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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN

CAMPUS CIENCIAS DE LA SALUD

FACULTAD DE QUÍMICA

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

LABORATORIO DE BIOCIENCIAS

EVALUACIÓN DE PRODUCTO
ACTIVIDAD GENOTÓXICA EN EL MATERIAL PARTICULADO
FRACCIÓN RESPIRABLE PM2.5 EN MÉRIDA, YUCATÁN,
MÉXICO.

ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN................................................................................................4
II. ANTECEDENTES...............................................................................................4
II.1 Índice de calidad del aire de la zona metropolitana de Mérida.........................5
II.2 Origen y composición del material particulado..................................................5
II.3 Análisis del potencial citotóxico y genotóxico....................................................6
II.3.1 Método de extracción de PM2.5...................................................................6
II.3.2 Prueba de genotoxicidad............................................................................6
III.3.3 Cultivo celular............................................................................................7
III.3.4 Método de Ficoll-Paque............................................................................7
III.3.5 Pruebas de viabilidad celular....................................................................8
III.3.6 Azul de tripano..........................................................................................8
III.3.7 Prueba de bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5-difeniltetrazólico (MTT).
............................................................................................................................ 8
III. OBJETIVOS....................................................................................................9
III. 1 Generales.......................................................................................................9
III. 2 Específicos.....................................................................................................9
IV. HIPÓTESIS.....................................................................................................9
V. JUSTIFICACIÓN................................................................................................9
VI. DISEÑO EXPERIMENTAL............................................................................10
VI.1 Contexto........................................................................................................10
VI.2 Obtención del extracto de material orgánico extraíble (MOE) de PM2.5 a partir
del filtro de muestreo............................................................................................10
VI.3 Aislamiento de CMSP y viabilidad celular......................................................11
VI.4 Cultivo celular y ensayos de citotoxicidad......................................................11
VI.5 Genotoxicidad...............................................................................................12
VII. METODOLOGÍA...........................................................................................12
VII.1 Extracción de partículas PM2.5 a partir del filtro del muestreo.......................12
VII.2 Aislamiento de CMSP y viabilidad celular.....................................................12
VII.3 Cultivo celular y citotoxicidad.......................................................................13
VII.4 Genotoxicidad..............................................................................................13
VIII. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS...........................................................14
VIII.1 Viabilidad celular.........................................................................................14
VIII.2 Citotoxicidad................................................................................................14
VIII.3 Evaluación genotoxicidad del MOE por medio del ensayo cometa alcalino 14
VIII.4 Análisis estadístico......................................................................................15
IX. CRONOGRAMA............................................................................................16
X. REFERENCIAS................................................................................................17
I. INTRODUCCIÓN
La exposición a los contaminantes atmosféricos, como el material
particulado, se asocia con diferentes daños a la salud humana y la magnitud
de los efectos depende de las concentraciones que se encuentran en el aire,
de la dosis que se inhala, del tiempo y la frecuencia de exposición, así como
de las características de la población expuesta. Los hallazgos recientes de
estudios epidemiológicos realizados tanto en el contexto poblacional como
ocupacional, además de estudios toxicológicos y de exposición en seres
humanos, indican que las concentraciones que hoy se observan en
numerosas ciudades del país implican riesgos para la salud, debido a que se
encuentran por encima de los niveles establecidos por las normativas
nacional e internacional aplicables.
De acuerdo con la NOM-025-SSA1-2014 el Material Particulado (PM) es una
mezcla compleja de sustancias en estado líquido o sólido, que permanece
suspendida en la atmósfera por periodos variables de tiempo. Por su origen,
las partículas pueden definirse como primarias (aquellas producidas
directamente por alguna fuente contaminante) o secundarias (las que se
forman en la atmósfera, como resultado de la interacción química entre
gases y partículas primarias).1
En la actualidad, varios componentes del PM como los hidrocarburos
aromáticos policíclicos (HAP), los metales y sales inorgánicas, son
considerados responsables de efectos adversos en la salud ya que son
carcinógenos y citotóxicos. A nivel mundial, se estima que el PM causa
aproximadamente el 3% de los problemas cardiopulmonares y el 5% de las
muertes por cáncer de pulmón (WHO, 2013).2

II. ANTECEDENTES
La calidad del aire es un factor de gran importancia para la salud humana y
de los ecosistemas por las emisiones de gases que pueden dispersarse. En
grandes ciudades de México, se realiza el monitoreo de contaminantes que
determinan la calidad del aire: Bióxido de Azufre (SO 2), Bióxido de Nitrógeno
(NO2), PM, Monóxido de Carbono (CO) y Ozono (O 3) en zonas
metropolitanas y corredores industriales.
Es importante mencionar, que algunas de las consecuencias a la salud que
trae consigo la contaminación atmosférica se pueden presentar a corto o
largo plazo. Los principales efectos son: el riesgo de padecer enfermedades
respiratorias agudas, como neumonía, y crónicas, como el cáncer de pulmón
y las enfermedades cardiovasculares. 3
II.1 Índice de calidad del aire de la zona metropolitana de Mérida
En la ciudad de Mérida fue realizado un estudio en el año 2013 que consistió
en monitoreos constantes sobre la calidad del aire de la zona centro y sur
poniente de ésta ciudad, a través del uso de indicadores obtenidos de datos
monitoreados para los contaminantes criterio, con base al INECC-
SEMARNAT, 2013: SO2, NO2, Material Particulado de 2.5 μg/m 3 (PM2.5) y 10
μg/m3 (PM10), CO y O3, leyendo e interpretando los resultados dentro de los
rangos del Índice Metropolitano de la Calidad del Aire (IMECA) para
determinar la calidad del aire y los efectos a la salud humana de los
habitantes de la ciudad de Mérida.
La interpretación de los resultados IMECA obtenidos de la caseta de
SEDUMA durante 2013, presentan una calidad del aire buena, a excepción
del mes de abril, donde las partículas determinaron que la calidad del aire fue
regular debido a una presencia ligeramente elevada de PM 2.5. De forma
general, en lo que respecta a la caseta ubicada en periférico se presenta una
buena calidad del aire, la caseta ubicada en Hunxectamán, presentó una
calidad regular en el mes de octubre a través del parámetro CO, una calidad
muy mala en el mes de junio en cuanto al SO 2 y una extremadamente mala
calidad del aire en el mes de julio al mismo contaminante, y a lo que los
siguientes meses respecta se mantuvo con una buena calidad, en la caseta
ubicada en Tixcacal, que en todo el año la calidad del aire fue buena. 3

II.2 Origen y composición del material particulado


El material particulado es un conjunto de partículas sólidas y líquidas
emitidas directamente al aire, tales como el hollín de diesel, polvo de vías, el
polvo de la agricultura y las partículas resultantes de procesos productivos.
Estas partículas en suspensión son una compleja mezcla de productos
químicos y/o elementos biológicos, como metales, sales, materiales
carbonosos, orgánicos volátiles, compuestos volátiles (COV), HAP y
endotoxinas que pueden interactuar entre sí formando otros compuestos.
Debido a que son de tamaño, forma y composición variada, para su
identificación se han clasificado en términos de su diámetro aerodinámico
que corresponde al diámetro de una esfera uniforme en unidad de densidad
que alcanza la misma velocidad terminal de asentamiento que la partícula de
interés y que está determinado por la forma y densidad de la partícula. 4
El PM2.5 (partículas menores o iguales a 2.5 μg/m 3) consiste en varios
compuestos comúnmente asociados con partículas ácidas, por la combustión
de combustibles fósiles, producción manufacturera y quema agrícola. La
OMS determinó sus concentraciones como de riesgo para la salud humana,
así: 10 μg/m3 (media anual) y 25 μg/m3 (media diaria). La concentración de
la contaminación puede afectarse por cambios en el clima (humedad,
precipitaciones, vientos, etc.); además, es difícil controlar simultáneamente
los múltiples contaminantes y separar e identificar los efectos de cada uno de
ellos, debido a que muchos contaminantes se generan a través de la misma
fuente y, por lo tanto, están correlacionados. De acuerdo a la NOM-025-
SSA1-2014, los límites permisibles de PM 2.5 en 24 horas es de 45 µg/m 3 y el
límite permisible anual es de 12 µg/m3.1, 5

II.3 Análisis del potencial citotóxico y genotóxico


II.3.1 Método de extracción de PM2.5
La evaluación citotóxica y genotóxica de la mezcla compleja de los filtros
PM2.5, implica protocolos de extracción de las partículas de PM 2.5; en algunos
estudios se realiza con diclorometano en equipo soxhlet, luego se concentran
los extractos en rotaevaporador al vacío. En el método, propuesto por
Hamers et al.6 los filtros se desecan a 45% de humedad relativa, se pesan y
se almacenan a -20ºC. Otra técnica de extracción empleada para este tipo de
muestra es la asistida por ultrasonido, la cual se fundamenta en el uso de
sonidos de alta frecuencia, con el fin de desprender el compuesto de interés.
Las partículas sólidas y liquidas vibran y se aceleran permitiendo el paso del
soluto de la fase sólida al solvente.2
II.3.2 Prueba de genotoxicidad
El bioensayo cometa, también conocido como electroforesis alcalina de
células individuales (del inglés: Single Cell Gel Electrophoresis Assay), es
una prueba que evalúa el daño del material genético causado por diferentes
agentes químicos y físicos.
Desde hace varias décadas el ensayo cometa, o electroforesis alcalina de
células individuales, se ha convertido en un método establecido para el
estudio del daño de Ácido Desoxirribonucleico (DNA), con múltiples
aplicaciones en ensayos de genotoxicidad, estudios de biomonitoreo en
humanos, epidemiologia molecular y ecotoxicología; así como una
herramienta fundamental para investigaciones sobre daño y reparación del
DNA. Este ensayo se distingue por su simplicidad, sensibilidad, versatilidad,
rapidez y economía. Es una poderosa técnica que se basa en la visualización
microscópica de las imágenes del DNA después que las células son
embebidas en agarosa, lisadas y sometidas a una electroforesis alcalina.
Esta metodología básica ha sido ampliada, y permite ahora, detectar con alta
sensibilidad una gran variedad de daños del material genético en cualquier
tipo de células. La inclusión en este ensayo, de enzimas capaces de producir
lesiones específicas en la hebra de DNA, ha incrementado su rango de
detección y sensibilidad. Pero es importante tener claro que su especificidad
no es absoluta.7
III.3.3 Cultivo celular
El cultivo celular es un proceso a través del cual se depositan células en un
medio de cultivo y en las condiciones adecuadas con la finalidad de
promover su multiplicación y desarrollo, y esto con el objetivo de utilizar estas
células en estudios y ensayos in vitro, como el estudio de patologías y
afecciones inmunológicas y tumorales, desarrollo de terapias, y estudios
farmacológicos y citotóxicos.
El desarrollo de esta técnica presenta ventajas frente a la investigación con
animales vivos, ya que permite, por un lado, el control del ambiente en el
cual se desarrollan las células, y, por otro lado, analizar un tipo celular
aislado, como las Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP)
utilizando Ficoll-Paque.
Para que las células puedan mantenerse y proliferar, deben ser cultivadas en
un medio de cultivo adecuado que contenga aminoácidos esenciales,
carbohidratos, vitaminas, minerales y suero. Además, se requiere un
ambiente adecuado con la temperatura (mayormente de 37ºC), pH
(normalmente entre 7.2 y 7.4), tensión de CO2 (entre 5% y 7%) y humedad.
Existen dos tipos básicos de cultivo celular: los cultivos primarios, que se
refieren al primer cultivo in vitro de células obtenidos directamente del
organismo, y la línea celular, que es un subcultivo a partir de un cultivo
primario. En ambos casos se obtienen células con características similares
entre sí, otorgando fiabilidad a los resultados de los experimentos que se
deseen realizar en estos cultivos. 8
III.3.4 Método de Ficoll-Paque
El aislamiento de CMSP tiene la finalidad de obtener este tipo celular para
que exista una homogeneidad en las características estructurales y
funcionales, y así, el resultado que se obtenga sea confiable. 9
Para el aislamiento de CMSP se utiliza el método de separación por
gradiente de densidad de ficoll. Para esto, se utiliza un medio que permita
esta separación, como el Ficoll-Paque. Este medio posee ficoll 400 (un
polímero de sacarosa y epiclorhidrina) y diatrizoato de sodio que junto con el
ficoll forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad. Durante la
centrifugación, el ficoll 400 produce aglutinación de los eritrocitos,
provocando que éstos sedimenten fácilmente. Los granulocitos presentan
mayor densidad que el medio, por lo que también sedimentan. Los linfocitos
y monocitos poseen densidad menor a la del medio, pero mayor a la del
plasma y las plaquetas, por lo que las células mononucleares se observan en
el anillo blanco que se forma entre el plasma y el ficoll-diatrizoato. 2,9
III.3.5 Pruebas de viabilidad celular
Los protocolos que determinan la integridad de la membrana y del
citoesqueleto, el metabolismo celular, síntesis y degradación de moléculas, la
liberación de constituyentes celulares o productos, la regulación iónica y la
división celular, se utilizan como medidas de viabilidad e integridad celular. 2
III.3.6 Azul de tripano
El azul de tripano (azul diamina, azul niagara, azul vital) es un colorante
derivado de la toluidina que posee la capacidad de teñir a tejidos y células
muertas. Su nombre se deriva de su capacidad para matar a los
tripanosomas, parásitos causales la enfermedad de Chagas en América,
enfermedad del sueño en África y leishmaniasis). Este colorante es uno de
varios empleados para evaluar la viabilidad de células por exclusión de
captación, ya que no puede penetrar y teñir a las células vivas con
membranas íntegras. El azul de tripano no es necesario para realizar conteos
simples de células, pero sí es imprescindible para diferenciar entre las
células muertas (con disrupción membranal) de las vivas con membranas
íntegras. En este procedimiento, una suspensión de células mononucleares
(CMN) es mezclada con una solución al 0.4% de azul de tripano antes de ser
observada bajo el microscopio haciendo uso de un hemocitómetro de
Neubauer.10
III.3.7 Prueba de bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5-
difeniltetrazólico (MTT).
La citotoxicidad se refiere a la alteración de las funciones celulares básicas,
interferencia con la estructura y proliferación, lo que produce un daño en la
célula. Este daño celular puede ser detectado mediante diversas técnicas
con la finalidad de determinar el posible efecto tóxico de fármacos y otros
compuestos, utilizando como modelos experimentales cultivos primarios y/o
órganos aislados. Dentro de los ensayos validados, se encuentra el de
reducción del MTT.11
El ensayo por reducción del MTT se basa, como su nombre lo indica, en la
reducción metabólica de este compuesto por acción de la enzima succinato-
deshidrogenasa mitocondrial cuando es captado por las células y
transformándolo en su forma insoluble formazán. Éste se mantiene en las
células, aunque puede ser liberado mediante la solubilización de las
mismas.11, 12
La capacidad de reducir el MTT constituye un indicador de la integridad de
las mitocondrias y su actividad funcional, lo que es interpretado como una
medida de la viabilidad celular. La capacidad celular de transformar MTT en
formazán después de haber sido expuestas a algún compuesto permite
obtener información acerca de su toxicidad.12

III. OBJETIVOS
III. 1 Generales
Determinar el potencial citotóxico y genotóxico del material particulado menor
a 2.5 µg/m3 (PM2.5) de naturaleza orgánica en CMSP en la ciudad de Mérida,
Yucatán, México.
III. 2 Específicos
1) Extraer el PM2.5 de naturaleza orgánica contenido en los filtros de la
estación de monitoreo de la Secretaría de Desarrollo Urbano y Medio
Ambiente del Gobierno del Estado de Yucatán (SEDUMA).
2) Extraer, aislar y cultivar las CMSP humanas de un de un individuo sano.
3) Evaluar los efectos citotóxico y genotóxico del PM 2.5 en la línea celular de
las CMSP.

IV. HIPÓTESIS
El PM2.5 posee actividad citotóxica y genotóxica en las células mononucleares
de sangre periférica a la concentración a la que se muestrearon en la ciudad
de Mérida, Yucatán, México.

V. JUSTIFICACIÓN
Actualmente, la contaminación atmosférica es uno de los principales
problemas que enfrenta el hombre; un quinto de la población latinoamericana
está expuesta a este tipo de contaminación. La falta de planeación urbana, el
crecimiento demográfico y el aumento de automóviles, son algunas de las
causas del aumento de los contaminantes atmosféricos que afecta a más de
80 millones de personas y es responsable de más de 2 millones de
casos/año de enfermedades respiratorias en niños latinoamericanos. 2
La calidad del aire es un factor de gran importancia para la salud humana y
de los ecosistemas por las emisiones de gases que pueden dispersarse. Los
resultados IMECA obtenidos de la caseta de SEDUMA durante 2013,
presentan una buena calidad del aire, a excepción del mes de abril, donde
las partículas determinaron que la calidad del aire fue regular debido a una
presencia ligeramente elevada de partículas PM 2.5.3
Existe información en donde se evidencia que inclusive a concentraciones
inferiores al nivel máximo permisible de PM 10 se observa una genotoxicidad
significativa, y dado que las PM 2.5, son partículas más finas y poseen una
mayor facilidad de entrar a los alvéolos pulmonares (mayor factor de riesgo
en la salud), resulta importante evaluarlas en la ciudad de Mérida. 13
La exposición prolongada a altas concentraciones de PM aumenta el riesgo
de cáncer de pulmón, enfermedades respiratorias y arteriosclerosis, mientras
que la exposición a corto plazo puede agudizar enfermedades respiratorias
como bronquitis, asma, y el ritmo cardíaco. Se ha demostrado que las
partículas más pequeñas son más tóxicas debido a su más alto contenido de
materia orgánica y mayor capacidad de generar radicales libres.
Los mecanismos biológicos de estas asociaciones son desconocidos, sin
embargo estudios toxicológicos in vitro han demostrado que el PM induce
varios tipos de efectos citotóxico, mutagénico, daño en el DNA y estimulación
de la producción de citoquinas pro-inflamatorias, entre otros. 2

VI. DISEÑO EXPERIMENTAL


VI.1 Contexto
El experimento se realizará en la ciudad de Mérida, Yucatán, a partir de filtros
proporcionados por la SEDUMA del índice de PM 2.5 monitoreado. Esto con el
uso de la información emitida por los servicios de ingeniería y consultoría
ambiental en su publicación “Índice de calidad del aire de la zona
metropolitana de Mérida”.3
Fueron proporcionados por la SEDUMA las muestras de PM 2.5 a partir de
filtros para aire de teflón, con un tamaño de poro de 2-2.5 micrómetros. Se
instalaron la caseta de monitoreo de la zona metropolitana de la ciudad de
Mérida y fueron recolectados por 24 horas, un filtro por semana, durante los
periodos estacionales: primavera (abril y mayo), verano (junio, julio, agosto,
septiembre), otoño (octubre y noviembre) e invierno (diciembre, enero,
febrero y marzo). Fue necesario solicitar el Total de Partículas Suspendidas
(TPS) recogido por filtro en cada muestreo.

VI.2 Obtención del extracto de material orgánico extraíble (MOE)


de PM2.5 a partir del filtro de muestreo
Los ensayos posteriores de citotoxicidad y genotoxicidad requieren una serie
de pasos preliminares de extracción del MOE de PM 2.5. Se usará el método
propuesto por Hamers et. al.6, en el cual se realiza una desecación del filtro a
45% de humedad relativa y se complementará con el método descrito por
Mendoza et. al.13, en el cual se añaden a los filtros, una vez pesados,
disolventes como el Diclorometano (DCM) en tubos de vidrio. La disolución
se lleva al baño de ultrasonido para un desprendimiento de las partículas del
papel y que éstas se queden embebidas en el disolvente. Después de un
procedimiento de rotaevaporación y disolución con solución tampón fosfato
alcalino (PBS, por sus siglas en inglés), se someterá a una segunda filtración
con un filtro mayor a las partículas PM 2.5, pero menor al tamaño de
microorganismos presentes (2-2.2 micrómetros) para la obtención de una
solución estéril, libre de microorganismos, que pudieran inducir algún tipo de
citotoxicidad.

VI.3 Aislamiento de CMSP y viabilidad celular


Para el ensayo de citotoxicidad de adoptará el método empleado por
Mendoza et. al.13, con ciertas modificaciones, en el que se obtendrán CMSP,
a partir de una extracción de sangre, por venopunción, en un tubo con
anticoagulante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en
inglés), de un individuo sano, no fumador o bebedor de alcohol y no
deportista de alto rendimiento (éstas condiciones restarían fundamento al
experimento por posibilidad de obtener citotoxicidad por el consumo de
alcohol o elementos que componen el tabaco). Se emplearán CMSP por ser
las células que se encuentran en mayor cantidad en la sangre, junto con los
neutrófilos.
Para realizar el cultivo, se deberá separar los componentes celulares de la
sangre y obtener únicamente las CMSP, para lo cual se empleará el método
por gradiente de concentración inducido por Ficoll-Paque. Las células
obtenidas se someterán a un lavado con PBS neutro y a una alícuota se
añadirá colorante azul de tripano para determinar la viabilidad celular por
conteo de leucocitos en una cámara de Neubauer, o bien, el método de
exclusión con este colorante. La viabilidad se calculará con la siguiente
fórmula:
No. células vivas
%Viabilidad celular= x 100
No .total de células

VI.4 Cultivo celular y ensayos de citotoxicidad


El ensayo de citotoxicidad se realizará en referencia a una viabilidad de más
del 95%, cifra que asegura que la mayor parte de las células están vivas y en
buenas condiciones metabólicas. Para ello se modificará el método usado
por Ruiz14, que indica el uso de 1x10 5 linfocitos por pocillo, en una placa de
96 pozos. Se usarán tres concentraciones del extracto de MOE de 25, 50 y
100 µg equivalente, por triplicado, más un control negativo y uno positivo
sometido a peróxido de hidrógeno (H 2O2) 100mM (presenta citotoxicidad
relacionada a su poder oxidante, según Lafón 15); serán añadidas al pocillo del
cultivo y se esperará su efecto por 24 horas. Para comprobar la citotoxicidad
que se presenta por exposición de las células al PM 2.5 se usará el Método de
MTT, el cual indicará si las células son viables después de la exposición
produciendo un cambio de color a púrpura, mismo que será medido por
fotometría de absorción, lo que finalmente ofrecerá un porcentaje de
proliferación celular a partir de la siguiente relación: 2
Absorbancia deltratamiento
de proliferación celular= x 100
Absorbancia del control no tratado

VI.5 Genotoxicidad
Para evaluar la genotoxicidad de las PM2.5 se usará el ensayo cometa
alcalino, método empleado por Mendoza et. al.13 el cual aprovecha las
células tratadas con el MOE extraído a partir del filtro. Se mezclará una
alícuota de tales células con agarosa de bajo punto de fusión. Esta mezcla
se sembrará en una lámina de Gelbond y se someterá a solidificación,
posterior a esto se realizará una lisis celular por 24 horas, añadiendo un
buffer de lisis que contiene Tritón X-100, DMSO, NaCl, EDTA que permitirán
la desestabilización de las membranas y la inactivación de enzimas líticas del
DNA y RNA, de modo que el daño visto, corresponda a las MOE del PM 2.5.
Terminado el periodo de lisis, las láminas se dejarán reposar en el buffer de
electroforesis (Na2EDTA y NaOH, pH 13.5) para permitir la correspondiente
desnaturalización o efecto en el DNA; se realizará una corrida electroforética
a 25mV y 300mA de resistencia a 4°C, por 30 minutos. Se hará un lavado de
las láminas con solución neutralizante de pH 7.5, y se usará bromuro de
etidio 2 μL/mL como colorante de la lámina. La lectura de los núcleos se
realizará en un microscopio de fluorescencia y se analizarán 100 células con
el software “Casp”, para cada tratamiento (concentraciones).

VII. METODOLOGÍA
VII.1 Extracción de partículas PM2.5 a partir del filtro del muestreo
Extraer el material orgánico por ultrasonicación usando DCM en una
proporción de 1 mL de disolvente por 1 mg TPS recogido. Sonicar un cuarto
de cada filtro durante 10 minutos por triplicado, posteriormente depurar con
filtros Fluoropore-Millipore. Los extractos se mezclaron para componer
grupos de cada temporada de la siguiente manera: Invierno (diciembre,
enero y febrero); primavera (marzo, abril y mayo); verano (junio, julio y
agosto) y otoño (septiembre, octubre y noviembre). Reducir el volumen de
extracto con un evaporador rotatorio al vacío y secar usando una corriente
suave de nitrógeno. Determinar la concentración de MOE y almacenar el
residuo a -20 °C en 10 mL de DCM.
VII.2 Aislamiento de CMSP y viabilidad celular
Extraer sangre mediante venopunción en dos tubos con anticoagulante
EDTA, inmediatamente después aislar las CMSP mediante gradiente de
densidad con Ficoll-Paque, adicionar 5 mL de sangre y 5 mL de solución
Ficoll-Paque (proporción 1:1); centrifugar a 1800 rpm por 30 minutos a
temperatura ambiente; posteriormente, recuperar la interfase que contiene
las CMPS para realizar dos lavados con 5 mL de PBS a 1000 rpm durante 7
min, luego de esto resuspender las células en 1 mL de medio Dulbecco
Modified Eagles minimal essential Medium (DMEM) complementado con
suero fetal bovino al 10%.
Diluir en proporción 1:1 la suspensión celular y el azul tripano al 0.04%,
posteriormente colocar la dilución en una cámara de Neubauer y realizar el
conteo de células viables y a partir de esto calcular el número de células
viables por mililitro y el porcentaje de viabilidad.

VII.3 Cultivo celular y citotoxicidad


Intercambiar alícuotas de la suspensión celular en los volúmenes de medio
DMEM complementado necesarios para obtener 1x10 5 linfocitos por pozo
contenidas en un volumen de 200 µL, sembrar un total de veinte pozos, de
los cuales corresponden tres a las concentraciones de los extractos, un
control negativo y uno positivo de peróxido de hidrógeno 100 mM evaluados
por cada temporada por triplicado en placas de 96 pozos. Incubar de 24-48
horas a 37ºC en atmósfera de 95% de humedad con 5% de CO 2.
Una vez transcurrido el periodo de incubación, decantar el medio
sobrenadante y agregar las diferentes concentraciones (25, 50 y 100 µg/mL)
de los extracto de MOE de cada temporada (invierno, primavera, verano y
otoño) en medio DMEM complementado. Incubar por 24 horas a 37° C en
atmósfera de 95% de humedad con 5% de CO 2. Centrifugar las placas a
1500 rpm por 15 minutos a 4°C y eliminar el sobrenadante.
Para evaluar la citotoxicidad mediante el método colorimétrico de MTT,
agregar 180 μL de medio DMEM complementado y 20 μL de la solución de
MTT disuelto en PBS a una concentración de 5 mg/mL. Al cabo de 2 horas
de incubación (a las condiciones de temperatura y atmósfera antes
mencionadas) centrifugar a 1000 rpm por 7 minutos, eliminar el
sobrenadante y agregar 100 μL de DMSO a cada pozo. Finalmente realizar la
lectura de la absorbancia a 620 nm en un lector de ELISA y calcular el
porcentaje de proliferación y citotoxicidad.
VII.4 Genotoxicidad
Mezclar 20 µL de células tratadas con 80 µL agarosa de bajo punto de fusión
al 0.5%, a partir de ésta mezcla sembrar 10 µL en la lámina del Gelbond,
luego de la solidificación a 4ºC llevar a una solución lisis fresca (NaCl 2.5 M,
Na2EDTA 100 mM, Tris 10 mM, sarcosinato de sodio 1%, Tritón X-100 y
DMSO 10%) durante 24 h. Al concluir este periodo, dejar las láminas 20
minutos en buffer de electroforesis (Na 2EDTA 1 mM y NaOH 300 mM a pH
13.5) para permitir la desnaturalización del DNA. Luego, realizar el corrido
electroforético a 25 mV o 300 mA por 30 minutos a 4ºC en condiciones de
oscuridad. Lavar las láminas Gelbond con solución neutralizante (Tris- HCl
0.4M a pH 7.5), teñir con bromuro de etidio 2 µL/mL y realizar la lectura de
los núcleos en un microscopio de fluorescencia, con filtro verde y
magnificación de 20X. Analizar 100 células para cada tratamiento con el
software Casp y expresar los resultados como longitud de cola del cometa
(micrómetros).

VIII. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS


VIII.1 Viabilidad celular
Tabla 1. Porcentaje de viabilidad celular

NC* en un cuadrante angular NC* NC* Viabilidad


de la cámara de Neubauer muertas vivas celular (%)

*NC: Número de células

VIII.2 Citotoxicidad
 Tabla 2. Porcentaje de citotoxicidad

X́ A ° del X́ A ° del % de % de
tratamiento control proliferación citotoxicidad

° X́ A: Promedio de las absorbancias

 Se realizará una gráfica de porcentaje de citotoxicidad en función a la


concentración. (Si la toxicidad es ˂10% se procede al análisis
genotoxicidad del MOE).

VIII.3 Evaluación genotoxicidad del MOE por medio del ensayo


cometa alcalino
Se analizarán 100 células para cada tratamiento con el software Casp y los
resultados se expresarán como longitud de cola del cometa en micrómetros.
El criterio para determinar daño genético será media de la longitud de cola
del control negativo más la desviación estándar más uno (X±DS+1). De
acuerdo a este valor, se clasificará arbitrariamente el tipo de daño (D) en
cinco categorías: D=0 células sin daño; D=1 células con daño bajo; D=2
células con daño medio; D=3 células con daño alto y D=4 células con daño
total. Con base en ellas se determinará el Índice de Daño Ponderado (IDP)
por tratamiento, según la fórmula propuesta por Ferreiro et al.17:
IDP=(n1 +2 n2+ 3 n3+ 4 n 4 )

Dónde:

n1 a n4 el número de células por categoría

Además, se considerará el Factor de Inducción (FI) de daño, como el


incremento relativo de la longitud de cola del tratamiento con relación a la
longitud de cola del control así:
Xa
FI a =
Xc

Dónde:

FIa es el factor de inducción de la concentración o tratamiento a

Xa corresponde al promedio de la longitud de cola de la concentración a

Xc es el promedio de la longitud de cola del control negativo.

Adicionalmente, se incluirá la frecuencia de las células dañadas en cada


tratamiento.

VIII.4 Análisis estadístico


Las diferencias de los resultados entre los periodos estacionales con
respecto a los tratamientos se evaluarán mediante la prueba de Kruskal-
Wallis.
IX. CRONOGRAMA

MESES
ACTIVIDADES 2018 2019
AGO SEP OCT NOV DIC ENE
Extraer las PM2.5 de naturaleza
orgánica contenido en los filtros
de la estación de monitoreo de la
SEDUMA, Yucatán.
Extraer, aislar y cultivar las
CMSP humanas de un de un
individuo sano.
Determinar la citotoxicidad de
las PM2.5 de naturaleza orgánica
en la línea celular de CMSP.
Demostrar la genotoxicidad de
las PM2.5 en la línea celular
CMSP.
Integración y análisis de
resultados.
X. REFERENCIAS
1) Norma Oficial Mexicana NOM-025-SSA1-2014, salud ambiental. Valores
límite permisibles para la concentración de partículas suspendidas PM 10 y
PM2.5 en el aire ambiente y criterios para su evaluación.
2) Betancur Sánchez, A. Evaluación de la citotoxicidad y genotoxicidad del
material químico en filtros PM2.5 de las estaciones de monitoreo de la red
de calidad del aire del Valle de Aburrá; Proyecto del Departamento de
Geociencias y Medio Ambiente: Colombia, Medellín, 2016.
3) Salazar Ku, Y. M.; Arias Estrella, E.; Alatriste Guarneros, M. F. Índice de
calidad del aire de la zona metropolitana de Mérida; Proyecto de Servicios
de Ingeniería y Consultoría Ambiental, S.C.P.: Hidalgo, 2015.
4) Arciniégas, C. E. Diagnóstico y control de material particulado: partículas
suspendidas totales y fracción respirable PM 10. Luna Azul 2012, 34, 195-
213.
5) Gaviria, C. F.; Benavides, P. C.; Tangarife, C. A. Contaminación por
material particulado (PM2.5 y PM10) y consultas por enfermedades
respiratorias en Medellín. Revista Facultad Nacional de Salud Pública
2011, 29, 3, 241-250.
6) Hamers, T. et. al., The application of reporter gene assays for the
determination of the toxic potency of diffuse air pollution. Science of the
total enviroment 2000, 262, 1, 159-171.
7) Rodríguez, A.; Noris, E.; Fundora, M. T.; Principios y relevancia del
ensayo cometa. Revista Cubana de Investigaciones Biomédica 2016, 35,
2, 184-194.
8) Curtis, H.; Schnek, A. Biología. 7a. ed., editorial Médica Panamericana:
Argentina, 2008, 54 – 55.
9) Targowski, S. P.; Separation of mononuclear leukocytes and
polymorphonuclear leukocytes from equine blood. Can J. comp. Med
1976, 40, 285-286.
10)Conteo celular y evaluación de viabilidad (Facultad de Medicina de la
Universidad Autónoma de San Luis Potosí).
http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Cell_counts_SPA.pdf
(consultado en mayo 2018).
11) Castro, C. Pruebas de tamizaje para determinar efectos citotóxicos en
extractos, fracciones o sustancias, utilizando la prueba del MTT.
Universidad de San Martín, [En línea] 2006
12)Arencibia, D.; Fernández, L.; Curveco, D. Principales ensayos para
determinar la citotoxicidad de una sustancia, algunas consideraciones y
su utilidad. RETEL 2009, 21, 40-52.
13)Mendoza-Zapata, L. et. al., Genotoxicidad sobre linfocitos humanos
expuestos a PM10 de tres sitios del Valle de Aburrá (Antioquía); Revista
Salud Pública 2013, 15, 2, 294-306.
14)Ruiz-Pinell, G. et. al., Actividad citotóxica in vitro en líneas celulares y
células de sangre periférica humana de los alcaloides totales de la
corteza de Galipea longiflora (Evanta); Revista Boliviana de Química
2009, 26, 2.
15)Lafón, L. Estudio de los mecanismos de muerte celular inducida por
peróxido de hidrógeno y de la protección por la quercetina en células
PC12. Tesis de maestría, Universidad de la República, Montevideo,
España, Abril 2003.
16)Miller, S.; Dykes, D.; A simple salting out procedure for extracting DNA
from human nucleated cells 1988, 16, 3, 1215.
17)Ferreiro G, et al. DNA single strand breaks in peripheral blood
lymphocytes induced by three nitroimidazole derivatives. Toxicology
Letters 2002, 132, 109-115.