Lección 3

EL GENOMA HUMANO
ƒ Organización del genoma humano
ƒ El genoma humano en acción
Objetivos
ƒ Repasar conceptos básicos de Biología Celular
y de Biología/Genética Molecular
ƒ Repasar conceptos algo más complejos que en
los últimos años se han revelado
fundamentales para comprender los
mecanismos de aparición de enfermedades,
fundamentalmente enfermedades comunes,
malformaciones congénitas y cáncer
ƒ Ser capaz de manejar dichos conceptos y la
terminología utilizada en este campo
 GENOMA NUCLEAR
23 cromomosomas/genoma haploide ~ 3.200.000.000 bp
ÖDNA codificante:
Hoy se sabe que un alto porcentaje de las secuencias
genómicas son codificantes, es decir, se transcriben Æ
RNA
ÖDNA intergénico
Se pensaba que: 97-98% de secuencias no se
transcribían (Æ no funcionantes, DNA “obscuro”,
“basura”…).
En realidad: el 80% del DNA no codifica proteínas,
pero si se transcribe
Datos recientes (PROGRAMA ENCODE) indican que sólo un
bajo porcentaje de secuencias genómicas no se transcriben
ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements
DNA CODIFICANTE
Un alto porcentaje de las secuencias genómicas son
codificantes, se transcriben Æ
Productos génicos
ƒ RNA que se traduce Æ Proteínas (mRNA)
ƒ RNA no codificante (ncRNA)
(En GENCODE 21, Junio 2014: Identificados 19,881 genes codificantes
de proteínas + 15,877 lncRNA + 9,534 sncRNA) ENCODE
(ENCyclopedia Of DNA Elements)
Nada es como antes!!
Varios RNAs considerados no-codificantes son codificantes y se
han identificado los polipéptidos correspondientes  RNAs
conocidos como codificantes, se ha visto que pueden actuar como
un RNA funcional. Sin embargo, aún se desconoce la funciónde la
mayor parte de los elementos identificados, si la tienen
 RNA que se traduce Æ Proteínas (mRNA)
(2-3% del DNA,~20.000 genes, ~20% de los
transcritos) Gen codificante de proteínas
– Estructurales
– Enzimáticas
– Receptores mRNA
– Señales
Splicing y poliadenilación alternativos Æ múltiples
isoformas de mRNA Æ
(Gencode21: 79,377 transcritos) Æ
proteínas con diferentes funciones o diferencialmente
reguladas
Mas del 95% de los genes multi-exónicos humanos sufren
splicing alternativo
RNA NO CODIFICANTE (ncRNA)
1. Que actúan en procesamiento de RNA y
síntesis de proteínas (“housekeeping”, bien
conocidos)
 snRNA (small nuclear RNA)Æ
Æ splicing
 rRNA: ribosómico Æ ribosoma
 snoRNA: RNAs pequeños nucleololaresÆ
ribosomas
 tRNA: de transferencia
2. RNAs no codificantes reguladores
 ncRNA
1) RNAs cortos o pequeños
2) RNAs largos no codificantes (lncRNA)
Implicados en: remodelado de la cromatina,
transcripción, traducción…
Æ Actúan como nodos de redes de señales regulando
una amplia gama de procesos biológicos
Æ apoptosis
Æ proliferación
Æ diferenciación celular
Æ biología de células madre
Su alteración Æ Distintos tipos de cáncer y otras
enfermedades, como p.e. Alzheimer
RNAs no codificiantes (ncRNAs) cortos o pequeños
 miRNA (microRNA) - 21-24 nt
Altamente conservados
Identificados más de 2500. Regulan 30% de genes
Reprimen:
ƒ mRNA - se unen a secuencias complementarias en
3‛UTR del mRNA (miRNA response elements, MREs) Æ
Degradación del mRNA y/o Inihibición de la
traducción (Un único mRNA puede ser regulado por varios
miRNAs y un sólo miRNA puede regular múltiples mRNAs)
ƒ Otros RNAs
 siRNA (small interfering) - dsRNA 21 bp Æ vías RNAi
 piRNA (piwi interacting)- ssRNA 26-32 nt ¿sólo en
céls.germinales? INHIBICIÓN DE
TRANSPOSONES
 Figure 1 Schematic diagram shows miRNA biogenesis.
MiRNA genes are
transcribed as the primary
capped and
polyadenylated precursors
of miRNA (pri-miRNAs) by
RNA polymerase II in the
nucleus, and the pri-
miRNAs are further
cleaved by Drosha and
DGCR8. The processing of
the pri-miRNAs by RNase
III enzyme Drosha along
with cofactor DGCR8 gives
rise to the stem-loop pre-
miRNA that is exported by
Exportin 5 from the
nucleus to the cytoplasm.
In the cytoplasm, the
RNase III enzyme Dicer
catalyzes the pre-miRNA
to form mature miRNAs.
The mature miRNAs are
incorporated into the
RNA-induced silencing
complex (RISC) that guides
the 3ʹ-UTR of the target
gene. The association of
the miRNA-RISC results in
the silencing of the target
gene by mRNA
degradation or
translational repression.
Chencheng Yao et al. Reproduction 2015;150:R25-R34
© 2015 Society for Reproduction and Fertility
Ejemplos de aplicaciones
(Enfermedades neurodegenerativas)
(Enfermedades autoinmunes)
(Enfermedades cardiovasculares)
miRNAs circulantes como biomarcadores de grado de malignidad y de determinados
tipos de cáncer
 RNAs largos no codificantes (lncRNA)
Longitud: más de 200 nucleótidos
Falta de homología con genes que codifican proteínas
Con frecuencia situados en cadena antisentido
Falta de ORF
Alta conservación de la mayor parte de los exones
El 16.8% están poliadenilados
Generalmente expresión más baja que genes
codificantes de proteínas y patrones de expresión más
tejido-específicos
Algunos se procesan a RNAs pequeños
Existen varios tipos
 lincRNA
Descritos más de 8000
Estructura: exón-intrón-exón con señales de 5‛ cap,
poli-A, splicing… pero no ORF. Incluyen seudogenes que se
transcriben y transcritos antisentido, formando redes de
transcritos sentido y antisentido
Actúan en:
 Regulación de modificaciones epigenéticas: se asocian a
grupos de genes imprintados
 Control del procesamiento post-transcripcional del
mRNA
 Regulación de transcripción actuando como co-
reguladores de factores de transcripción o como
modificadores de la actividad de co-reguladores
 Diferenciación celular y mantenimiento de la
pluripotencialidad
Ejemplos de aplicaciones
1- LncRNAs como: Braveheart
Fendrr
ANRIL
MIAT
Myheart
•Fundamentales en desarrollo embriológico del corazón
•Implicados en: infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca,
aterosclerosis y otras cardiomiopatías [actuando directemente ó como
RNAs competidores endógenos (ceRNA) de miRNAs que regulan otros
genes].
Æ LncRNAs como biomarcadores de enf. cardiovasculares
ÆDesarrollo de líneas celulares Æ regeneración cardiac
2- Otros LncRNAs importantes en transición epitelio-mesenquimal
/apoptosis/angiogénesis
Æ Aparición de células cancerosas
 RNA Circular (circRNA
(circRNA))
• Identificados miles de ellos
• Altamente conservados entre especies
• Altamente representados en la célula
• La mayoría originados a partir de secuencias exónicas
(solapados con genes codificantes de proteínas)
• Con frecuencia son tejido-específicos y etapa de
desarrollo específicos
• Mas estables que RNA lineal (Æ ventaja como biomarcadores)
• Contienen múltiples MREs (Elementos de Respuesta a
miRNA) Æ redes de regulación
Ej.: Sry
circRNA
DNA REPETIVIVO DEL GENOMA HUMANO
ƒ DNA altamente repetitivo (DNA satélite) ≅ 5%
- Centrómero - DNA alfoide: secuencias de 170 bp, repetidas en
tándem Ö trechos de hasta 1 Mb
ƒ DNA moderadamente repetitivo
- Telómero: 250-1500 copias, según tipo celular
ƒ En tándem - rDNA: cientos de copias (cr. 13, 14, 15, 21 y 22)
- Minisatélites (VNTRs): 9-70 bp, pueden ocupar 20kb
≅3% - Microsatélites (STRPs):1-4 bp, ocupan cientos bp
Ej.: CAG intragénicos Ö expansión de tripletes
-SINE: 90-500 bp. Ej.: Secuencias Alu: 250-280 bp,
1.500.000 copias. 13% del genoma
ÖSobrecruzamiento desigual: duplicaciones y delec.
ƒ Dispersas Ö Retrotransposones: inserciones intragénicas
≅45% (NF1,gen de la neurofibromatosis 1)
-LINE: hasta 7.000 bp.Ej.: L1:~ 800.000 copias.
~15% del genoma. El 80% de genes tienen un L1
Ö Retrotransposón (hemofilia A)
TRANSPOSONES
Por su mecanismo de transposición se clasifican en:
–DNA transposones, representan ~3% del genoma.
Ya no se transponen
–Retrotransposones, ~ 42% del genoma
Algunos aún activos
Por su estructura se clasifican en:
– LTRs (Long Terminal Repeats), caracterizados por
repeticiones largas terminales. Tamaño: ~100 bp a más
de 5 kb. Incluyen:
• ERVs (Endogenous Retroviruses) originados por
infección de retrovirus en células germinales. 8% del
genoma. La mayoría inactivos
• ‘‘solo‛‛ LTRs. Resultan de una recombinación que
elimina los genes retrovirales (¿existen en el
hombre?)
–Non-LTR
 TRANSPOSONES: Non-LTR
Incluyen:
– SINEs (Short Interspersed Repeat Elements): Ej.:
Æ ~1 inserción de novo/20 nacimientos
Secuencias AluÆ
– LINEs (Long Interspersed Repeat Elements) 17% del
genoma -~500.000 copias, solo 80-100 capaces de
transponerse- Ej.: L1Æ ~ 1 inserción de novo/108
nacimientos
– Elementos SVA, formados por secuencias derivadas de
SINE, VNTR [variable number tandem repeat], y Alu),
~3000 copias Æ ~ 1 inserción de novo/916 nacimientos
Ö Variación genética Æ nuevos promotores, sitios de
splicing y poliadenilación…
Ö Enfermedad. Ej.: Haemophilia A, resultante de la
inserción de L1
PSEUDOGENES (ψ
(ψ)
Concepto clásico
Secuencias génicas que han perdido
su capacidad de expresarse
Por su origen, pueden ser:
ser
1. Procesados (10,753), originados por retrotrans-
posición del mRNA del gen de procedencia. Han
perdido intrones y regiones reguladoras
2. Duplicados, proceden del gen duplicado. Estructura
similar intron-exón y pueden mantener secuencias
reguladoras corriente arriba
3. Unitarios (170), originados por mutaciones en genes
funcionales Æ Aunque comparten estructura con los
genes de los que derivan, se han diferenciado de
ellos a lo largo de millones de años
 PSEUDOGENES (ψ
(ψ)
En la actualidad se sabe que:
ƒ Gencode 21: identificados 14,467
ƒ El 5-20% mantienen capacidad de transcribirse e
incluso de traducirse, con regulación tejido-específica
ƒ Algunos de sus RNA tienen funciones reguladoras
importantes:
1) Su procesamiento Æ siRNAs
2) Las regiones reguladoras de su transcrito pueden
competir con el gen del que derivan
(Ej.: el pseudogen de PTEN, PTENP1, modula la
expresión de PTEN. En los transcritos de los dos hay
MREs que son iguales Æ compiten por miRNAs
reguladores Æ la presencia de transcritos de PTENP1
Æ desrepresión de PTEN. Una regulación similar
ocurren en el oncogen KRAS y su seudogen KRAS1P)
RNAs competidores endógenos (ceRNAs)
La actividad de los miRNAs puede ser regulada por la
presencia de RNAs competidores endógenos (ceRNAs):
ncRNAs pequeños, lncRNAs, circRNAs y pseudogenes
Estos ceRNAs comparten MREs con uno o múltiples
miRNAs Æ actúan como “esponjas”, atrapando miRNAs y
bajando los niveles de miRNAs disponibles para su unión al
mRNA diana, lo que resulta en un aumento de su
traducción
MRE
MRE MRE
MRE
MRE MRE MRE
MRE
MRE
MRE
MRE
α-MRE MRE
α-MRE
 Regulación de miR-7 mediada por ciRS-7
,
miR-7 regula expresión de varios
oncogenes. Un circRNA (ciRS-7) contiene
más de 60 sitios de unión (MRE)a miR-7
Æ actúa como una “esponja” regulando la
actividad de miR-7 (importante en varios
tipos de cancer y en enf.de Parkinson)
ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO
• Genoma mitocondrial (mtDNA)
Molécula circular de 16.569 pares de bases
El número de moléculas/célula varía:
De unos pocos cientos (espermatozoides) a unas
200.000 (ovocito).
Normalmente 1.000-10.000 copias/célula, con 2
- 10 moléculas/mitocondria.
Contiene 37 genes que codifican :
– Las 2 subunidades 12S y 16S del rRNA
– Los 22 tRNA.
– 13 polipéptidos que forman parte de complejos multienzimáticos
junto con polipéptidos codificados en el genoma nuclear
Sólo un 3% de secuencias no son codificantes
 AUTOPERPETUACIÓN DE LA INFORMACIÓN
GENÉTICA: LA REPLICACIÓN
Topoisomerasa
Se produce por complementariedad de bases Ö
- Es semiconservativa
- Se originan dos moléculas iguales
- Fuente de roturas
La integridad del DNA en el ciclo mitótico y meiótico
se monitoriza en “puntos de chequeo”
G2/M Salida de M
M
G2
+
Intra-S s
G1
S
-
Nobel 2001:
Lee Hartwell G1/S
Tim Hunt
Paul Nurse
 PUNTOS DE CHEQUEO
Son redes de vías de señales que monitorizan la
integridad del DNA. Estas vías de señales
están compuestas por proteínas:
 Sensoras (Ejs.: ATM, ATR)
 Transductoras de señales
 Efectoras (Ej.: p53)
ÆParada del ciclo celular
ÆEstimulación de sistemas de reparación
Ö REPARACIÓN
Ö APOPTOSIS
 SISTEMAS DE REPARACIÓN DEL DNA
Roturas bicatenarias (DSBs, “Double Strand Breaks”)
• NHEJ (Unión de extremos no homólogos, “Non Homologous End
Joining”): DNA-PKcs, Mre11-Rad50-Nbs1, Ku70, Ku86
• HR (Recombinación homóloga): ATM, Mre11-Rad50-Nbs1
PAR, Rad51/Dmc1, BRCA1, BRCA2…
Roturas de cadena única (SSB, “Single Strand Breaks”)
• MMR (Reparación de apareamientos anómalos, “Mistmach Repair”)
MLH1, MLH3, PMS1, PMS2, Msh2, Msh3 y Msh6
• NER (Reparación por Excisión de Nucleótidos): XPA…XPG
(Xeroderma pigmentosum), CSA y CSB (síndrome de Cockayne), ERCC1,
RPA, RAD23A, RAD23B…
• BER (Reparación por Excisión de Bases): Glicosilasas, AP
endonucleasas, Flap endonucleasa…
Procesos de replicación asociados: Helicasas, DNA
polimerasas, DNA ligasas…
REPARACIÓN DE ROTURAS
BICATENARIAS (DSBs)
(Rotura bicatenaria, “Double Strand Break”)
(Mre11-Rad50-Nbs1)
REGULACION DE LA EXPRESION GÉNICA
• Modificaciones epigenéticas (las que se heredan)
• Fosforilación, acetilación/desacetilación dehistonas
• Metilación CpG
• Remodelación cromatina (posición nucleosomas)
 REGULACION DE LA EXPRESION GÉNICA
La expresión de los genes puede regularse a todos los niveles
ƒ Estructura de la cromatina (heterocromatinización y
silenciación) Æ Metiloma
ƒ La transcripción
ƒ Procesamiento del transcrito primario (adición de colas
de poliadenina, “splicing”, “editing”)
ƒ Transporte del RNA al citoplasma
ƒ Traducción del mRNA:
– miRNA intervienen en control de expresión por represión de
mRNA. Importantes en transición cél.epitelialÆ
cél.mesenquimal (crítica en malignización y metástasis)
ƒ Degradación del RNA
ƒ Actividad de la proteína (modificaciones postraducción,
compartimentalización, degradación)
Ö PRODUCTO GÉNICO FUNCIONANTE
EPIGENÉTICA
Mecanismos que inician y mantienen
patrones heredables de regulación de la expresión génica
sin afectar a la secuencia nucleotídica
MODIFICACIONES EPIGENÉTICAS:
Metilación del DNA
ncRNAs CÓDIGO
Modificaciones post-traducción de histonas
Remodelado de la cromatina EPIGENÉTICO
Imprinting
Silenciación de genes
Ö Inactivación del cromosoma X
Carcinogenesis, …
Su alteración Ö enfermedades. Ejs.: La metilación
diferencial en la región del complejo de histocompatibilidad
principal (MHC) Æ artritis. La metilación de otros genes Æ
susceptibilidad a enfermedades como obesidad y diabetes)
 MODIFICACIONES EPIGENÉTICAS
ƒ Metilación de citosinas frecuente en promotores,
secuencias repetidas y transposones Æ silenciación y
disminución de movilidad de transposones
ƒ La mayoría de las modificaciones se eliminan durante la
gametogénesis (las que no se eliminan se heredan)
ƒ Algunas modificaciones del DNA se adquieren durante el
desarrollo y pueden responder a cambios ambientales
ƒ Se han observado modificaciones en RNA (5-hidroximetil-
citosina, 5-formilcitosina 5-carboxilcitosina y N6-metil-
adenosina)
TRANSCRIPCIÓN
ƒ Los factores de transcripción (Generales
y específicos de tejido -regulación
TRANS-) tienen motivos de unión al
DNA del promotor (regulación CIS) y
determinan qué cadena se lee
ƒ Procesamiento del transcrito primario
(cap, adición de colas de poliadenina,
“splicing”, “editing”)
ƒ Los RNAs han de ser transportados al
citoplasma para realizar su función
 REGULACIÓN CIS
(Promotores proximales y distales)
Promotores basales: Reconocidos por los Factores de transcripción
generales. Son imprescindibles para que las correspondientes RNA
polimerasas I, II y III inicien la transcripción. Situados cerca y
a distancia fija del sitio de inicio (“upstream”). Generalmente
longitud de varios cientos de bp. Estructura modular (secuencias
consenso: TATA, CAAT, GC,…)
Promotores accesorios o específicos: Ausentes en genes constitutivos
(Ej.: HRE)
Intensificadores o potenciadores (enhancers): También estructura
modular. No imprescindibles. Pueden activar al promotor o
aumentar eficacia de tr. Ni cerca, ni a distancia fija. Pueden
estar“upstream” “downstream” o ser intragénicos
Silenciadores
LCRs
Aisladores: bloquean la acción de enhancers
 REGULACIÓN POR RNAs
Además de los factores de transcripción:
• miRNAs
Un miRNA puede reducir la expresión de
cientos de genes. Los miRNA maduros actúan
generalmente por complementariedad de
bases con MREs en uno o más mRNAs.
A su vez, los miRNAS están regulados por
competidores endógenos (ceRNAs)
• siRNAs
Por complementariedad de bases puede unirse
a distintas regiones de los mRNAs impidiendo
su traducción
TRADUCCIÓN
Código Genético: de mRNA Ö proteínas. Niremberg, Ochoa, Khorana
Combinaciones de tripletes: 43 = 64 20 aas Ö Código DEGENERADO
Modificaciones postraducción: fosforilaciones, glicosilaciones,
formación de puentes disulfuro, hidrólisis Ö proteína activa
 LECTURAS RECOMENDADAS
ƒ Repasar bibliografía recomendada en
Biología Celular y en Bioquímica
ƒ Wikipedia, the free encyclopedia