DIVERSIDAD GENÉTICA EN GUAZUMA CRINITA DE ONCE PROCEDENCIAS EN

LA AMAZONÍA PERUANA REVELADA POR MARCADORES ISSR

RESUMEN
Guazuma crinita es una importante especie maderable de rápido crecimiento
ampliamente usada en sistemas agroforestales en la Amazonía Peruana. Los
objetivos de nuestra investigación fueron; (i) evaluar la diversidad genética de G.
crinita revelada por marcadores de intersecuencias simples repetidas (ISSR)
además de (ii) estimar la correlación entre las distancias genéticas y geográficas
entre procedencias. La muestra incluyó 44 genotipos de 11 procedencias en las
cuencas de Aguaytía y Pachitea en la Amazonía Peruana. Diez cebadores ISSR
amplificaron un total de 65 bandas de las cuales 61 fueron polimórficas (93,8 %).
El rango de amplificaciones de ADN varió desde 260 hasta 2.200 bp. Entre las
procedencias, Macuya exhibió el mayor porcentaje de bandas polimórficas (PPB)
con 67,7 %, 0,21 diversidad genética de Nei (He) y 0,33 de índice de Shannon
(I). La diferenciación genética general (Gst) fue 0,03, indicando 97 % de la
variación genética dentro de las procedencias. El flujo genético (Nm) fue 12,9
alelos por generación. El análisis de agrupamiento no estuvo relacionado con el
origen geográfico sugiriendo una fuente genética en común. Sin embargo, se
encontró una correlación positiva débil (r = 0,27, P < 0,05) entre las distancias
genéticas y geográficas. Este es el primer estudio sobre la diversidad y estructura
genética de G. crinita. Se recomiendan estrategias de conservación in situ para
las poblaciones con altos niveles de diversidad genética.
Palabras clave: marcadores Inter-simple sequence repeat, diversidad genética,
distancia genética, flujo genético, distancia geográfica.
 INTRODUCCION

Un programa de domesticación para especies de árboles tropicales comenzó a

mediados de los 90 en la Amazonía peruana, e identificó Guazuma crinita Mart.
(Familia Sterculiaceae) como una de las especies maderables prioritaria para
sistemas agroforestales (Sotelo-Montes y Weber 1997). Esta especie pionera
puede ser intercultivado con cultivos alimentarios porque tiene una pequeña
corona con ramas delgadas, y las ramas más viejas naturalmente se debe auto-
podar en la corona inferior. Proporciona productos de madera a una edad
temprana (8-10 años), se puede cosechar para sucesivas cosechas y contribuye
significativamente a los ingresos de los agricultores (Labarta y Weber 1998).
Debido a su altura inicial y rápido crecimiento (hasta 3 m por año) también se ha
promovido en programas de reforestación y sistemas agroforestales (IIAP)
2009). Naturalmente coloniza la llanura de inundación y perturba bosques
secundarios en la selva baja (debajo de 1,000 m de elevación) en la cuenca
amazónica de Perú, Ecuador y Brasil (Encarnación 1983).

El sistema de apareamiento de G. crinita no ha sido estudiado. Sin embargo,

aunque la mayoría de los árboles tropicales son predominantemente fuera de
cruce, lo mismo se supone para esta especie (Muchugi et al. 2008). Los árboles
pueden comenzar a florecer después de 2-3 años y producir millones de semillas
dispersas por tanto viento como agua al comienzo de la temporada de lluvias
(Rochon y otros, 2007). La especie puede potencialmente producir un soporte
denso de regeneración natural en parches abiertos (Rochon et al. 2007). Su
importancia ha llevado a la investigación para identificar las mejores
procedencias y mejorar la gestión de la especie.

En general, muy poca investigación sobre genética intraespecífica y variación en

especies de árboles agroforestales en los trópicos ha reportado (Weber y Sotelo-
Montes 2008). La variabilidad genética es esencial para el éxito de las
estrategias de mejora de árbol, incluida la selección, la gestión sostenible y la
conservación de los recursos genéticos (O'Neill et al., 2001).

Caracteres morfológicos y rasgos comerciales de madera se han utilizado

tradicionalmente para caracterizar niveles y patrones de diversidad; sin embargo,
estos rasgos solo representan una pequeña porción del genoma de la planta y
también están influenciados por factores ambientales (Muchugi et al., 2008). El
uso de marcadores genéticos basados en ADN supera estas desventajas y son
capaces de medir la diversidad genética en especies de plantas (White et al.,
2007). Secuencia Repetida Inter Simple (ISSR), los marcadores de repetición
combinan algunas ventajas de otros marcadores como reproducibilidad, bajos
costos y sin necesidad de desarrollar cebadores específicos de especie para el
análisis. ISSRs son una herramienta eficiente para analizar la variabilidad y la
estructura genética en rodales naturales, manejados y cultivados, y son útiles
para identificar genotipos, incluso entre los individuos altamente relacionados
(Thangjam 2014).

Los objetivos de esta investigación son (i) evaluar la diversidad genética de G.

crinita revelada por marcadores ISSR y (ii) para estimar la correlación entre
genética y distancia geográfica entre procedencias. Nuestra hipótesis es que hay
es un alto nivel de polimorfismo en procedencias, muy poca diferenciación entre
procedencias y una positiva relación entre la distancia genética y la distancia
geográfica entre procedencias.
 METODOS

Muestra de origen y material vegetal.

Analizamos 44 genotipos de G. crinita que se propagaron vegetativamente

desde la prueba de procedencia / progenie de 11 procedencias recopiladas del
Aguaytia y las cuencas vecinas del río Pachitea (tabla 1, figura 1). Fueron
identificados y seleccionados basados en mediciones fenotípicas a lo largo de
diez años de evaluación.

Estos genotipos se establecieron en un jardín multiplicación clonal en el Instituto

Peruano de Investigación del Amazonas (IIAP), ubicado a 12.4 km de Pucallpa
en el Ucayali Región. Se tomaron muestras de tejido foliar joven de cada
genotipo recolectados individualmente y almacenados en tubos micro-test con
gel de sílice para un mayor aislamiento del ADN.

Aislamiento de ADN y amplificación ISSR.

El ADN de la hoja de las muestras se extrajeron utilizando el CTAB

(cetiltrimetilamonio) bromuro) (Doyle y Doyle 1987). La calidad del ADN se
determinó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y usando un
espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific USA). La concentración final de
todas las muestras de ADN fue ajustada a 50 ng μL-1 para PCR (reacción en
cadena de la polimerasa), y almacenada a -20 ° C.

Entre los 30 universales UBC-ISSR cebadores (Universidad de Columbia

Británica, Canadá) evaluados por su capacidad de producir distintos y
reproducibles fragmentos bien resueltos en los 44 genotipos individuales, se
seleccionaron 10 cebadores para la amplificación de todas las muestras (Tabla
2). La amplificación por PCR se realizó usando Ciclador térmico T100TM (Bio-
Rad Laboratories, EE. UU.). Cada 20 μl de mezcla de reacción de PCR se
compone de 10 μL de 2x Mezcla Maestra PPP [Tris-HCl 150 mM, pH 8,8 (25 °
C), 40 mM (NH4) 2SO4, Interpolación 20 al 0,02%, MgCl2 5 mM, dATP 400 μM,
DCTP 400 μM, dGTP 400 μM, dTTP 400 μM, 100 U mL-1 Taq-Morado DNA
polimerasa, anti-anticuerpo monoclonal Taq (38 nM), estabilizadores y aditivos]
(Tob-Bio, Republica Checa), 10 μM del primer ISSR respectivo, 2 μL de DNA
elución, 0.2 μL de BSA (Termostático, Lituania) y 7,3 μl de PCR H2O (Top-Bio,
República Checa).

Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: desnaturalización inicial

durante cuatro minutos a 94 ° C, 45 ciclos de desnaturalización durante 30
segundos a 94 ° C, primer recocido a 47-52 ºC durante 45 segundos a la
temperatura de recocido específico para cada cebador, extensión durante dos
minutos a 72 ° C y una extensión final de 10 minutos a 72 ° C. Los productos
amplificados se analizaron a través de electroforesis en gel de agarosa al 2% en
1x tampón TBE, 60 voltios, 120 amperios durante 180 minutos y detectado por
ethidium tinción con bromuro (Carl Roth GmbH, Alemania). Las bandas se
observaron bajo luz UV (Cleaver Scientific, Reino Unido). Los tamaño de los
productos amplificados se estimó utilizando Thermo Scientific Gene Ruler 100
pb Plus DNA Ladder (Termocientífico, Lituania). La amplificación por PCR de las
muestras con cada cebador se llevó a cabo por duplicado para garantizar la
consistencia y reproducibilidad de los resultados.

Análisis de datos.

Los fragmentos de ISSR se puntuaron como presencia (1) o ausencia (0) de

bandas en el perfil de gel. Solo se usaron fuertes bandas para construir una
matriz binaria. Los datos se usaron para calcular el porcentaje de bandas
polimórficas, Índice de información de Shannon (I, LogBase Ľ e), genética de Nei
matriz de distancia, diversidad de genes (He), diferenciación genética (Gst) y
flujo de genes (Nm) entre procedencias utilizando POPGENE V1.32 (Yeh et al.,
1997). Un dendrograma fue construido por un vecino no ponderado, que se une
basado en Índice de disimilitud de Jaccard. Este análisis fue realizado usando el
software DARwin5 (Perrier y Jacquemoud-Collet 2006). Prueba Mantel en Gen
Al Ex V6 (Peakall y Smouse 2012) se realizó utilizando la genética imparcial de
Nei matriz de distancias y la matriz de distancias geográficas para determinar si
las distancias geográficas y genéticas entre procedencias se correlacionaron.

Table 1. Once procedencias originales de las cuencas de los rios Aguaytía (A) y
Pachitea (P) en la Amazonia Peruana.
 CUADRO 1

Figure 1. Mapa de las áreas de colección de 11 prodecencias que fueron

muestreadas en el estudio. ANR: Nueva Requena, ANS: Neshuya-stream,
ATS: Tahuayo-stream, ACR: Curimana-river, AAR: Aguaytia-river, AVH: Von
Humboldt, ASA: San Alejandro, ACU: Curimana, ATR: Tournavistaroad,
PPI: Puerto Inca and PMA: Macuya.

Table 2. Cebadores utilizados en el análisis de ISSR y resumen de

amplificaciones.

CUADRO 2
Abreviaturas de una sola letra para posiciones de base mixta: Y = (C, T), R =
(A, G).
PPB = porcentaje de bandas polimórficas.
 RESULTADOS

DIVERSIDAD GENETICA

El ADN amplificado usando marcadores ISSR generó un número total de 65

fragmentos por los diez cebadores; los fragmentos amplificados estaban dentro
de un rango de 260 a 2.200 pb. El número total de fragmentos amplificados por
cebador varió de 1 (UBC 834) a 11 (UBC 841). Un total de 61 fragmentos fueron
polimórficos (93.8%) (Tabla 2).

Los números promedio de loci y loci polimórficos generados por cebador fueron
6.5 y 6.1, respectivamente. Los análisis generales de la variación genética en la
cuenca y procedencia nivel se muestran en la tabla 3. El porcentaje de bandas
polimórficas fue mayor en la cuenca hidrográfica de Aguaytia, mientras la
diversidad genética de Nei (He) y el índice de Shannon (I) fueron más alto en la
cuenca de Pachitea. Entre las procedencias, el porcentaje de bandas
polimórficas fue el más alto en Macuya (PMA) y el más bajo en Tournavista-road
(ATR). Tournavista-road también tenía la diversidad genética más baja que Nei
(He) y el índice de Shannon (I).

ESTRUCTURA GENÉTICA DE LA POBLACIÓN

La diferenciación del Coeficiente general de genética (Gst) fue de 0.03, lo que

indica que el 3% de la variabilidad genética se distribuyó entre procedencias. El
flujo genético (Nm) se estimó en 12.9 migrantes por generación, contribuyendo
alelos entre procedencias. Un análisis de las identidades genéticas de Nei y de
la comparación por pares entre las procedencias varió de 0.84 a 0.96. Las
distancias genéticas entre las procedencias oscilaron entre 0,025 y 0.155 con
una media de 0.061 (tabla 4). La genética más baja la distancia fue entre Nueva
Requena (ANR) y Curimana procedencias de ríos (ACR) que se encuentran a lo
largo del río Curimana (figura 1), lo que sugiere que aguas abajo la dispersión
de semillas reduce la distancia genética. Puerto Inca (PPI) desde la cuenca
Pachitea y el río Aguaytia (AAR) y desde la cuenca hidrográfica de Aguaytia tenía
la más alta distancia genética (0.155), sugiriendo que la distancia genética era
mayor entre procedencias de diferentes cuencas hidrográficas. Sin embargo, la
distancia genética fue relativamente baja entre la mayoría de las procedencias
en la cuenca hidrográfica de Aguaytia y Macuya, que se encuentra en la cuenca
del río Pachitea (figura 1). Se puede reflejar el intercambio de genes por la
influencia de la actividad humana a lo largo de cuencas hidrográficas más
cercanas.

Para evaluar las relaciones entre procedencias, el análisis de clúster se utilizó

para generar un dendrograma basado en disimilitud de Jaccard entre los 44
genotipos (figura 2). El dendograma mostró que los genotipos estaban
agrupados en tres grupos distintos. El primer clúster incluido 22 genotipos [cinco
de las procedencias de PMA y ASA (PMA24, PMA23, PMA44, PMA11, PMA36,
ASA11, ASA10, ASA14, ASA01 y ASA15), dos de PPI, De procedencias ATS,
ACU y ANR (PPI01, PPI13, ATS09, ATS01, ACU07, ACU06, ANR13 y ANR07),
uno de las procedencias de ACR, AAR, ANS y AVH (ACR16, AAR01, ANS12 y
AVH01)]. El segundo grupo incluido 21 genotipos [cinco de procedencia PMA
(PMA16, PMA46, PMA42, PMA33 y PMA01), tres de ANR y procedencias ACR
(ANR08, ANR12, ANR11, ACR17, ACR20 y ACR14), dos procedencias de ANS,
ATR y ACU (ANS08, ANS10, ATR04, ATR01, ACU03 y ACU04), y uno de
procedencias PPI, AAR, AVH y ATS (PPI03, AAR13, AVH11 y ATS02)]. El
tercero cluster incluyó solo un genotipo de procedencia ANS (ANS09). La
topología del dendograma mostró que los conglomerados no estaban
relacionados con los orígenes geográficos de los genotipos.

Hubo una relación positiva débil (r = 0.27, P < 0.05) entre la distancia genética y
geográfica para las 11 procedencias basadas en la prueba de Mantel. Esto
sugiere que la distancia geográfica tuvo un pequeño efecto en la diferenciación
genética entre procedencias.

Table 3. Análisis de variación genética generado por marcadores ISSR en

procedencias/cuencas de 44 genotipos de Guazuma crinita.

CUADRO 3
Table 4. Distancias genéticas de Nei y distancias geográficas entre procedencias
de G. crinita.

CUADRO 4
Distancia geográfica en kilómetros sobre la diagonal y distancia genética de Nei
debajo de la diagonal. Ver tabla 1 para abreviaturas de procedencias

DISCUSION

La domesticación de árboles ha evolucionado en las últimas dos décadas

convirtiéndose en un importante programa global, y técnicas moleculares se han
utilizado para analizar la diversidad genética en varias especies de árboles
agroforestales (Leakey et al., 2012). Un número de autores han examinado los
dos rodales naturales de árboles tropicales y muestras cultivadas (por ejemplo,
Hollingsworth) et al. 2005, Dawson et al. 2008) para caracterizar niveles de
variabilidad genética y estructura de la población.

Una prueba de procedencia y una prueba de procedencia / progenie de G. crinita

se establecieron en la cuenca hidrográfica de Aguaytia en la cuenca peruana de
la Amazonía para investigar la variación genética en crecimiento y densidad de
madera, correlaciones entre crecimiento y densidad y diferencias ambientales
entre plantar zonas en la cuenca (Rochon et al. 2007, Weber y Sotelo-Montes
2008, Weber et al. 2011). Resultados de la prueba de procedencia indicó que la
procedencia de la cuenca local (Aguaytia) se desempeñó mejor en términos de
crecimiento que las procedencias de otras cuencas en la cuenca amazónica
peruana (Weber y Sotelo-Montes 2008).

Rochon et al. (2007) observó una variación genética significativa en el

crecimiento del árbol a los 12 meses de edad. La densidad de la madera también
variaba genéticamente entre procedencias (Weber y Sotelo-Montes 2008).

En este estudio de 44 genotipos de 11 procedencias de G. crinita en dos cuencas

hidrográficas en la Amazonía peruana, caracteriza la diversidad genética dentro
de la especie en el nivel molecular usando 10 marcadores ISSR. Aunque
estábamos consciente de que nuestro tamaño de muestra no fue extenso
(limitación causado por un pequeño número de árboles individuales en el huerto
clonal), otros investigadores han investigado la diversidad genética en especies
arbóreas que usan tamaños de muestra incluso más pequeños (p.Hernández et
al. 2006, Thangjam 2014).

Nuestro estudio reveló 93,8% de loci polimórficos. Niveles de diversidad genética

en procedencias estimadas por Nei, diversidad genética e índice de información
de Shannon (He = 0.03 a 0.24; I = 0.04 a 0.35) fueron similares a los informados
por otros investigadores para otras especies de árboles tropicales. Por ejemplo,
Russell et al. (1999) utilizaron marcadores en el Polimorfismo de longitud de
fragmentos amplificados (AFLP) para analizar la diversidad genética en
procedencias de Calycophyllum spruceanum Benth., que tiene un patrón de
distribución similar al de G. crinita en la Amazonía peruana, e informó que varió
desde 0.26 a 0.35. Gillies et al. (1997) utilizó un análisis aleatorio amplificado de
ADN polimórfico (RAPD) para estudiar poblaciones de Cedrela odorata L. en
Costa Rica, e informó que los niveles de diversidad dentro de la población (I)
variaron de 1.18 a 1.89. Hollingsworth et al. (2005) evaluaron diversidad de
natural y puestos cultivados de Inga edulis: tenía 0,59 0.70, que son más altos
que los reportados para G. crinita en este estudio. Sin embargo, He de G. crinita
es moderadamente alto para especies leñosas y perennes basadas en los
análisis de Loveless y Hamrick (1987), lo que indica la presencia de varios alelos
en algunos loci y una distribución equitativa de frecuencias alélicas en la mayoría
de los loci.

Diferenciación genética general (Gst = 0.03) y el flujo genético (Nm = 12.9) indica
que el 97% de la variabilidad genética se debió a diferencias en procedencias y
procedencias que no estaban sujetos al aislamiento genético. El valor de la altura
del flujo de genes refleja tanto la dispersión del polen como la semilla dispersión.
Las semillas pueden dispersarse largas distancias por el viento, y también aguas
abajo por el agua, por lo tanto, esperábamos poca diferenciación entre
procedencias. Esto es similar a el caso de C. spruceanum, que mostró una
variabilidad genética mucho más alta, dentro de las poblaciones en la Amazonia
peruana (Russell y otros, 1999). Estos resultados son también consistente con
los resultados de procedencia y procedencia / pruebas de progenie de G. crinita,
que mostró considerable variación en el crecimiento de los árboles y la densidad
de la madera dentro de las procedencias (Rochon y otros 2007, Weber y Sotelo-
Montes2008, Weber et al. 2011).

Hubo una relación positiva débil entre distancias geográficas y genéticas de las
procedencias. Sin embargo, el análisis de conglomerados no reveló ningún
patrón claro entre los genotipos de las diferentes procedencias geográficas.
Grupos de conglomerados, varios genotipos contenidos de diferentes
proveniencias. Estos resultados probablemente reflejan el alto flujo de genes en
la región de muestra o limitación del Marcadores ISSR para revelar la variación
existente entre procedencias.

Los resultados sugieren que las procedencias (poblaciones) de G. crinita en la

región de muestra, forma una metapoblación de subpoblaciones ligeramente
diferenciadas que no son genéticamente aislado debido al flujo de genes (Lowe
et al. 2005, White et al. 2007). La dinámica dentro del flujo de genes a través de
los ríos y entre cuencas hidrográficas en la cuenca amazónica peruana
(Janský2008) y la fragmentación del bosque debido a cambios el cultivo podría
contribuir a la formación de subpoblaciones (Dourojeanni 1987).

Un informe de diferenciación genética de Swietenia macrophylla King. Usando

los marcadores microsatélites indicaron un grado moderado, aunque significativo
de la diferenciación entre las poblaciones de la Amazonía brasileña (Fst = 0.097),
presumiblemente debido a la región de muestra más grande comparado con el
utilizado en nuestro estudio (Lemes et Alabama. 2003).

Kelly et al. (2004) estudió el tiempo y el espacio de la variación genética de

Vitellaria paradoxa Gaertn. en África donde se encontró poca variación en los
loci de microsatélites entre soportes muestreados sin evidencia genética de
cuello de botella en eventos agrobosques.
Figure 2. Dendrograma de 44 genotipos de Guazuma crinita basado en el índice
de disimiliridad de Jaccard.
 CONCLUSIONES

Los cebadores ISSR utilizados en este estudio de genotipos de G. crinita de 11

procedencias mostraron altos niveles de polimorfismo incluso en nuestro tamaño
de muestra más pequeño. La mayor diversidad ocurrió dentro del lugar de las
procedencias que entre ellas. Parece que existe un amplio flujo genético, por lo
tanto, las procedencias no fueron genéticamente aisladas. No hubo una
agrupación clara de genotipos basados en la procedencia de origen de los
genotipos o proximidad a otras procedencias. Sin embargo, había una débil
correlación positiva entre distancia genética y geográfica de las procedencias.

Nuestros resultados confirman que incluso un pequeño jardín clonal que se

utilizó en nuestra investigación, bajo las condiciones que la colección debe ser
hecha correctamente, podría poseer relativamente alta diversidad genética y por
lo tanto podría formar una buena base para una mayor domesticación de la
especie. Además de ex jardines clonales in situ, conservación in situ de
poblaciones de G. crinita con una mayor diversidad genética debe promoverse
programas para mantener una amplia base genética para la futura domesticación
de árboles. Dado que las semillas se dispersan por los ríos corriente abajo,
podríamos esperar una mayor diversidad genética por debajo de la confluencia
de los principales ríos, por lo tanto, apuntando a la conservación en estas áreas
puede ser una estrategia de conservación efectiva.

Este estudio indica que los marcadores ISSR son efectivos y una forma
relativamente fácil de detectar polimorfismo y caracterización de la variación
genética. Sin embargo, recomendamos analizar más muestras por población con
empleo de otros tipos de marcadores moleculares en futuros estudios de la
diversidad genética como base de la mejora genética a G. crinita y también para
incluir poblaciones naturales a otras cuencas hidrográficas en futuras
investigaciones