en partículas. MPs (4 mg) se suspendieron en una solución de mezcla de fagos (~ 10 10 -10 11 fagos (NIH). Se representó la relación de la intensidad media de células vivas y muertas.
ml - 1) durante 4 h con agitación suave. entonces MPs se lavaron tres veces con solución salina tamponada con
fosfato (PBS). Para determinar los niveles de fago de carga en MPs, Φ Paer14 se cargó en las partículas. algunos
500 μ l de fago-MP y 500 μ l de cloroformo se mezclaron durante 20 min a temperatura ambiente para disolver el
PLGA. normas de fagos libres se ejecutan en paralelo para determinar los efectos del cloroformo sobre la
estabilidad del fago. Las muestras se centrifugaron a 500 gramo durante 5 minutos para separar las fases orgánica Actividad in vitro de fagos-MPS contra cepas clínicas de bacterias. Para probar la actividad de fagos
y acuosa. valoraciones de fagos se realizaron en la fase acuosa. Las partículas se enumeraron usando un cargados en las MPs, un 5 μ l gota de fago-MPS a 4 mg ml - 1 fue descubierto en un césped de bacterias
hemocitómetro, y el número de fagos por partículas se calculó utilizando la siguiente fórmula ((pfu ml -1) × de ajuste) respectivas (Tabla 2) y se dejaron crecer durante 16 horas a 37 ° C. La formulación se define como eficaz si la
/ (partículas ml -1), donde el ajuste se determina dividiendo el pfu ml -1 de un estándar de fagos por la pfu ml -1 de la mancha fue despejada visualmente de cualquier crecimiento bacteriano después de 16 h de incubación.
misma norma expuestos a cloroformo durante 20 min, como se describe anteriormente.

la preparación del inóculo bacteriano. Las colonias se resuspendieron en PBS estéril y se midió la densidad
óptica a 600 nm. Para cada valor de densidad óptica, diluciones en serie se sembraron en ampicilina fortificada
(100 μ g ml - 1) lysogeny placas de agar de caldo durante 24 h a 37 ° C con atmósfera de CO 2. Las colonias se
preparación de polvo seco. Para preparar formulaciones de polvo seco, se suspendió 4,0 mg de fago-MPS lavados contaron y se representó frente a sus respectivos valores iniciales de densidad óptica. retos bacterianas se
en 100 μ l de solución de lactosa (40 mg ml - 1), lo que resulta en una relación 1: 1 de partícula: lactosa, y se liofilizó realizaron con P. aeruginosa que expresa la proteína verde de fluorescencia (PAO1-GFP) o el derivado
durante 24 h. Para la formulación de polvo seco fago libre, valoraciones de fagos se ajustaron a las cantidades de clínicamente PA103 bacterias cepa (America Type Culture Collection
fagos cargados en las MPs, se suspendió en 100 μ l de solución de lactosa (40 mg ml - 1), lo que resulta en una relación
1: 1 de partícula: lactosa, y se liofilizó durante 24 h. Para la prueba de estabilidad, la mezcla de polvo seco se 29260). Las bacterias se cultivaron en ampicilina fortificada (100 μ g ml - 1) lysogeny placas de agar de caldo durante
almacenó a temperatura ambiente. actividad de fagos en el polvo liofilizado se ensayó usando el método de fago 24 h a 37 ° C con atmósfera de CO 2. Las colonias se retiraron de la placa con un asa de siembra y se
enumeración descrito anteriormente en PA103. Para el trabajo in vivo, polvo liofilizado se mezcló con lactosa 32 mg resuspendieron en PBS estéril. mediciones de densidad óptica se tomaron de la solución y ajustan para conseguir
de grado de inhalación (Respitose ML006; DFE Pharma), dando como resultado una relación final 01:10 de partícula: la concentración requerida en base a una curva de crecimiento de la densidad óptica previamente determinada
lactosa. Polvo se agitó con vórtex durante 1 h a temperatura ambiente (VWR Mini Vortex Mixer; velocidad 7). para las respectivas bacterias.

Cuidado y Uso de los ratones. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Cuidado de Animales
institucional y los protocolos aprobados por el Comité de Uso en el Instituto de Tecnología de Georgia y la Universidad
Phage-MP endotoxina cuantificación. Liofilizado fago-MPS (0,5 mg) se lavaron por centrifugación en 40 ml Emory. Todos los animales fueron alojados en alojamiento específico libre de patógenos con 12 h de luz y 12 h oscuridad
de agua libre de endotoxina como por 'Guidance for Industry: pirógenos y endotoxinas Testing' la FDA ( www.fda.gov/Drugs/
ciclos y recibieron alimento y agua ad libitum. El ratón CFKO Cftrtm1Unc Tg (FABPCFTR) -1Jaw / J 57 ( C57BL / 6 y FVB / NJ
GuidanceComplianceRegulatoryInformation / Guiados / ucm314718 ). a continuación, la endotoxina se fondo) fue utilizado en algunos experimentos. Estos ratones CFKO son heterocigotos para knockout de todo el cuerpo de
cuantificó usando un LAL cromogénico kit de cuantificación de endotoxinas (Thermo Scientific) según las CFTR murino y tienen expresión CFTR humano regulado por la expresión del promotor de la proteína de ácidos grasos
instrucciones del fabricante. vinculante. Como tal, la expresión de CFTR humano se limita a la intestino delgado y grueso con la viabilidad mejorada
posterior y no hay restricciones en la dieta o la suplementación dietética especial en comparación con el knockout de todo
el cuerpo. C57BL / 6 o de tipo salvaje de camada de ratones CFKO se utilizaron como ratones de tipo salvaje. Se han
liberación del fago a partir de partículas. Liofilizadas de fago-MPS se suspendieron en PBS y pfu totales se usado tanto en ratones hembra y macho (aleatorios) para los experimentos con ratones y compañeros de camada CFKO.
enumeraron usando el método de capa de agar superior. Para la liberación del fago, fago-MPS se centrifugaron Solamente los ratones machos se utilizaron para los experimentos que implicaban ratones C57BL / 6. Todos los animales
a 500 gramo durante 5 min y el sobrenadante se ensayó para pfu fueron utilizados dentro del rango de edad de semana 8-14A.

In vitro fagocitosis fago-MP. macrófagos RAW264.7 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco
suplementado con 4,5 gl -1 glucosa y suero bovino fetal al 10% en placas de 24 pocillos a 37 ° C y 5,0% de CO 2 en un
incubador humidificado. partículas DiI marcado fluorescentes fueron sintetizados como se describe anteriormente. Las En la exposición bacteriana vivo. Los ratones se colocaron bajo anestesia general con una inyección
partículas más pequeñas (0,94 ± 0.59 μ m) se generaron mediante la modificación de la velocidad de homogeneización a intraperitoneal de ketamina y xilazina (100 mg kg - 1 y 10 mg kg - 1,
10.000 rpm La mezcla PAO1 fago se cargó en las MPs. Después de la carga, MPs de diferentes tamaños se añadieron respectivamente). Polvo seco de fago-MPS (1,0 mg) se entregan a los pulmones a través de un polvo seco
a medio de cultivo tisular a una concentración de 0,25 mg ml -1 y se incubaron con las células durante 2 h. Las células se Insuflador (modelo DP-4M; Penn-Century). Las bacterias se inocularon usando un montaje microsprayer jeringa
lavaron 5 veces con PBS para eliminar las partículas en exceso, se fijaron, y se tiñeron con (modelo MSA-250-M; Penn-Century) mediante la inyección de 50 μ l de la densidad óptica apropiada de solución
bacteriana a través de un tubo endotraqueal. entrega de pulmón exitosa se confirmó por un cambio en la

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el estado respiratorio del animal. Los ratones se colocaron bajo una lámpara de calentamiento y se dejaron recuperar de referencias
la anestesia general. Algunos 18-24 h después de la instilación intratraqueal de las bacterias, los ratones fueron 1. Niederman, MS desafíos en el tratamiento de la neumonía adquirida en la comunidad: el papel
sacrificados por sobredosis intraperitoneal de pentobarbital (150 mg kg - 1; Euthasol) para la recolección de órganos. Para el de las quinolonas y moxifloxacina. Clin. Infectar. Dis. 41,
ensayo de recuento de fagos en los tejidos, órganos fueron explantados, se pesaron y homogeneizaron en PBS estéril. S158-S166 (2005).
Los homogenados se diluyeron en serie y se cultivaron en placas de agar de caldo de lysogeny fortificados con ampicilina 2. Klevens, RM et al. infecciones y muertes de salud estimar asociadas a la atención en hospitales de Estados
(100 μ g ml - 1) para seleccionar para PAO1-GFP o PA103. diluciones en serie homogeneizado También se titularon para Unidos, 2002. Rep Salud Pública. 122, 160-166 (2007).
fagos en la inoculación de las bacterias, ya sea PAO1-GFP o PA103. Las placas de cultivo se incubaron a 37 ° C bajo 3. Registro de Pacientes 2015 Informe Anual de Datos ( Fundación de Fibrosis Quística, 2015).
atmósfera de CO 2, y las colonias bacterianas o placas se contaron después de 16 h de incubación. Para las infecciones 4. Cohen, TS & Prince, A. fibrosis quística: un síndrome de la mucosa de la inmunodeficiencia. Nat.
mixtas, morfología de la colonia se utiliza para distinguir las diferentes cepas de bacterias. El límite de detección de las Medicina. 18, 509-519 (2012).
colonias se definió como diez colonias en placas de homogeneizado de pulmón no diluidos para prevenir contando ningún
5. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, PO, Wang, H. & Hoiby, N. La resistencia antimicrobiana, infecciones del
fragmentos de tejido de pulmón como falso positivo.
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respuesta inmune contra los fagos. Los ratones recibieron ningún tratamiento o polvo seco formulaciones de fago-MPS
7. Weiner, LM et al. patógenos resistentes a los antimicrobianos asociados con las infecciones asociadas a la salud:
o MPs vacías. Después de 21 d, todos los ratones fueron retados con las bacterias y, o bien tratados con fagos-MPS o se
resumen de los datos comunicados a la Red Nacional de Seguridad en Salud en los Centros para el Control y
dejan sin tratar. Los ratones se sacrificaron después de 18 h y se ensayaron para fagos y bacterias tal como se describe
la Prevención de Enfermedades 2011-2014. Infectar. Hosp de control. Epidemiol. 37, 1288-1301 (2016).
anteriormente. Para todos los puntos de tiempo (días 0, 21 y 22), se recogió el suero a través de una purga mejilla. Para
someter a ensayo para la presencia de anticuerpos, los fagos se incubaron en una placa de 96 pocillos durante 1 h y se
8. Johansen, HK, Moskowitz, SM, Ciofu, O., Pressler, T. & Hoiby, N. Spread de colistina resistente no
lavaron varias veces con 0,05% v / v Triton X-100 en PBS. Las muestras fueron luego incubadas en 1% w / v bloqueador
mucoide Pseudomonas aeruginosa entre los pacientes con fibrosis quística con infección crónica
de caseína (Life Technologies) y se trataron con suero recogido en cada punto de tiempo (diluido 1:10 en PBS) durante 1
daneses. J. quiste. Fibros. 7, 391-397 (2008).
h. Los pocillos se incubaron entonces con anticuerpo anti-ratón con fosfatasa alcalina conjugada (1 μ g ml -1) ( 715-055- 151;
9. Gould, im la epidemiología de la resistencia a los antibióticos. En t. J. Antimicrob.
Jackson ImmunoResearch). Después de varios lavados, las muestras se incubaron con sustrato de fosfato umbeliferil
agentes 32, S2-S9 (2008).
5-metil (60 μ g ml -1) y la fluorescencia se leyó a una excitación de 360 ​nm y una emisión de 465 nm en un lector de placas
10. Gómez, MI & Prince, A. Las infecciones oportunistas en la enfermedad pulmonar:
Plus HTS 7000 (Perkin Elmer).
Pseudomonas infecciones en la fibrosis quística. Curr. Opin. Pharmacol. 7,
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11. Ciofi Degli Atti, M. et al. Un brote de extremadamente resistente a los medicamentos

Pseudomonas aeruginosa en un hospital pediátrico terciario en Italia. BMC Infect. Dis. 14, 494
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resistencia a los fagos. Las colonias individuales recuperadas de ratones tratados con fago-MP se suspendieron en PBS y
12. Sprenger, M. & Fukuda, resistencia K. antimicrobianos. Nuevos mecanismos, nuevas preocupaciones. Ciencia 351,
se sembraron en placas de agar de tripticasa de soja. A 10 μ l gota de la mezcla fago original fue descubierto en el agar
1263-1264 (2016).
blando sembrado con la cepa huésped adecuada y se dejó crecer durante 16 h a 37 ° C. Las bacterias se definieron como
13. Donlan, RM La prevención de biopelículas de organismos clínicamente relevantes utilizando bacteriófago. Trends
susceptibles a la mezcla de fago si la mancha se limpió de cualquier crecimiento bacteriano después de la incubación
Microbiol. 17, 66-72 (2009).
durante 16 h.
14. Servick, K. desarrollo de fármacos. ensayo de terapia de fagos asediado presiona.
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15. Geier, MR, Trigg, ME & Merril, CR El destino del bacteriófago lambda en ratones libres de gérmenes no
imágenes de animales vivos. Pelo en el dorso se retiró y el animal fue fotografiada utilizando 750 nm de
inmunes. Naturaleza 246, 221-223 (1973).
excitación y 800 nm de emisión con un sistema de IVIS SpectrumCT (Perkin Elmer) o un sistema de imagen de
16. Bruttin, A. y Brüssow, H. voluntarios humanos que recibe Escherichia coli fago
fluorescencia Molecular de Positrones (Perkin Elmer). La intensidad de fluorescencia se analizó usando el
T4 por vía oral: una prueba de seguridad de la terapia de fagos. Antimicrob. Agentes Chemother. 49,
software del fabricante.
2874-2878 (2005).
17. Hughes, KA, Sutherland, IW, Clark, J. & Jones, MV Bacteriófago y asociados de polisacáridos
histología pulmonar. Los pulmones se recogieron en la necropsia, se fijaron en formalina al 10% tamponada neutra
despolimerasas-nuevas herramientas para el estudio de las biopelículas bacterianas. J. Appl. Microbiol. 85,
durante 16 h, se lavaron con PBS, se deshidrataron en etanol al 70% y embebidas en parafina. Secciones (5 μ m) se
583-590 (1998).
cortaron usando un microtomo H Microm 355 y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Para la inmunohistoquímica, las
18. Biswas, B. et al. terapia Bacteriófago rescata ratones bacteriémica partir de un aislado clínico de resistentes
secciones se trataron con 0,05% de tripsina durante 10 min a 37 ° C, se bloquearon con suero de cabra y se tiñeron con
a la vancomicina Enterococcus faecium. Infectar. Immun.
anti-conejo P. aeruginosa anticuerpos (ab68538; Abcam). Los portaobjetos se lavaron, se bloquearon con suero de cabra
70, 204-210 (2002).
y luego teñidas con AlexaFluor cabra 555 conjugado con IgG anti-conejo (A21428; Thermo Scientific) y DAPI. Para las
19. Chanishvili, N., Chanishvili, T., Tediashvili, M. & Barrow, PA fagos y su aplicación contra las bacterias
imágenes cryosection pulmonares, parlamentarios fluorescentes fueron entregados y los ratones fueron sacrificados
resistentes a los fármacos. J. Chem. Technol. Biotechnol.
inmediatamente. Se recogieron los pulmones, montado en la temperatura óptima de corte (OCT) masa de inclusión y
76, 689-699 (2001).
flash congelado en nitrógeno líquido. Secciones (10-20 μ m de espesor) se cortaron usando un criostato (Leica CM3050
20. Wright, A., Hawkins, CH, Änggård, EE & Harper, DR Un ensayo clínico controlado de una preparación
S). Los portaobjetos se secaron a temperatura ambiente durante 30 min, se lavaron con PBS y se tiñeron con DAPI.
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Análisis estadístico. Todos los experimentos se realizaron en réplicas biológicas independientes. Los tamaños de muestra
22. Dufour, N., Delattre, R., Ricard, JD y Debarbieux, L. La lisis de patógenos Escherichia coli por
para cada grupo experimental y las pruebas estadísticas utilizadas para determinar las diferencias significativas entre los
bacteriófagos libera menos que por endotoxina
grupos se presentan en las leyendas de las figuras correspondientes. Las pruebas no paramétricas se utilizaron si los datos
β - lactámicos. Clin. Infectar. Dis. 64, 1582-1588 (2017).
no cumplía con los supuestos de t- pruebas o análisis de la varianza (ANOVA). Para los experimentos in vitro, tamaño de la
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muestra no estaba predeterminado, y todas las muestras se incluyeron en el análisis. Para los experimentos con animales, se
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determinó tamaño de la muestra sobre la base de los cálculos de potencia para detectar un 20% de diferencias entre las
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medias usando las diferencias de los experimentos / piloto anteriores. Todos los animales fueron utilizados para el análisis a
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menos que los ratones murieron o tuvieron que ser sacrificados debido a los criterios de la eutanasia predefinidos (tales como
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pérdida de peso significativa o falta de respuesta a los estímulos externos) según los protocolos aprobados por Comité
entregados de manera eficiente. Nat. Biotechnol. 32,
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Disponibilidad de datos. Los autores declaran que todos los datos que apoyan las conclusiones de este estudio e00954-17 (2017).
están disponibles dentro del papel y su información complementaria. Los datos en las figuras están disponibles en 28. Jennes, S. et al. El uso de bacteriófagos en el tratamiento de colistina-solamente- sensible Pseudomonas

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xx xx xxxx
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Naturaleza Ingeniería Biomédica | www.nature.com/natbiomedeng


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50. Dhanda, DS, Tyagi, P., Mirvish, SS y Kompella, la tecnología de fluidos supercríticos UB basados ​grandes fue escrito por RA, NAM y AJG Todos los autores examinaron los resultados y revisó el manuscrito.
micropartículas porosas celecoxib-PLGA no inducen fibrosis pulmonar y mantener la administración de
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La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a AJG
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54. Diraviam Dinesh, S. medio esputo Artificial. Protoc. Exch. https: // doi. Nota del editor: Springer Naturaleza se mantiene neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados

org / 10.1038 / protex.2010.212 (2010). y afiliaciones institucionales.

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investigación de la naturaleza | resumen de informes
Autor correspondiente (s): Andres J. Garcia

Resumen de informes
Investigación de la Naturaleza desea mejorar la reproducibilidad de la obra que publicamos. Esta forma proporciona una estructura para la consistencia y la transparencia en la información. Para más información sobre las
políticas de investigación naturaleza, véase Autores y árbitros y el Lista de verificación de la política editorial .

Los parámetros estadísticos


Cuando se informaron los análisis estadísticos, confirmar que los siguientes elementos están presentes en la ubicación pertinente (por ejemplo leyenda de la figura, leyenda de la tabla, texto principal, o sección de

Métodos). n / a Confirmado

El tamaño exacto de la muestra ( norte) para cada grupo / condición experimental, dada como un número discreto y unidad de medida Una indicación de si las

mediciones se tomaron a partir de muestras diferentes, o si la misma muestra se midió repetidamente la prueba (s) estadístico utilizado y si son de uno o dos caras

Sólo las pruebas comunes deben describirse únicamente por su nombre; describir las técnicas más complejas en la sección Métodos.

Una descripción de todas las covariables probado

Una descripción de ninguna hipótesis o correcciones, como las pruebas de normalidad y de ajuste para comparaciones múltiples Una descripción completa de las estadísticas incluyendo tendencia

central (por ejemplo, medios) o otras estimaciones básicas (por ejemplo, coeficiente de regresión) y la variación (por ejemplo, desviación estándar) o estimaciones asociados de incertidumbre (por

ejemplo, intervalos de confianza) Para la prueba de hipótesis nula, la estadística de prueba (por ejemplo, F, t, r) con intervalos de confianza, los tamaños del efecto, grados de libertad y PAG valor señaló

Dar valores P como valores exactos cuando sea adecuado.

Para el análisis Bayesiano, la información sobre la elección de distribuciones previas y la configuración de Monte Carlo de la cadena de Markov para diseños jerárquicos y

complejos, la identificación del nivel apropiado para ensayos y un informe completo de los resultados Las estimaciones de los tamaños del efecto (por ejemplo, Cohen de re, Pearson

r), indicando las barras de error claramente definidos cómo se calcularon

Estado explícitamente lo representan las barras de error (por ejemplo, SD, SE, CI)

Nuestra colección web en estadísticas para los biólogos puede ser útil.

Software y el código
información sobre la política disponibilidad de código informático

Recopilación de datos No se utilizó ningún software.

Análisis de los datos ImageJ se utilizó para analizar las imágenes, GraphPad Prism 7.03.

Para manuscritos que utilizan algoritmos o programas personalizados que son fundamentales para la investigación, pero aún no descrita en la literatura publicada, el software debe estar disponible para editores / revisores a petición. Recomendamos encarecidamente a la deposición
de código en un repositorio de la comunidad (por ejemplo GitHub). Ver la Investigación de la Naturaleza directrices para la presentación de código y software para mayor información.

Datos

información sobre la política disponibilidad de datos


de abril de 2018

Todos los manuscritos deben incluir una declaración de disponibilidad de datos . Esta declaración debe proporcionar la siguiente información, en su caso:

- códigos de adhesión, identificadores únicos, o enlaces de Internet para los conjuntos de datos disponibles públicamente

- Una lista de figuras que han asociado los datos en bruto

- Una descripción de cualquier restricción en la disponibilidad de datos

Los autores declaran que todos los datos que apoyan las conclusiones de este estudio están disponibles dentro del papel y su información complementaria. Los datos en las figuras están disponibles en el autor
correspondiente a petición.

1
investigación de la naturaleza | resumen de informes
informes-Field específica
Por favor, seleccione la mejor opción para su investigación. Si no está seguro, lea las secciones correspondientes antes de hacer su selección.

Ciencias de la vida De comportamiento y ciencias sociales La ecología, evolutivos y ambientales


Para una copia de referencia del documento con todas las secciones, consulte nature.com/authors/policies/ReportingSummary-flat.pdf

diseño de estudio de ciencias de la vida


Todos los estudios tienen que revelan en estos puntos, incluso cuando la divulgación es negativo.

Tamaño de la muestra Los tamaños de muestra fueron seleccionados sobre la base de cálculos estadísticos potencia y de la experiencia previa con estos parámetros.

exclusiones de datos se excluyeron los datos.

Replicación Los hallazgos se reprodujeron de forma fiable.

Las muestras de aleatorización / animales se asignaron aleatoriamente en grupos experimentales.

Cegador El cegamiento no se hizo. Phage puede fácilmente contaminar las muestras y por lo tanto es esencial para que el usuario sabe qué grupos contienen fago.

Reporting para materiales, sistemas y métodos específicos

Materiales y sistemas experimentales métodos


n / a participó en el estudio n / a participó en el estudio

Los anticuerpos únicos materiales Flujo chip-ss citometría de

biológicos neuroimagen basada en RM

líneas celulares eucariotas

Paleontología

Animales y otros organismos participantes

en la investigación Humanos

materiales biológicos únicos


información sobre la política disponibilidad de materiales

La obtención de materiales únicos fagos se aislaron y catalogados por el Laboratorio de biopelículas en los CDC u obtenidos de bancos disponibles para la comunidad científica.
Todos están disponibles para la comunidad científica.

Los anticuerpos

Los anticuerpos utilizados Anticuerpo primario: anticuerpo anti-Pseudomonas de Abcam. Número de catálogo: ab68538. Clonalidad: policlonal página web Abcam afirma que es la prueba de
Immonofluorescence e inmunohistoquímica. También ofrece 4 referencias en la página web. No hay validación se llevó a cabo en nuestro laboratorio.

Anticuerpo secundario: fosfatasa alcalina (ALP) conjugado con anticuerpo anti-ratón. Jackson Immunoresearch. Número de catálogo: 715-055-151. Clonalidad:
policlonal

Validación Anticuerpo primario: anticuerpo anti-Pseudomonas de Abcam. Número de catálogo: ab68538. Clonalidad: policlonal página web Abcam afirma que es la prueba de
Immonofluorescence e inmunohistoquímica. También ofrece 4 referencias en la página web. No hay validación se llevó a cabo en nuestro laboratorio.
de abril de 2018

Anticuerpo secundario: fosfatasa alcalina (ALP) conjugado con anticuerpo anti-ratón. Jackson Immunoresearch. Número de catálogo: 715-055-151. Clonalidad:
policlonal

2
investigación de la naturaleza | resumen de informes
líneas de células eucariotas

información sobre la política líneas celulares

fuente (s) línea celular RAW264.7 (ATCC)

Autenticación Las líneas celulares se examinaron visualmente para condiciones de morfología y de crecimiento descritas. No se utilizó ningún otro tipo de autenticación.

contaminación Mycoplasma Nuestro laboratorio regularmente (una vez al año) pone a prueba todas las líneas celulares de contaminación por micoplasma. No se encontró contaminación por micoplasma.

líneas comúnmente mal identificados (Ver ICLAC Sin comúnmente se utilizaron líneas mal identificados.
registro)

Animales y otros organismos


información sobre la política Los estudios con animales ; LLEGA directrices recomendado para registrar la investigación con animales

Los animales de laboratorio La información sobre los animales utilizados se describe claramente en los pies de figura pertinentes.

Animales salvajes El estudio no incluyó los animales salvajes.

muestras de campo recogidas El estudio no incluyó muestras recogidas en el campo.

de abril de 2018