PREINFORME CULTIVOcorregido5

PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO: CULTIVO CELULAR POR LOTE DE E.A.P. ING.
AGROINDUSTRIAL
Pichia Stipitis NRRLNY-7124E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
MARACUYÁ
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
PRE-INFORME:
CULTIVO CELULAR
POR LOTE DE
PICHIA STIPITIS
NRRL Y-7124
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 0

PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO: CULTIVO CELULAR POR LOTE DE E.A.P. ING. AGROINDUSTRIAL
Pichia Stipitis NRRLNY-7124
MARACUYÁ
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERÍA
E. A. P. : INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
“PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO:

CULTIVO CELULAR POR LOTE DE Pichia
Stipitis NRRLNY-7124 ”
ASIGNATURA : Lab. De Bioprocesos
DOCENTE : M.S. Augusto Castillo Calderón
INTEGRANTES :
Alza Paredes Antonella
Aurora Vigo Yuliana
Chía Concepción Carol
Díaz Paucar Blanca
Espinoza Ramos Iris
CICLO : VII
NUEVO CHIMBOTE – 2016

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PRE-INFORME: CULTIVO CELULAR POR

LOTE DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124
I. OBJETIVOS:
GENERAL:
- Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en

matraces empleando una cepa de Pichia stipitis Y-7124,
evaluándose el efecto de la fuente de carbono y la velocidad de
agitación en la cinética de crecimiento y la producción de etanol.
ESPECIFICOS:
- Diseñar el medio de cultivo óptimo para el desarrollo de la cepa.

- Activación celular y desarrollo del inóculo.
- Determinar la cinética de crecimiento de biomasa.
- Determinar la cinética de consumo de la fuente de carbono.
- Determinar la cinética de generación de etanol.
- Determinar y evaluar µM, qS y los rendimientos del nutriente
limitante en células y en etanol, además de las respectivas
productividades en células y en etanol.
- Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cinética.
- Determinación del contenido de azúcares reductores mediante el
método del DNS.
- Determinación de la concentración celular por densidad óptica.

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II. METOLOGÍA EXPERIMENTAL
1. Preparación del medio de mantención.
Diseño de medio de mantención:

Para la formulación del diseño de medio de mantención para el cultivo
Pichia stipitis NRRL Y-7124 se tiene en cuenta los siguientes
requerimientos nutricionales.
TABLA N°01: Concentración de nutrientes para el medio de mantención (50ml)
Medio Nutriente Concentración(g/l) Pesos (gr)

Extracto de levadura 3 0.15
Sólido de Peptona 5 0.25
mantención Extracto de malta 3 0.15
Agar 20 1.00
Preparación del medio de mantención:

 Pesar las cantidades requeridas de cada compuesto.
 Colocar los nutrientes en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
 Agregar 50 ml de agua destilada, utilizando la probeta graduada.
 Llevar a calentar la mezcla de 1-2 minutos en ebullición con
agitación constante.
 Extraer en caliente, con la ayuda de una pipeta, 7 ml de solución
en 6 tubos de ensayo con tapa y cerrarlos inmediatamente.
 Colocar los tubos en un vaso de precipitado dentro de la olla a
presión, previamente aflojar las tapas para permitir el intercambio
de gases, y esterilizar hasta 121°C durante 20 minutos (controlar
los 20 min a partir de la primera burbuja en la olla a presión).
 Finalizada la esterilización, ajustar las tapas de los tubos y
retirarlos de la olla.
 Colocar los tubos en posición inclinada a temperatura ambiente
hasta el día siguiente.

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Cultivo del microorganismo:

 Esterilizar la zona de trabajo y los instrumentos.
 Extraer la cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124 con una asa
bacteriológica.
 Sembrar la cepa en forma de estrías en el medio de mantención,
siempre cerca del mechero para evitar la contaminación de los
microorganismos del ambiente.
 Dejar en la incubadora a 30°C por 48 horas
 Refrigerar para su posterior uso.
2. Preparación del medio de activación

 Tener en cuenta las siguientes consideraciones:
 El volumen del medio de activación representa el 10% del volumen del
medio de fermentación (200ml). Así tenemos:
200 𝑚𝑙 → 100%
𝑥 → 10%
𝑥 = 20 𝑚𝑙
TABLA N° 02: PARA UN MEDIO DE ACTIVACIÓN 20 ML
Medio Nutriente Concentración(g/l) Peso para 30 ml

Glucosa 5 0.1
Extracto de levadura 3 0.06
Activación Extracto de malta 5 0.1
Solución de sales 5 ml/L 0.1 ml
N: 220 rpm
Tabla N° 02: La tabla muestra el peso en gramos de los nutrientes necesarios para
la preparación de 20 ml de un medio de activación, regido en la concentración de
cada nutriente. (Ver anexo, cuadro N°01)

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PROCEDIMIENTO:
 Pesar cada compuesto manteniendo los cuidados respectivos.

 En un matraz de 125 ml adicionar la glucosa 10 ml de agua destilada.
 En un tubo de ensayo adicionar los demás nutrientes y adicionar 10 ml
de agua destilada.
 Esterilizar el medio de activación en el autoclave por un tiempo de 15
minutos.
 Dejar enfriar a temperatura ambiente.
 Preparar el microorganismo antes de sembrarlo en el medio de
activación (incubar por 1 hora a una temperatura de 30-35ºC). En
condiciones asépticas los medios líquidos y hacer el sembrado de la
levadura de medio sólido a líquido.
3. Preparación del medio de fermentación.
 Tener en cuenta las siguientes consideraciones:
 Para un volumen de medio de 30% - 40% del volumen del matraz.

 Para una concentración final de 2 g/L
 Calcular la concentración de nutrientes para el medio de

fermentación, para ello se debe tener en cuenta conocer la
composición elemental del M.O (ver tabla 01 – anexos)
TABLA N°03: COMPOSICIÓN DEL MEDIO MÍNIMO DE CULTIVO DE P.

STIPITIS NRRL Y-7124 PARA UN CRECIMIENTO EN BIOMASA DE 2G/L
% en
Nutriente Fuent
% en
compuest Y º X S  g  S º  g  Sº '
célula  g  l 
e o
C6H12O6
C 46.57 40.00 0.52 3.88 3.88
Glucosa
(NH4)SO4
Sulfato de N 9.24 21.19 1.38 1.45 2.18
amonio
(NH4)SO4
Sulfato de S 0.55 24.25 26.46 0.08 0.11
amonio
KH2PO4
Fosfato diácido P 2.5 22.76 5.46 0.37 0.55
de potasio

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KH2PO4
Fosfato diácido K 2.75 28.74 6.27 0.32 0.48
de potasio
MgSO4.7H2O
Sulfato de Mg 0.3 9.87 19.74 0.1 0.15
magnesio
MgSO4.7H2O
Sulfato de S 0.55 13.01 14.19 0.14 0.21
magnesio
Tener en cuenta que 1.45 g/L de sulfato de amonio destinado para el nitrógeno
que aporta lo requerido por el microorganismo en azufre; además satisface el
0.37 g/L del fosfato diácido de potasio destinado para el fosforo por el potasio y
el 0.14g/L del sulfato de magnesio destinado para el azufre por el magnesio.
 Determinación de los pesos necesarios de los nutrientes para 200ml

según las concentraciones.
TABLA N°04: COMPOSICIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN PARA PICHIA

STIPITIS NRRL Y-7124 DE 200ML
Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)

Glucosa 3.88 0.78
Extracto de Levadura 3 0.6
(NH4)2SO4 1.45 0.29
KH2PO4 0.37 0.074
MgSO4.7H2O 0.14 0.028
Solución de Sales 5ml/L 1ml
Composición de Solución de sales utilizadas en los medios de cultivo en g/L:

2.9 CaCl2.2H2O; 0,40 ZnO; 6.42 FeSO4.7H2O; 2.20 MgSO4; 0.25
CuSO4.5H2O; 0.24 CoCl2.6H2O; 0.06 H3BO3 y HCl conc.

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TABLA N°05: COMPOSICIÓN DE SOLUCIÓN DE SALES PARA EL MEDIO

DE FERMENTACIÓN
Elemento Fuente S0 (g/l)
Ca CaCl2. 2H2O 2.9
Zn ZnO 0.4
Fe FeSO4.7H2O 6.42
Mg MgSO4.7H2O 2.2
Cu Cu SO45H2O 0.25
Co CoCl2.6H2O 0.24
B H3BO3 0.06
Preparación del medio de fermentación:
1. Pesar los componentes para el medio de Fermentación de 200 mL según

la TABLA N°2 en la balanza analítica tomando como tara papel metálico.
2. Preparar en un matraz de 125 ml el extracto de Levadura. Añadir
0.6 gr extracto de levadura y disolver con 20 ml de Tampón citrato. Tapar
el matraz con papel metálico.
3. Preparar en un tubo de ensayo 1ml de sales conc. y mezclar con 14ml de
agua destilada. Tapar el tubo de ensayo con tampón de gaza.
4. Preparar en un matraz de 500ml: 0.932 gr glucosa y mezclar con 130 ml
de agua destilada. Tapar el matraz con papel metálico.
5. En un tubo de ensayo grande mezclar el sulfato de amonio, fosfato diácido
de potasio y el sulfato de magnesio con 15 ml de agua destilada.
6. Esterilizar las preparaciones en una autoclave por 15min, el tiempo se
contará desde que empieza la ebullición.
7. Dejar enfriar a temperatura ambiente. No mezclar las cuatro
preparaciones hasta el momento de la fermentación.
8. En el momento de la fermentación se mezclaran las preparaciones con el
caldo del inóculo (20 ml).

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4. Determinación de la cinética de crecimiento de la biomasa por

densidad óptica.
El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al

incrementarse la concentración de microorganismos, esto puede ser
detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta
determinación es necesario que previamente se elabore una curva de
calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el
medio son determinadas por peso seco.
PROCEDIMIENTO:
- Después de haber sembrado la célula en el medio de activación

y colocarlo en el Shaker:
 En condiciones asépticas mezclar los medios líquidos de

fermentación en el matraz de 1 litro.
 Adicionar al matraz de 1litro el matraz que se encuentra en el
Shaker, mezclar y tomar una muestra de 5 ml con una pipeta
esterilizada (punto 0).
 Colocar el matraz de 1 litro en el Shaker y proceder a tomar
muestras de 5 ml cada hora para determinar la curva de
crecimiento en biomasa.
 Cada muestra de 5 ml es usada para leer en el
espectrofotómetro su absorbancia a 640nm. Y luego es
centrifugado por 15 minutos en la centrifuga para guardar el
sobrenadante en viales rotulados y poder usar estas muestras
en la determinación de etanol en el cromatógrafo de gases y la
determinación de azucares reductores.
 Con la curva de calibrado de la biomasa (D.O) para la Pichia
stipitis NRRL Y-7124 se determinara la concentración final de
la célula en cada punto.
 Utilizando la ecuación ln(X/ X0) = μt, determinamos distintos
valores de μ.

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 Se halla el valor de μm.

dX / dt = μm X
μm = ln(X/ X0)/ t
 Asi mismo al cabo del termino de la fermentación se

determina la productividad, definida como :
X  X0
QX / S 
t  t0
5. Determinación de la producción de etanol por cromatografía de

gases.
 Construir una curva de calibración estándar para el etanol,

usando como estándar interno n-propanol.
 Con la ayuda de una jeringa, extraer una cierta cantidad de la
muestra a analizar, teniendo en cuenta el volumen del vial.
 Filtrar dos veces la muestra contenida en la jeringa con dos
micro filtros.
 Enumerar los viales del cromatógrafo de gases.
 Tomar 1 ml de muestra a analizar y colocarlos en los viales del
cromatógrafo de gases según numeración.
 Añadir 1 ml propanol.
 Colocar el vial con 2 ml de muestra en el puerto de inyección
del cromatógrafo de gases y proceder a la lectura de etanol en
la muestra analizada.
6. Determinación de la cinética de consumo (fuente de carbono

sacarosa) por el método de azucares reductores (DNS).
El consumo de azúcares se determinará mediante el método de

azúcares reductores del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS; Chaplin y
Kennedy, 1987)

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La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:
10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)
200 mL / L de NaOH 2N
300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en

aproximadamente 500 ó 600 mI de agua, paralelamente se disuelve el
ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1
litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes,
para posteriormente aforar hasta un litro.
PROCEDIMIENTO:
1. Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la

muestra:
2. Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra
a analizar.
3. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante
5 minutos para luego dejar enfriar.
4. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada.
5. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
6. La concentración se obtiene interceptando la medida de
absorbancia en la curva de calibrado.
La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de

concentración conocida y analizadas según este procedimiento.
III. MATERIALES, INTRUMENTOS Y REACTIVOS
 Material Biológico:
 Cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124

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 Componentes para Medios de Cultivos:
 Solución de Sales
 Extracto de Malta
 Extracto de Levadura
 Agar
Extracto de
 Solución Tampón. levadura
 Peptona
Peptona
 Sacarosa
 Agua destilada.
 Reactivos:
Extracto de Malta
 K2HPO4
 (NH4)2 SO4
 MgSO4.7H2O
 DNS (ACIDO DINITROSALICILICO)
 HCl cc. K2HPO4
 NaOH 2 N
 Tartrato de Sodio
 Potasio Tetrahidratado
 Instrumentos:
o Balanza analítica
o PHchimetro
o Autoclave
Espectrofotómetro
Balanza Analítica
o Espectrofotómetro
o Centrifuga refrigerada
o Agitador Orbital(Shaker)
o Papel metálico.
o Fiola 100ml.
o Espátula. Agitador orbital Centrifuga
(Shaker) refrigerada
o Mechero.
o Estufa Eléctrica ( Incubadora)
o Olla a presión.

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o Cromatógrafo de Gases.
o Asa bacteriológica.
o Mechero bunsen.
o Tubos de ensayo con tapa para medio de Incubadora
cultivo.
o Papel para hacer los capachos de muestra.
o Papel aluminio
o Micro pipeta.
o Matraz de 200ml.
o Vasos de precipitado.
o Piceta.
Micro Pipeta
o Tapones de algodón y gasa.
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS
FECHA
ABRIL 2016
SEMANA 1 SEMANA 2 SEMANA3
11 12 13 14 15 18 19 20 21 22 25 26 27 28 29
Recolección de
información
Presentación del
Pre informe
Acopio de
materiales
Esterilización de
materiales de
vidrio
Preparación del
medio de
mantención y
esterilización
Colocación de la
cepa 1 hora
antes en la estufa
Resembrado de
células en el
medio de
mantención

MARACUYÁ
Preparación de la
solución tampón
Preparación de
solución de sales
Preparación del
DNS
Preparación del
DNS y obtención
de la curva de
calibrado
FECHA
MAYO 2016
SEMANA4 SEMANA5 S.6
02 03 04 05 06 09 10 11 12 13 16 17
Esterilización y
acopio de
materiales
Preparación del
medio de activación
Inoculación con asa
bacteriológica a
medio rico de cultivo
Preparación de los
medios de
fermentación
Inoculación de los
medios y
seguimiento de la
cinética de
crecimiento
microbiano
Determinación de la
curva de calibración
para la
determinación de
biomasa celular
Evaluación y
supervisión del
medio
Determinación de la
producción de
etanol por
cromatografía de
gases

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Tiempo para
imprevistos
Presentación del
informe final y
sustentación
 Martes 19 de abril:
 Esterilización de materiales de vidrio: 9:00 – 9:30 a.m

 Preparación del medio de mantención y esterilización 9:40 – 10:50
a.m
 Colocación de la cepa 1 hora antes en la estufa.
 Resembrado de células en el medio de mantención 11:00 – 11:15
a.m
 Preparación de la solución tampón 11:20 – 1:00 pm.
 Miércoles 20:
 Preparación de la solución de sales.
 Jueves 21:
 Preparación de DNS.
 Martes 26 de abril:
 Preparación del DNS y obtención de la curva de calibrado: 8:00 –
10:30 a.m.
 Lunes 02 de mayo:
 Esterilización del medio líquido para la cinética de crecimiento

microbiano.
 Preparación del medio de activación e inoculación con asa
bacteriológica a medio rico de cultivo
 Martes 03 de mayo:
 Preparación de los medios de fermentación, inoculación de los

medios y seguimiento de la cinética de crecimiento microbiano.

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 Determinación de la curva de calibración para la determinación de

biomasa celular.
 Evaluación y supervisión del medio. (Constantemente).
 Determinación de la producción de etanol por cromatografía de
gases.
 Martes 17 de mayo:
 Presentación del informe final y sustentación. 8:00 – 8:30 am.
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
- M. F. Chaplin y J. F. Kennedy. (1987). Carbohydrate analysis: A

practical approach Edited by IRL Press, Oxford.

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VI. ANEXOS
CUADRO 01: Cálculo del peso en gramos de cada nutriente utilizado para la
preparación de 20 ml de un medio de activación.
 Glucosa:
5g ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.1 g
 Extracto de levadura:
3g ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.06 g
 Extracto de Malta:
5g ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.1 g
 Solución de sales:
5ml ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.1 ml
CUADRO 02: Cálculo de la composición elemental del microorganismo

PichiaStipitis NRRL Y-124.
 Fórmula del microorganismo PichiaStipitis NRRL Y-124:
CH1.79 O0.60 N0.17
 Peso molecular de los elementos y compuesto

 Carbono (C) = 12
 Hidrógeno (H) = 1
 Oxígeno (O) = 16
 Nitrógeno (N) = 14
 CH1.79O0.6N0.17 = 12(1) + 1(1.79) + 16(0.6) + 14(0.17) = 25.77
 Cálculo del % composición elemental para el m.oPichiaStipitis NRRL Y-124:

Tomando en cuenta solo los elementos según los aportes de nutrientes: Carbono,
Nitrógeno,
UNIVERSIDAD Azufre, Potasio,
NACIONAL DEL SANTAFósforo, Magnesio. Página 16
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Continúa…
Continúa de cuadro 02…
 Para el carbono:
(Peso molar de C * número de elementos / Peso molecular de la cepa)*100%
(12*1/25.77)*100% = 46.57%
 Para el Nitrógeno:
(Peso molar de N * número de elementos / Peso molecular de la cepa)*100%
(14*0.17/25.77)*100% = 9.24%
 Para el fósforo:
Se toma en cuenta el promedio de los intervalos del componente elemental
para las levaduras (0.8-2.6), según la tabla 01.
(0.8+2.6)/2 = 1.7%
 Para el Azufre:
(0.01+0.24)/2 = 0.125%
 Para el Magnesio:
(0.1-0.5)/2 = 0.3%
TABLA 06: Componentes elementales en bacterias, levaduras y hongos
ELEMENTO
 Para el Potasio: BACTERIAS LEVADURAS HONGOS
Carbono
Se 50-55
toma en cuenta el promedio 45-50
de los intervalos del 40-63
componente elemental
Hidrógeno 7 7
Nitrogeno 12-15 7.5-11 7-10
Fósforo (1.0+0.4)/2
2.0-3.0 = 2.5% 0.8-2.6 0.1-1.5
Azufre
 Para el Magnesio: 0.2-1.0 0.01-0.24 0.1-0.5
Potasio 1.0-4.5 1.0-4.0 0.2-2.5
Sodio 0.5-1.0 0.01-0.1 0.02-0.5
para las levaduras (0.1-0.5),0.01-1.1
Calcio según la tabla 01. 0.1-0.3 0.1-1.4
Magnesio 0.1-0.5
(0.1+0.5)/2 = 0.3% 0.1-0.5 0.1-0.5

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Cloruro 0.5 --- ---

Hierro 0.02-0.2 0.01-0.5 0.1-0.2
Fuente: Principles of FermentationTechnology. Stanbury and A. Whitaker. 1989.
TABLA 07: Composición elemental del microorganismo PichiaStipitis NRRL Y-
7124.
% DE COMPOSICION
ELEMENTO
ELEMENTAL
Carbono 46.57
Nitrogeno 9.24
Magnesio 0.3
Azufre 0.125
Potasio 2.5
Fósforo 1.7
CUADRO 03: Cálculos de la composición del medio mínimo de cultivo de P.

Stipitis NRRL Y-7124 para un crecimiento en biomasa de 2g/L
 Cálculo nutriente:
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 ∙ 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜

( ) 100%
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜
Ejemplo:
Compuesto: C6H12O6 PM: 180
Fuente: C PM: 12
6 ∙ 12
( ) 100% = 40%
180
El mismo procedimiento se realiza para los demás compuestos
 Cálculo del rendimiento:

%𝐶 𝑒𝑛 𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
𝑌𝑋⁄ =
𝑆 % 𝐶 𝑒𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎
Solo al compuesto limitante se le multiplicarás además por un factor. Donde f para

metabolismo aeróbico va de 0.5 – 0.6. Como el proceso se trata de condiciones
microareadas consideramos 0.5.

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Continúa…
Continúa de cuadro 03…
Ejemplo:
 Para la glucosa (fuente de carbono). Compuesto limitante.
%C en nutriente = 40%
%C en célula = 46.57%
40%
𝑌𝑋⁄ = ∙ 0.5 = 0.43𝑔/𝑔
𝑆 46.57%
 Para el sulfato de amonio (fuente de carbono).
%N en nutriente = 21.19%
%N en célula = 9.24%
21.19%
𝑌𝑋⁄ = ∙ 0.5 = 0.43𝑔/𝑔
𝑆 9.24%
 Cálculo sustrato inicial:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

𝑆0 = ( )
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
Ejemplo:
Biomasa = 2g/L (concentración final

Rendimiento = 0.43g/g
2𝑔/𝐿
𝑆0 = ( ) = 4.66 𝑔/𝐿
0.43 𝑔/𝑔
El mismo procedimiento se realiza para los demás compuestos
 Cálculo sustrato inicial corregido con el sustrato limitante:

𝑆0 ′ = 𝑆0 ∙ 𝑒𝑥𝑐𝑒𝑠𝑜
Exceso = 2
Sin embargo el exceso no lo multiplicamos al compuesto limitante (glucosa), por

su propia condición
Ejemplo:
Sustrato inicial (S0) = 0.87g/L

0.87𝑔
𝑆0 ′ = ∙ 2 = 1.74
𝐿
Realizar el mismo procedimiento para los demás compuestos excepto la

glucosa.
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CUADRO 04: Cálculo del peso en gramos de cada nutriente utilizado para la
preparación de 200 ml de un medio de fermentación.
 Glucosa:
4.66g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.931 g
 Extracto de levadura:
3g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.6 g
 (NH4)2SO4:
1.74g ------- 1000 ml

X -------- 200 ml
X = 0.349 g
 KH2PO4:
0.35g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.070 g
 MgSO4.7H2O:
0.12g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.024 g
 Solución de sales:
5ml ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 1 ml
 Tampón Citrato:
100ml ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 20 ml

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- Calculo del TFERMENTACION:
 Hallando el 𝜇𝑚𝑎𝑥 mediante el Td:
𝑙𝑛2
𝑇𝑑 =
𝜇𝑚𝑎𝑥
 Tiempo de duplicación:
(Hacemos uso de la tabla N° 8)
Tabla N° 8: Tiempos de duplicación característico dependiendo

del tipo de microorganismo:
Tipo de celula Td (h-1)

Bacterias 0.3 – 20.5
Levaduras 1.0 – 4.0
Hongos 1.5 – 7.0
Hallando 𝜇𝑚𝑎𝑥 :
𝑙𝑛2 𝑙𝑛2
𝜇𝑚𝑎𝑥 = =
𝑇𝑑 1+4
2
𝜇𝑚𝑎𝑥 = 0.277
Hallando TFERMENTACION:
𝑋
𝑙𝑛 ( ) = 𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗ 𝑇
𝑋0
2
𝑙𝑛 ( ) = 0.277 ∗ 𝑇
0.2
𝑇𝐹𝐸𝑅𝑀𝐸𝑁𝑇𝐴𝐶𝐼𝑂𝑁 = 8 ℎ 31 𝑚𝑖𝑛

MARACUYÁ
Preparación Tampón Citrato pH: 4.5 a 0.2M
 Preparar las soluciones A y B en un matraz:

Solución:
A: 4.202 g Ac. Cítrico, diluido con 100 ml de agua destilada.
B: 5.882 g Citrato de Sodio, diluido con 100 ml de agua

destilada.
 Preparación del tampón:
80.25ml (A) 80.25ml (B)
MEZCLAR
AGREGAR 150ml de H20 destilada
Si la mezcla se
encuentra por debajo de
AJUSTAR A 4.5pH 4.5 agregar NaOH y si
se encuentra por
encima agregar HCl
Cantidades calculadas para 300ml de solución tampón
NaOH al 0.1M
HCl al 0.1M

MARACUYÁ

PRE-INFORME
ESQUEMA DEL DEL EXPERIMENTO:
PROCESO CULTIVO CELULAR
DE INOCULACION POR LOTE
EN EL MEDIO DE E.A.P. ING.
DE ACTIVACION Y FERMENTACION EN EL CULTIVO POR LOTE CON LA
AGROINDUSTRIAL
Pichia Stipitis
MARACUYÁNRRLNY-7124
CEPA PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124.
Inóculo Matraz (medio Inóculo Fermentado

de activación) (medio de fermentación)
(medio de activación) (medio de activación)
Glucosa 0.1gr
Glucosa 0.93gr + 130ml
Extrac. de levadura 0.06gr Sol. de sales 0.1ml de H2O destilada
Extrac. de malta 0.1gr
Sol. de sales (NH4)2SO4
,etc. en gr + 15ml H2O Sol. de sales 1ml +14ml
destilada. de H2O destilada.
Extrac. de levadura
0.6gr+ tampón
(20ml)
20ml de medio Preparación y esterilización de
medio de fermentación para
x=2gr/L. (180ml)

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PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO: CULTIVO CELULAR POR LOTE DE E.A.P. ING.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 0

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

“PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO:

NUEVO CHIMBOTE – 2016

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 1

PRE-INFORME: CULTIVO CELULAR POR

- Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en

- Diseñar el medio de cultivo óptimo para el desarrollo de la cepa.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 2

II. METOLOGÍA EXPERIMENTAL

1. Preparación del medio de mantención.

Diseño de medio de mantención:

Medio Nutriente Concentración(g/l) Pesos (gr)

Preparación del medio de mantención:

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 3

Cultivo del microorganismo:

2. Preparación del medio de activación

TABLA N° 02: PARA UN MEDIO DE ACTIVACIÓN 20 ML

Medio Nutriente Concentración(g/l) Peso para 30 ml

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 4

 Pesar cada compuesto manteniendo los cuidados respectivos.

3. Preparación del medio de fermentación.

 Tener en cuenta las siguientes consideraciones:

 Para un volumen de medio de 30% - 40% del volumen del matraz.

 Calcular la concentración de nutrientes para el medio de

TABLA N°03: COMPOSICIÓN DEL MEDIO MÍNIMO DE CULTIVO DE P.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 5

 Determinación de los pesos necesarios de los nutrientes para 200ml

TABLA N°04: COMPOSICIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN PARA PICHIA

Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)

Composición de Solución de sales utilizadas en los medios de cultivo en g/L:

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 6

TABLA N°05: COMPOSICIÓN DE SOLUCIÓN DE SALES PARA EL MEDIO

Elemento Fuente S0 (g/l)

Ca CaCl2. 2H2O 2.9

Preparación del medio de fermentación:

1. Pesar los componentes para el medio de Fermentación de 200 mL según

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 7

4. Determinación de la cinética de crecimiento de la biomasa por

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al

- Después de haber sembrado la célula en el medio de activación

 En condiciones asépticas mezclar los medios líquidos de

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 8

 Se halla el valor de μm.

 Asi mismo al cabo del termino de la fermentación se

5. Determinación de la producción de etanol por cromatografía de

 Construir una curva de calibración estándar para el etanol,

6. Determinación de la cinética de consumo (fuente de carbono

El consumo de azúcares se determinará mediante el método de

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 9

La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:

10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)

300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en

1. Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la

La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de

III. MATERIALES, INTRUMENTOS Y REACTIVOS

 Cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 10

 Componentes para Medios de Cultivos:

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Página 11