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COLORANTES

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TINCIÓN
Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada
en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista
al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que
usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar
estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la
ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes
colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y
examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras
musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por
ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso
para resaltar organelas dentro de células individuales.
CLASIFICACIÓN DE COLORANTE
BÁSICOS
Básicos: son sales en las que la base, normalmente una amina,
aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora. Es decir,
con colorantes catiónicos. Tienen apetencia por sustancias
ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la
matriz extracelular como los glicosaminoglicanos. La unión es
por atracción eléctrica. Ponen de manifiesto el núcleo y el ARN,
sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy
abundante, así como ciertas matrices extracelulares ricas en
componentes ácidos. Ejemplos de colorantes básicos son la
tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la
hematoxilina.
CLASIFICACIÓN DE COLORANTE ÁCIDOS
.Ácidos: son sales con el anión coloreado y la
base incolora. Son derivados de grupos
sulfónicos, carboxilos o hidroxilos fenólicos.
Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre
todo estructuras proteicas localizadas en el
citoplasma celular y también por el colágeno de la
matriz extracelular. La unión es por atracción
eléctrica. Ejemplos de colorantes ácidos son la
fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.
COLORANTES ÁCIDOS

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COLORANTE BÁSICO

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COLORANTES NEUTROS
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COLORANTES INDIFERENTES
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FIJADORES
FIJADOES SIMPLES

Alcohol etílico. Fija por deshidratación y se usa entre el 70 y 90 %.


Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se puede usar también como
un conservante de las muestras. Tiene inconvenientes como el
endurecimiento y la retracción de los tejidos. Carece de efecto
mordiente.
Ácido acético. Su proceso de fijación consiste en cambiar el estado
coloidal de las proteínas. Se utiliza a una concentración que varía entre
el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para ácidos nucleicos y nucleoproteínas.
Como inconvenientes cabe destacar la destrucción de las mitocondrias
y mala fijación de membranas y citoplasma. Se suele usar en
combinación con otros fijadores .
FIJADORES SIMPLES

Ácido pícrico. La fijación la produce porque sales del tipo picrato


coagulan con las proteínas de los tejidos. Se suele usar el 2 % de una
solución saturada de ácido pícrico. Preserva bien la estructura celular,
no produce retracciones cuando el tiempo de fijación es óptimo,
preserva bien glucógeno y lípidos.
Formaldehído. Actúa mediante la formación de puentes entre las
moléculas tisulares. Se utiliza a concentraciones próximas al 4 %. Es un
fijador ampliamente usado por la buena preservación del tejido, actúa
como conservante, produce poca retracción tisular, es un buen fijador
para lípidos, es compatible con la mayoría de las tinciones histológicas.
FIJADORES
Glutaraldehído. Forma puentes entre las moléculas de los tejidos. Se
usa a una proporción de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad
para preservar la estructura celular, por lo que es el fijador de
referencia para observación de ultra estructuras celulares con el
microscopio electrónico.
Tetróxido de osmio. Forma puentes entre moléculas. Se emplea al 1 %
en soluciones tamponadas. Es buen fijador de la ultra estructura de la
célula por lo que se emplea habitualmente para las observaciones con
el microscopio electrónico.
Mezclas fijadoras
La mayor parte de los procesos de fijación usan distintas sustancias
fijadoras, bien mezcladas en la solución acuosa inicial o utilizada
sucesivamente en el tiempo.
Con ello se aprovechan las ventajas de cada una de ellas y se pueden
contrarrestar sus desventajas.
Líquido de BOUIN: Está formado por ácido pícrico, formaldehído y
ácido acético glacial. Es una solución muy utilizada para el
procesamiento de tejidos que se incluirán en parafina y a cuyas
secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones.
Mezclas fijadoras

Karnoy: Es un buen fijador para el glucógeno, para los hidratos de


carbono simples y para las proteínas fibrosas. Está formado por etanol
absoluto 60 %, cloroformo 30 % y ácido acético glacial 10 %.
Mezclas con formaldehído: El formaldehído es quizá el fijador más
usado hoy en día, tanto para técnicas histológicas rutinarias Lo más
frecuente es utilizarlo en solución al 4 % junto con otros fijadores. Por
ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas que
tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende fijar.
Mezclas fijadoras

Glutaraldehído - tetróxido de osmio: Los fijadores en combinación no


tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que
los tejidos destinados a microscopía electrónica sean inicialmente
fijados en glutaraldehído (1 al 3 %) y paraformaldehído (2 al 4 %), para
posteriormente ser postfijados en tetróxido de osmio al 1 % en
solución tamponada. Este último es un buen preservador de la
ultraestructura celular, sobre todo membranas, en cooperación con los
aldheídos.
TÉCNICA HISTOLÓGICA

PASOS:
• 1) Toma de material
• 2) Fijación
• 3) Deshidratación
• 4) Preparación para la inclusión
• 5) Inclusión
• 6) Modelado del bloque - catalogación
• 7) Sección con el micrótomo extendido de los cortes - pegado
• 8) Coloraciones: de rutina o especiales
TOMA DE MATERIAL
1.- Toma de material: Tratándose de un área de
Histología el material ha de ser de un animal
sano y normal. Si es posible debe extraerse de
un animal vivo y anestesiado, en caso contrario,
al menos han de extraerse él o los órganos sanos
lo más rápidamente posible después de la
muerte.
Si se trata de protozoos puede ser lo mismo in
vivo (sin colorantes) o post - mortem (con fijador
y colorantes o este último.
FIJACÓN
• 2.- Fijación: Concepto: La fijación es una operación
destinada a “matar” las células, conservándolas, cuanto sea
posible en el estado en que están durante la vida. Una buen
a fijación debe: - inmovilizar la célula - conservar
exactamente todas las partes constitutivas. - no hacer
aparecer artificialmente otros detalles en la estructura.
• Tal fijación es por ahora imposible de realizar.
Un tejido bien fijado mostrará células plenas, no
vacuolizadas, ni hinchadas, ni arrugadas, sino presentando
muchos detalles de estructura fina.
DESHIDRATACIÓN
Concepto: Los tejidos contienen grandes cantidades de agua, tanto
intracelular como extracelular, que debe ser eliminada y reemplazada
por parafina. Detención de la fijación: Una vez transcurrido el tiempo
de fijación deseado es preciso detenerlo rápidamente. El fijador que
rodea la pieza puede ser eliminado por lavado en: a.- agua b.- alcohol.
a.- Es imprescindible hacerlo después de la fijación con ácido crómico,
bicromato de potasio y ácido ósmico. Se hace en agua corriente de 2 a
24 h. La deshidratación se hace en forma progresiva con sucesivos
baños de alcohol, cada vez menos hidratados 70° – 80° – 90° – 96° –
100°.
DESHIDRATACIÓN

Tiempos de permanencia en cada líquido:


Alcohol 70 las piezas pueden permanecer
varios días.
Alcohol 96, _ 2 baños en un lapso de 24 h.
Alcohol 100, _ 3 baños de una hora c/u.
PREPARACIÓN PARA LA INCLUSIÓN
La parafina es un hidrocarburo sólido, con escasa elasticidad que ha
de penetrar a los tejidos, ocupando hasta sus últimos intersticios.
Para lo cual ha de licuarse mediante temperatura.
Solventes:
Xileno: nunca deben dejarse en este líquido más de 3 horas.
Tolueno: tiene las mismas propiedades generales que el xileno pero
resulta mejor porque endurece mucho menos los tejidos.
Cloroformo: resulta excelente para el tejido nervioso, ganglios
linfáticos y embriones pues produce poco encogimiento y no
endurece mucho los tejidos.
INCLUSIÓN
La parafina a temperatura ambiente es sólido.
Pasos de la inclusión: Se ha de preparar tantos moldes
cuantas piezas han de incluirse. Se extrae una pieza, se la
libera de la envoltura de gasa, se la ubica en el fondo del
molde, orientándola para saber luego por donde ha de ser
cortada. Sobre la pieza puesta en el molde se vierte parafina
fundida, pura. Se deja el molde sobre una superficie plana y
fría, se espera que la falta de calor solidifique toda la
parafina, formándose así un bloque.
MOLDES

Los hay de varias clases: barras de Leukart, cajas de papel,


hormas de metal.
Barras de Leukart: Consisten en un par de barras de metal,
dobladas en ángulo recto a manera de escuadras.
Las cajas de papel : Se construyen con una tira de cartulina
delgada o con papel resistente.
Hormas de metal: Se pueden hacer de dos maneras
circulares o cuadradas.
Modelado del bloque, catalogación

La forma de los bloques deben ser preferentemente de pirámide


truncada. Las caras opuestas han de resultar paralelas entre sí, lo
mismo que las aristas.
Catalogación: Cada pieza lleva un hilo con una tarjeta donde se indica
de qué órgano o porción del mismo se trata. Esta medida es la base
para catalogar los bloques. La catalogación puede hacerse de
diferentes maneras de acuerdo a las necesidades particulares.
Siempre se tendrá en cuenta que en la misma conste, animal, fijador,
fecha, código, bloques, etc.
Sección con el micrótomo – extendido de los cortes – pegado

Las secciones finas y parejas se obtienen con el micrótomo.


Una vez colocado el bloque se hace deslizar la cuchilla hasta que su
filo esté ubicado sobre el bloque.
¿Como se regula el espesor de los cortes? Se hace mediante un
tornillo micrométrico. Pegado de los cortes: El portaobjeto debe estar
limpio, se deposita en su centro una gota pequeña de albúmina de
Mayer, Ahora se lleva el porta al agua de modo que su cara untada
esté arriba. Se coloca esta cara por debajo de un corte sin defectos.
mediante calor llevando el porta a una estufa a 37 0 40 °, durante
unos 30 min como mínimo.
Coloraciones de rutina y especiales

Para que el corte pueda ser coloreado debe estar


completamente libre de parafina y suficientemente
hidratado.
Los colorantes son cuerpos químicos disueltos en agua
destilada o a veces el alcohol. La parafina no se mezcla
con ellos, como aquella ha penetrado en el interior de
las células estas no podrán ser teñidas.
Desparafinación de los cortes
Para realizar la desparafinación de los cortes los mismos son
introducidos en un frasco de boca ancha que contenga
xileno. Lo ideal es hacer dos baños de aproximadamente 10
min. c/u, de esta forma se asegura una perfecta
desparafinación de los cortes.
Teoría de la coloración: Se sabe que las imágenes producidas
por absorción, en preparaciones coloreadas, son mucho más
fáciles de interpretar que las imágenes de difracciones dada
por preparaciones no coloreadas.
COLORANTES Y MORDIENTES

Preparación para la coloración: Ciertas combinaciones formadas entre


fijadores y tejidos tienen la propiedad de combinarse con ciertas materias
colorantes, estas así pueden mordentar los tejidos y permitir coloraciones
específicas.
• Cuando una pieza es sumergida en un fijador, pueden suceder tres cosas:
• * La pieza cae al fondo, en este caso el fijador es hipotónico, y la fijación
tiene bastantes probabilidades de ser incompleta e irregular. -* La pieza
permanece flotando en la superficie, el fijador es hipertónico, muy denso
y las células se contraerán. -* La pieza se sumerge, pero queda por
encima del fondo del recipiente, hay equilibrio físico y la fijación será
buena si los ingredientes del fijador fueron bien elegidos.
TINCIÓN DE GRAM

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción


diferencial empleado en microbiología para la visualización de
bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al
bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884.
Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana
como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación
bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que
se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se
visualizan de color rosa o rojo.
Metodología
• Recoger muestras.
• Hacer el extendido en espiral.
• Dejar secar a temperatura ambiente.
• Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
• Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y
gram negativas se tiñen de color azul-purpura.
• Enjuagar con agua.
• Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
• Enjuagar con etanol.
• Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion)
• Enjuagar con agua.
• Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color
rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
• Enjuagar con agua. Observar con 100 x con aceite de inmersión.
G+, G- y contraste
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una
coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo,
como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste
las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas
permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve
para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las
bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas
se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se
hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
Técnica de la coloración gram
Fijar un frotis:
• Con la ayuda de un mechero, flamear un asa
bacteriológica y esperar que enfríe un poco.
• Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta
tomar un poco de muestra.
• Una vez obtenida una pequeña cantidad de la
muestra (con el asa), hacer que ésta tenga
contacto con una lámina portaobjetos, la cual
servirá para depositar la muestra contenida en el
asa.
Técnica de la coloración Gram
*Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos,
proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos
mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la
lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como
producto una espiral en la parte media de la lámina.
*Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un
mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no
debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor
excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a
observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea
apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la
mano.
Tinción
* Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de
metileno o en todo caso tinta china utilizando una
cantidad suficiente de dicho colorante sobre la
muestra, como para lograr cubrirla por completo.
Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta
tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una
temperatura ambiente de 25 °C.
Enjuague

Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la


muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en
cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la
muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no
contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado,
aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. También el
enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en
posición inclinada hacia abajo... La solución de cristal violeta, se
recomienda sea al 1%
Mordiente

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente


yodo o lugol durante 1 minuto más. El mordiente es cualquier
sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y
determine su fijación a las bacterias.
Decoloración: Pasado el minuto de haber actuado el
mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al
95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más
líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del
decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del
decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente
transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquido
azul.
Lavado y secado

Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y


esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la
llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.
Tinción de contraste: Una vez que la lámina ya secó,
procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar
un colorante de contraste como por ejemplo la safranina,
dejar actuar durante 1 minuto. Nuevo enjuague: Pasado el
minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con
agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma
anteriormente descrita.
CULTIVOS DE TEJIDOS VEGETALES

Cultivo de tejidos. Puede definirse como el conjunto de técnicas que


permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos,
células y protoplastos. En el contexto de la biotecnología la que más
aporte práctico ha brindado, como ser: estudios teóricos
sobre fisiología y bioquímica vegetal, obtención de plantas libres de
patógenos, conservación de germoplasma, producción de metabolitos
secundarios, propagación masiva de plantas, mejoramiento genético,
inducción de mutaciones, selección in vitro y desarrollo de protocolos
de regeneración de plantas para su utilización en ingeniería genética.
VENTAJAS
1- El cultivo de tejidos in vitro y la producción de callos ha facilitado, entre
muchos aspectos, los siguientes:
2- Desarrollo de los trabajos de organogénesis o sea la producción de brotes
y raíces.
3- Desarrollo de la embriogénesis somática.
4- Cultivo de anteras y obtención de plantas haploides.
5- Estudios de resistencia a diferentes stress.
6- Aislamiento de células y protoplastos para su uso en posteriores trabajos
de mejoramiento.
7- Introducción de nueva variabilidad genética.
8- Conservación del germoplasma.
APLICACIONES

Sus aplicaciones van desde estudios teóricos


sobre fisiología y bioquímica vegetal, hasta la
obtención de plantas libres de patógenos,
conservación de germoplasma, producción de
metabolitos secundarios, propagación masiva de
plantas, mejoramiento genético, inducción de
mutaciones, selección in vitro y desarrollo de
protocolos de regeneración de plantas para su
utilización en ingeniería genética.
ORGANOGÉNESIS

La organogénesis es un evento
morfogenético que consiste en la formación
de un primordio unipolar a partir de una
yema, con el subsecuente desarrollo de un
brote vegetativo. Existiendo siempre una
conexión entre los nuevos brotes y el tejido
paterno.
CULTIVOS DE CÉLULAS Y ÓRGANOS VEGETALES