PRACTICAS Curso 2002/2003

RECURSOS VIVOS EXPLOTABLES

MARICULTURA VEGETAL

Lunes y viernes de 15,00 a 19,00

Lugar: Centro de Algología Aplicada
Muelle de Taliarte s/n, Telde
Tlfno.: 928 133290

Martes, miércoles y jueves de 13,00 a 17,00

Lugar: Laboratorio B-1
Edif. Ciencias Básicas / FCM

Relación de grupos y fechas

Grupo 1.- Lunes 31/3 – Viernes 4/4

Grupo 3.- Lunes 7/4 – Viernes 11/4
Grupo 2.- Lunes 21/4 – Viernes 25/4
Grupo 5.- Lunes 5/5 - Viernes 9/5
Grupo 4.- Lunes 12/5 – Viernes 16/5
Grupo 6.- Lunes 19/5 – Viernes 23/5

Relación de prácticas:

Nº1.- Cultivo, cosechado y procesado de microalgas y cianobacterias de interes

industrial
Nº2.- Cultivo intensivo de macroalgas de interés industrial / Policultivo
Nº3.- Ficocoloides
Nº4.- Aplicación de algas en cosmética
Nº5.- Aplicación de algas en alimentación humana

Nombre del alumno:

Grupo:
PRACTICA Nº 1.- CULTIVO, COSECHADO Y PROCESADO DE MICROALGAS Y
CIANOBACTERIAS DE INTERÉS INDUSTRIAL

Objetivos

Demostrar y enseñar como se realiza:

1. Preparación de medios de cultivo

2. Mantenimiento de cepas en las Colecciones de Cultivo
3. Escalado de cultivos desde la cepa en placas al sistema de cultivo intensivo
4. Cálculo de la tasa de crecimiento y del tiempo de duplicación de la biomasa
5. Control las variables que afectan al cultivo
6. Reconocer diferentes sistemas de cultivo intensivo de microalgas
7. Reconocer los diferentes procedimientos para el cosechado y secado de la
biomasa
8. Identificar las microalgas de interés industrial

Material y Metodología

Material biológico
Las algas utilizadas para la realización de los ensayos serán cedidas por el Banco Nacional
de Germoplasma de Algas (BANGAL):

Chlorella sp. Microalga verde aislada (BANGAL 001, 1995) del agua de tratamiento secundario de
la Estación Depuradora de Aguas Residuales Urbanas (EDAR) del Sudeste (Arinaga, Gran
Canaria)

Spirulina platensis (Geitler) variedad Lonar (BANGAL 17), aislada del lago Lonar (Pargaonkar) en
la India (el lago Lonar puede alcanzar 40g L-1 de sales en época de sequía). Spirulina es una
cianobacteria (microalga verde-azul) filamentosa característica de aguas salobres y fuertemente
alcalina. La gran demanda de Spirulina se debe fundamentalmente a: su alto contenido en
proteínas (60-70% peso seco), ácido gamma-linolénico y ficocianinas (ambas con propiedades
terapéuticas), y su capacidad de absorber minerales esenciales del medio.

Dunaliella salina (Teodoresco) BANGAL 421 asilada en 1992 de pozas de cristalización de las
salinas de Pozo Izquierdo, en el sur de Gran Canaria. Es uno de los microorganismos más
halotolerante conocidos, cuyo rasgo más característico en el de acumular grandes cantidades de -
caroteno en condiciones de cultivo causantes de estrés: Escasa disponibilidad de nutrientes, baja
temperatura, alta salinidad y elevada irradiación.
Etapas de trabajo (esquema I)

Preparación de medios de cultivo (Anexo I)

El procedimiento para la preparación de los medios de cultivo en laboratorio y en sistema
intensivo, específicos para cada cepa, se detallan en el anexo 1 y son los siguientes:

Chlorella
 Medio Mínimo (Sueoka, 1960) para cultivo en laboratorio de Chlorella (Tabla1)
 Medio Tamiya (Tamiya, 1968) modificado para cultivo intensivo de Chlorella (Tabla 2)
Spirulina
 Medio Zarrouk (Zarrouk, 1966) para cultivo en cámara de Spirulina (Tabla 3)
 Medio Zarrouk-modificado para cultivo intensivo de Spirulina (Tabla 4)
Dunaliella
 Medio de cultivo Semenenko & Adullaev (Semenenko & Adullaev, 1980) para Dunaliella en
cámara de cultivo (Tabla 5)
 Medio Semenenko & Adullaev (Semenenko & Adullaev, 1980) modificado para cultivo
intensivo de Dunaliella en una sola fase (Tabla 6)

1. Escalado del cultivo (ver esquema I)

1.1. Cultivo en laboratorio
La activación de cultivos se realiza mediante la transferencia de las cepas desde medios sólidos
a matraces de 50 ml, 1L y 2L que contiene medio líquido.
Esta fase del escalado transcurre en el laboratorio en cámaras de cultivo termostatizadas, con
control automático de irradiación, fotoperiodo e inyección de la mezcla de gases.
Condiciones establecidas en la cámara de cultivo:
Temperatura: Fotoperiodo:
Irradiación: Gases:

Cultivo en fotobioreactores
Los cultivos se transfieren desde los matraces a los fotobioreactores cilíndricos de 60 litros donde
finalmente alcanzan la densidad de cultivo necesaria para inocular los sistemas intensivos. Esta
fase del escalado se lleva a cabo en el exterior.

2. Sistema de cultivo intensivo

El sistema que emplearemos son tanques tipo raceway (sistema de cultivo más utilizado por su
bajo coste de operación y alta eficacia de producción) de 8 m2 de superficie de cultivo útil,
agitación por paletas (30 cm/s) e incorporación de CO 2: aire por difusión. Los raceways se llenan
con agua (10cm de profundidad) en la que diluyen los nutrientes, seguidamente se conecta el
sistema de difusión de aire y se inoculan las algas procedentes de los fotobioreactores.

3. Control de los parámetros de cultivo

4.1. Parámetros abióticos (Anexo II)
Diariamente se tomaran datos de:
- pH y temperatura (°C) empleando un pH-metro portátil equipado con una sonda de
temperatura CRISON 507.
- Irradiación tomada en continuo por un sensor de irradiación PAR y UV. Programa ELDONET

Parámetros bióticos: Medidas de crecimiento (Anexo I; Anexo II)

 Densidad óptica. Medida al espectrofotómetro de la absorbancia del cultivo a 750nm
 Clorofila. Método colorimétrico de extracción de las clorofilas empleando como solvente
metanol 100% según Wellburn (1989) para microalgas verde y según Mckinney (1941) para
cianobaterias. El contenido en clorofilas totales se expresa en µg clorofila ml–1 de cultivo.
 Tasa de crecimiento y tiempo de duplicación de la biomasa, a partir de los datos de densidad
óptica.
Cosechado de la biomasa
El cosechado consiste en la separación de las algas del medio de cultivo. Se realizará mediante
bombeo desde los sistemas de cultivo
 A la separadora Westfalia 1000L en el caso de los cultivos de Chlorella y Dunaliella
 Y al sistema de filtración con mallas para el cultivo de Spirulina.

Procesado de la biomasa
El procesado consiste en la deshidratación de la biomasa: Para ello emplearemos un atomizador
Mobile Minor de la casa NIRO cuya capacidad de trabajo de 6 litros a la hora. Pesar la biomasa
obtenida y determinar la producción del cultivo (Anexo I).

6. Aplicaciones de la biomasa
Muestra de las diferentes estrategias de presentación del producto para consumo humano.

Bibliografía citada

Mckinney G (1941) Absorption of light by chlorophyll solutions. J. Biol. Chem. 150:315-322

Semenenko VE & Abdullaev AA (1980) Parametric control of -carotene biosynthesis in
Dunaliella salina cells under conditions of intensive cultivation, Sov. Plant. Physiol. 27:
22-30.
Sueoka N (1960) Mitotic replication of deoxyribonucleic acids in Chlamydomonas reinhardtii.
Proc. Ntla. Acad. Sci. USA 46:83-91.
Zarrouk C (1966) Contribution a l’estude d’una cyanophyceé. Influence de divers facteurs
physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthèse de Spirulina maxima. Ph D
Thesis, Paris.
Wellburn AR (1994) The spectral determination of chlorophylls a and b, as well as total
carotenoids, using various solvents with spectrophotometers of different resolution. J. Plant
Physiol. 144: 307-313.

Bibliografía recomendada

Becker, EW (1994). Microalgae biotechnology and microbiology. Cambridge University Press,

Cambridge. 293pp.
Borowitzka, M A & Borowitzka, L J (Eds) (1988). Micro-algal biotechnology. I ed. Cambridge University
Press, Perth, Australia. 477 pp.
Isaac S & Jennings D (1995) Microbial culture. Bios Scientific Publishers. Liverpool. 133 pp
Richmond, A (Ed) (1986). Handbook of Microalgal Mass Culture. I ed. CRC Press, Boca
Raton, Florida, USA. 528 pp.
Canter-Lund H, Lund JWG (1995) Freshwater algae. Their microscopic world explored
Microalgae. Bipress Ltd. I ed. Bristol 360 pp.
Vonshak A (1997) Spirulina platensis (Arthorspira): Physiology, cell-biology and
biotechnology. Tylor & Francis. London. 233 pp.
ANEXO I

PROCEDIMIENTOS DE TRABAJO

1. Preparación de medios de cultivo

Tabla 3. Medio de cultivo Zarrouk (1966) para el
Tabla 1. Medio Mínimo (Sueoka, 1960) para el cultivo
cultivo en cámara de Spirulina
en cámara de Chlorella.
Concentración
Sal Sol. Madre Dilución Sal
g/L
(g/L) ml/L
Solución 1 NaHCO3 13.61
NH4Cl 16.00 25
CaCl2 2H2O 2.04 Na2CO3 1.03
MgSO4 4.00 K2HPO4 0.50
Solución 2
K2HPO4 37.42 25 NaNO3 2.50
KH2PO4 14.52
Solución KSO4 1.00
Trazas 1
NaCl 0.20
EDTA 50.00
ZnSO4 7H2O 22.00 MgSO4 7H2O 0.04
H3BO3 11.40
MnCl2 4H2O 5.06 CaCl2 2H2O 0.01
FeSO4 7H2O 4.99
CoCl2 6H2O 1.61 FeSO4 7H2O 0.05
CuSO4 5H2O 1.57 Sol A5 +CO * 1.00 ml
(NH4)6Mo7O24 1.10 Sol B6 * 1.00 ml

Tabla 2. Medio Tamiya (Tamiya, 1968) modificado Solución A5 + Co * (g/ L agua destilada)
para el cultivo intensivo de Chlorella. H3BO3 2.86
MnCl2 4H2O 1.81
Concentración ZnSO4 7H2O 0.22
Sal
(g/L medio) NaMoO4 2H2O 0.39
KNO3 2.50 CuSO4 5H2O 0.079
Co(NO3) 2 6H2O 0.049
MgSO4 1.25 Solution B6 * (mg/ L agua destilada)
VOSO4 5H2O 49.6
KH2PO4 0.63 K2Cr2(SO4)4 2H2O 96.0
g/L sol ml sol. Madre/L medio NiSO4 7H2O 47.8
Solución A madre 0.1 Na2WO4 2H2O 17.9
FeSO4 273 TiOSO4 33.3
EDTA 10 Co(NO3)2 6H2O 44.0
Solución B 0.1
H3BO3 154
EDTA 6
Solución C 0.5
MnSO4 111.5
CuSO4 124.5
ZnSO4 143.5
CoSO4 140.5
(NH4)6Mo7O24 85.0
EDTA 25.0

Tabla 4. Medio de cultivo Zarrouk para cultivo

intensivo de Spirulina
 Concentración
Concentración Sal g/L**
Sal
g/L
KNO3 5.00
NaHCO3 1600
KH2PO4 1.25
KNO3 2380
MgSO4 7H2O 50.00
NaCl 1000
FeSO4 7H2O 0.009
K2SO4 1000
NaCl 116.0
K2HPO4 1000

KH2PO4 390 EDTA 0.037

K(OH) 160 Solución Fe-EDTA 2.00 ml

MgSO4 200 ** Diluir 100 veces para cultivos en una sola fase

EDTA 60

FeSO4 8

Tabla 5. Medio para cultivo de Dunaliella en cámara

de cultivo (Semeneko & Adullaev 1980)

Concentración
Sal g/L
MgCl 0.376

MgSO4 7H2O 0.492

NaNO3 0.850

Ca(NO3)2 4H2O 0.365

KH2PO4 0.68

Tris 6.5
116
NaCl
Solución Fe-EDTA 1 ml
EDTA 37.0
FeSO4 3.0

Tabla 6. Medio para cultivo intensivo de Dunaliella

(Semeneko & Adullaev 1980)
2. Determinación de la densidad óptica
Tomar una muestra del cultivo y medir directamente al espectrofotómetro la densidad óptica a 750
nm. Hacer el blanco en el espectrofotómetro con agua destilada.

3. Determinación de la concentración de clorofila

1. Tomar 1ml cultivo y ponerlo en un tubo eppendorf (triplicado)
2. Centrifugar 14000 r.p.m., 5 min. a 4°C
3. Retirar el sobrenadante y añadir 1 ml de metanol.
4. Centrifugar a 140000 r.p.m., 5 min. 4°C
5. Recoger el sobrenadante y medir en el espectrofotómetro a las longitudes de onda indicadas
en las fórmulas correspondientes. Las concentraciones vienen dadas en µg/ml

Ecuaciones para Chlorella y Dunaliella (Wellburn, 1994)

Cl a = 15.65 A666 - 7.34 A653

Cl b = 27.05 A653 - 11.21 A666

Ecuaciones de para Spirulina (McKinney, 1941)

Cl a = 13.9 A665

4. Determinación de la tasa de crecimiento

La tasa de crecimiento µ representa el crecimiento por unidad de biomasa (expresada en función de la
densidad óptica en este experimento). Para determinarla, normalizar los valores de absorbancia y
representarlos en escala logarítmica frente al tiempo en horas. La tasa de crecimiento viene dada por
pendiente de la fase logarítmica de crecimiento.

El tiempo de duplicación g de la biomasa se calcula según la ecuación: g = ln2/µ = 0.693/µ

Latencia Exponencial Transición Estacionaria Senescencia

TIEMPO

5. Determinación de la producción
Expresa los gramos de peso seco obtenidos después de deshidratar la biomasa por la superficie de cultivo
expresada en m2 y los días que se ha mantenido el cultivo desde su inoculo hasta el cosechado:

P= g PS/ m2 d
PRACTICA N 2.- CULTIVO INTENSIVO DE MACROALGAS DE INTERES INDUSTRIAL /
POLICULTIVO

INTRODUCCION

El desarrollo de sistemas de cultivo intensivo en tierra "indoor" surge a mediados de la década de los 70
(Neish et al. 1977; Ryhter et al. 1978) como resultado de la necesidad de desarrollar sistemas de
producción intensiva de macroalgas marinas de interés comercial como fuente alternativa de biomasa,
debido a la sobreexplotación de las poblaciones naturales.

Los sistemas de cultivo intensivo indoor a diferencia de los realizados en mar abierto ("outdoor)", se
caracterizan por una mayor producción por unidad de superficie y un mayor control sobre el proceso de
cultivo y sobre la calidad de la biomasa producida.

El cultivo "indoor" puede ser realizado en diferentes sistemas de cultivo como tanques, estanques,
tanques tipo raceways o en sistema de flujo por aspersión, con aporte discontinuo o continuo de agua
(sistemas abiertos, cerrados, semicerrados). Una alternativa a la fertilización artificial la constituye el
desarrollo de sistemas de biofiltración de efluentes de piscifactorias en el que los nutrientes disueltos en
el agua son asimilados por las algas (Neori et al. 1991; Jiménez del Río et al. 1994).

Existen una gran variedad de factores que regulan la eficacia (rentabilidad) de los sistemas de cultivo
intensivo. Estos factores pueden ser de tipo abiótico (irradiación, carbono inorgánico disuelto, pH,
oxígeno disuelto, nutrientes, temperatura, salinidad), bióticos (densidad, morfología de la planta,
epifitismo) y/o técnicos (aireación, paletas, diseño del tanque).

MATERIAL Y METODOS

- Preparación de tanques de cultivo: limpieza y tasas de renovación.

- Inoculación de la biomasa de Gracilaria cornea (densidad 12 g l-1), Grateulopia doryphora (densidad
12 g l-1), Ulva sp. (densidad 2 g l-1), Enteromorpha compressa (densidad 2 g l-1).
- Control de parámetros físicos:
- pH
- temperatura
- oxígeno disuelto
- Cosechado y cálculo de tasas de crecimiento y producción a los t días.

Las prácticas de cultivo se realizarán en un invernadero con tanques semicirculares y circulares de 750
y 1500 L de capacidad, donde se tendrá en cuenta lo siguiente:

- Cultivo en aguas residuales procedentes de tanque de cultivo de dorada (Sparus aurata).

- Circuito abierto.
- Desarrollo de flora epífíta en los tanques/algas de cultivo.

Calculo de la tasa específica de crecimiento.

Se calcula a partir de la estima de los incrementos de peso fresco escurrido con respecto al tiempo. Al
referirnos a peso fresco escurrido hablamos de algas en el interior de redes suspendidas, de modo que,
no presenten restos visibles de agua sobre la superficie del talo en el momento de la pesada.

Según DeElia y DeBoer (1978)

Wt
100 Ln( )
= W0
t
donde:  = Promedio de crecimiento diario en porcentaje
Wt= Biomasa alcanzada en t días
W0= Biomasa inicial

Cálculo de la producción
Según DeBoer y Ryther:

N t - N 0 PS
*
P= t PH = gPSm-2 -1
d
A
donde: P = Tasa de producción (en PS)
Nt-N0= Excedente en gramos de PH, a los t días.
PS/PH= Relación peso seco* / peso escurrido.
A =Area de cultivo en metros cuadrados (1,7 y 1,2 m2)
El peso seco se determina con muestras secadas en estufa a 90 C durante 24 h.

RESULTADOS

- Medición de parámetros físicos en el Muelle de Taliarte:

- pH =
- Temperatura (C) =
- Salinidad (%o) =
- Concentración de O2 (mg l-1) =

pH O2 O2
Tanque Nº/nombre Tª (ºC) pH Tª (ºC)
entrad (mg/l) (mg/l)
macroalga entrada tanque tanque
a entrada tanque

Fecha de inoculación:
Fecha de cosechado:
nº de días en cultivo:
Relación PS/PH (Gracilaria)= 0,1

Tanque Nº/nombre Di Df Peso  Producc.

macroalga (g l-1) (g l-1) (g) (%) (g PS m-2 d-1)

BIBLIOGRAFIA

D'Elia C. F. & J. A. DeBoer. - 1978. J. Phycol. 14: 266-272.

DeBoer J. & J. Ryther. - 1977. In: R. W. Krauss (ed.), pp 231-248. Oregon State University Press.
Jiménez del Río, M., Z. Ramazanov & G. García-Reina, 1994. Scientia Marina. 59 (4): 1-7.
Neish, A. C.; P. F. Shacklock, C. H. Fox & F. J. Simpson 1977. Can. J. Bot., 55: 2263-2271
Neori, A., I. Cohen & H. Gordin, 1991. Bot. mar. 34: 483-489.
PRACTICA N 3.- FICOCOLOIDES

OBJETIVOS

Demostrar y enseñar:

1. Los principios, las necesidades y la realización de una extracción de agar, carragenatos y alginatos a
escala de laboratorio
2. Cuales son los parámetros de caracterización y calidad de los diferentes ficocoloides y como se
determinan
3. Cuales son las aplicaciones de cada tipo de ficocoloide dependiendo de sus características físico-
químicas

INTRODUCCION

Los ficocoloides son polisacáridos estructurales que se encuentran en la pared celular y en la matriz
intercelular de algunas especies de Feofitas y Rodofitas. En algunos casos pueden llegar a constituir
hasta el 60% del peso seco del alga, aunque en las extracciones comerciales las concentraciones
oscilan entre un 20 y un 30%. Sus funciones biológicas principales son las de mantener la integridad
celular y generar fuerza mecánica.

Los ficocoloides se clasifican en los siguientes tipos:

- ALGINATOS: extraídos de Feofitas (Laminaria, Ascophyllum, Macrocytis)

- AGAR: extraídos de Rodofitas (Gelidium, Gracilaria)
- CARRAGENATOS: extraídos de Rodofitas (Chondrus, Eucheuma)

Las aplicaciones específicas, mercado y precio de estos polisacáridos dependen de su comportamiento

en soluciones acuosas.

 Todos tienen gran poder viscosante y gelificante

 Los geles de agar y carragenato son termoreversibles y presentan grandes histéresis de gelificación
 Todos los geles aumentan su dureza al disminuir la temperatura y al aumentar la concentración.

1.- AGAR

Extracción de agar de Gelidium y Gracilaria

La principal diferencia entre la extracción de agar de Gelidium y Gracilaria radica en la necesidad de

efectuar una "hidrólisis alcalina" previa (con cualquier especie de Gracilaria) cuya función es la de
aumentar la dureza del gel del agar mediante la:

- hidrólisis de grupos sulfato y

- transformación de L-Galactosa 6 sulfato en 3,6 anhidro-galactosa

1.1.- Extracción de agar de Gelidium

Pretratamiento: Pesar 50 g de alga seca. Introducirlas en un vaso de precipitado con una solución de
0.5 g de CO3Na2 en 800 ml de agua destilada.
Calentar a 80 C durante 20 min agitando con una varilla de cristal.
Después de los 20 min, repetir tres veces el lavado del alga con agua del grifo.

Extracción: Introducir las algas en 1.5 L de agua destilada. Ajustar el pH entre 6.5 y 7.5 con ácido
fosfórico al 10%. Meter el matraz en el autoclave (1 kg cm-2) durante tres horas.

Filtración: Añadir 50 g de ayuda de filtración (tierra de diatomeas) y filtrar con aire comprimido. El
filtrado se vierte en una bandeja y se mete en el congelador a -20 C.

Al dia siguiente se descongelará a temperatura ambiente y luego se secará en la estufa y se molerá.

1.2.- Extracción de agar de Gracilaria

Pretratamiento: Pesar 65 g de alga seca. Introducirlas en 1 L de una solución de NaOH al 5%.

Mantener a 70C durante 2 horas y media. Entonces lavar 3 veces durante 15 min con
agua fria y una vez con 1.5 L de agua con 0.32 ml de SO4H2 durante 20 min.

Extracción: Meter las algas en 1.5 L de agua destilada, calentar y antes de hervir enfriar a 80C y
ajustar el pH entre 6.4-6.6 con ácido fosfórico al 10%.
Picar las algas con la picadora. Hervir durante 30 min agitando con una varilla
continuadamente.

Filtración: Añadir 50 g de ayuda de filtración y filtrar con aire a presión. Verter el filtrado en una
bandeja y congelar a -20C. Al dia siguiente se descongelará a temperatura ambiente y
luego se secará en la estufa y se molerá.

1.3.- Determinación del punto de fusión y punto de gelificación

1.3.1.- Punto de fusión

 Preparar una solución al 1.5% de agar en agua destilada. Disolver en una placa calefactora a reflujo
durante 30 min cuando comienze a hervir.
 Poner 20 ml de la solución en un tubo de vidrio (diámetro 18 mm y 15 cm largo) y dejarlo enfriar toda la
noche en posición vertical.
 Poner el tubo con el gel en un vaso de precipitado lleno con agua y calentar en una placa calefactora con
agitación.
 Situar una bola de acero de 16 mm de diámetro en la superficie del gel y poner un termómetro entre 50-
100 C en el agua.
 Cuando el agar comienze a fundirse, la bola caerá al fondo del tubo. Mirar la temperatura del agua.
 Sacar el tubo del agua y medir la temperatura en su interior. Esa será la temperatura de fusión.

1.3.2.- Punto de gelificación

 Sacar la bola de metal del tubo e introducir una perla de vidrio. Situar el tubo en un vaso de precipitado
lleno con agua que ha sido calentada a 50C previamente. Introducir un termómetro en el tubo.
 Poner el tubo en un ángulo de 45 y rotarlo en el sentido de las agujas del reloj. La perla de vidrio
debería moverse libremente en el fondo del tubo.
 A medida que la solución se enfría, continuar girando el tubo hasta que la perla de vidrio se para. La
temperatura que marca el termómetro en ese momento es la temperatura de gelificación del agar.

1.4.- Determinación de la fuerza de gel (Método Kobe con el sistema Nikan)

Por este método se mide la fuerza capaz de romper un gel de una concentración de 1.5% en 20 s.

 Preparación del gel: Preparar una solución del 1.5% de agar como se explicó previamente (Tª de fusión).
La cantidad a preparar es la necesaria para formar un gel de 3 cm de espesor en una caja metálica de 6 x
30 x 4.5 cm.
 Una vez formado el gel (enfriado a temperatura ambiente) se procederá a añadir pesos sobre un pistón
de 1 cm2 hasta que el gel se rompa justo después de 20 s. Si el pistón rompe el gel antes de los 20 s,
repetir la operación en otro espacio libre utilizando menos peso.
 El peso empleado + el peso de la pieza que contiene el pistón representan la fuerza de gel de la solución.

¿?- Calcula los rendimientos en la extracción de agar: ¿Cuales fueron los rendimientos en % del agar de
Gelidium y Gracilaria?

RGel = % RGra = %

¿?- Cuales fueron los puntos de fusión y gelificación del agar comercial y de los extraídos durante la práctica
(si es posible).

TFusA = C TFusG = C TFusGr = C

TGelA = C TGelG = C TGelGr = C
¿?- Cual fue la fuerza de gel (en Nikan = g en peso) del agar comercial y de los extraídos durante la práctica
(si es posible).

FgA = Nikan FgG = Nikan FgGr = Nikan

2.- CARRAGENATOS

2.1.- Extracción de carragenatos de Eucheuma

 Pesar 10 g de alga e introducirlos en una solución de CaCl2 al 2% (200 ml). Mantenerlo en esta solución
durante 1 h. De esta manera se consigue que el carragenato insoluble se separe al lavar con una mínima
cantidad de agua destilada después de haber filtrado con vacío.
 Suspender el alga hidratada en 300 ml de una solución 0.1M de NaOH.
 Mantener en un baño maría a 90-95C durante 4 h. Agitar el matraz regularmente y asegurarse que el pH
de la solución es alcalino con papel indicador de pH. Añadir unas gotas de NaOH 1M si la solución se
vuelve ácida.
 Después de las 4 h, añadir 20 g de tierra de diatomeas y mezclar bien. Volver a incubar en el baño maría
durante 5 min.
 Filtrar con aire a presión.

2.2.- Identificación del carragenato

 Verter 50 ml de la solución en un cristalizador y enfriar la solución con la ayuda de una bandeja con hielo
en escamas.

¿?- ¿Cuales fueron los rendimientos en la extracción de carragenatos?

RA = % RB = %

¿?- ¿De que tipo de carragenatos se trataba?

3.- ALGINATOS

3.1.- Extracción de alginato de Laminaria

Materiales: 0.2N HCl, 2M NaOH, NaCl, Etanol (96 y 60%), dietileter, papel de filtro, agitadores
magnéticos, barras de vidrio

 Pesar 5 g de algas secas y molidas. Suspenderlas en 250 ml de HCl (0.2N) y mantenerlas en un agitador
toda la noche. Al dia siguiente filtrar el contenido del matraz y lavar el residuo 3 veces con agua destilada.
 Suspender las algas en 250 ml de agua destilada y neutralizar (pH 7.0) con adición de NaOH (2M) al
mismo tiempo que se agita. El proceso de neutralización es lento y hay que controlarlo bien.
 Después de asegurarse que el pH es 7.0 filtrar la solución viscosa de alginato de sodio con aire a presión,
añadir NaCl para alcanzar 0.5% (w/v) y agitar para solubilizarlo.
 Añadir un volumen igual de etanol 96% mientras se agita lentamente y recuperar la fibra de alginato con
una barra de vidrio. Si no se forman fibras de alginato, éste puede ser recuperado por centrifugación o
filtración.
 Lavar el precipitado 2 veces con 60% etanol, 2 veces con 96% etanol y finalmente con dietileter. Dejar
el alginato de sodio en una cabina de extracción para evaporar el eter. Pesar y estimar el rendimiento en
% por peso seco de alga.

¿?.- ¿ Cuales fueron los rendimientos obtenidos en la extracción ?

3.2.- Propiedades de gelificación de los alginatos: influencia de la concentración de alginato y los iones en
solución.

 Preparar 100 ml de soluciones al 4% de alginato de Macrocystis y Laminaria hyperborea con agitación,

dejarlas bastante tiempo para disolver bien el alginato.
 Preparar soluciones adicionales disolviendo con agua destilada en proporción 1:20.
 Introducir las membranas de diálisis en agua destilada durante al menos 10 min.
  Cortarlas al tamaño de los cilindros de plástico. Cerrar uno de los extremos y llenar los cilindros con las
diferentes soluciones. Cerrar el otro extremo con las anillas de goma evitando que queden burbujas de
aire.
 Dejar los cilindros durante toda la noche en diferentes soluciones de: 0.1M CaCl2, 0.1M NaCl, 0.1M HCl y
0.1M MgCl2.

¿?- Observa y describe lo que ocurre después de abrir y separar los cilindros.

¿?- ¿ Cual es la diferencia entre las soluciones 4% y 0.2% ?

¿?- Describe los resultados de la diálisis con HCl, CaCl2 y MgCl2

¿?- Las diferencias entre los diferentes alginatos son:

¿?- Hervir algunos geles de alginato en agua durante 5 min. ¿Cual es la diferencia entre el alginato y los
geles de agar/carragenato?

3.3.- Inmobilización con alginatos

 Preparar una solución de alginato de Laminaria (300 mg en 10 ml de agua destilada). Asegurarse que el
polisacárido está bien disuelto.
 Mezclar a partes iguales con medio conteniendo células algales (Spirulina, Chlorella o Dunaliella)
 Añadir un volumen en la cámara del "bead-maker", ajustar la presión de nitrógeno para obtener perlas
con talla uniforme (1-2 mm).
 Observar las perlas que se van formando al caer las gotas de alginato en una solución 0.1M de CaCl2,
mientras se agita lentamente.

¿?- Que aplicaciones se te ocurren para este tipo de immobilización.

PRACTICA N 4.- PREPARACION DE COMPUESTOS CON APLICACIONES COSMETICAS A BASE DE
ALGAS

1.- OBJETIVOS

1. Conocer una de las múltiples aplicaciones de las algas en la industria

2. Conocer procesos de preparación de extractos algales para su posterior aplicación.
3. Valorar el aporte de algas a los preparados cosméticos.
4. Conocer algunos principios básicos de cosmetología.

2.- INTRODUCCION

El uso de los productos para el cuidado corporal se remonta a la época de los Egipcios. Francia es el primer pais
en definir en su legislación el producto cosmético como "... sustancia o preparación destinada a las partes
superficiales y mucosas del cuerpo humano para limpiar, proteger, mantener en buen estado, modificar el aspecto
o perfumar" (año 1975). Se diferencian los cosméticos de los medicamentos, en que su acción es sólo superficial.
En España se crea en 1977 el Comité Científico de Cosmetología.

Las microalgas se introducen como ingredientes naturales (preferidos por el mercado frente a los artificiales) en el
estudio de nuevas fórmulas cosméticas como principio activo que:
 proporciona vitaminas, acidos grasos y aminoácidos a la piel
 protege naturalmente de los rayos solares debido a sus pigmentos

El producto cosmético más importante son las cremas hidratantes porque:

 palían las insuficiencias de la barrera epidérmica, restaurando la película lipídica que se opone a la
evaporación de la capa córnea
 fijan agua mediante sustancias higroscópicas y humectantes cuyo fin es capturar el agua del ambiente
para que hidrate la piel.

Las cremas son generalmente emulsiones constituidas por una fase acuosa, una fase lipofílica y emulsionantes.
Los emulsionantes son productos químicos que disminuyen la tensión superficial de la interfase entre los dos
medios para mantener la estabilidad de la solución.

Estas emulsiones pueden ser de dos tipos:

 emulsiones aceite en agua: constituidas por una mayor cantidad de fase hidrofílica. Dejan sobre la piel
una sensación de frescor, relacionada con la evaporación de la fase acuosa.
 emulsiones agua en aceite: mantienen sobre la piel una película lipídica semipermeable de mayor
duración, por su gran contenido en fase lipofílica. Se usan para pieles secas.

El alga seleccionada para la elaboración del fotoprotector es Spirulina ya que su composición química se
caracteriza por:
 Destaca un ácido graso esencial, el gamma-linolénico, que está reconocido como agente anticancerígeno
y combate además varias enfermedades de la piel.
 Contiene una enzima, la superóxido dismutasa, que actua contra los radicales libres, agentes
destructores de las proteinas, ADN y membranas.
 Sus principales pigmentos son: ficocianina, zeaxantina y clorofila. Actuan de filtro de los rayos del sol en
la longitud de onda en la que absorben.
 La vitamina E que contienen protege de los efectos de los rayos UV y la vitamina A evita la pérdida de
agua de la piel.
 Los aminoácidos funcionan como tampones de los agentes alcalinos que dañan la piel.

La introducción de algas en la crema también presenta ciertos inconvenientes:

 el precio se eleva debido al proceso de preparación de las microalgas
 el color que adquiere no es muy apreciado en el mercado, por eso el porcentaje de algas incluido no
puede ser muy alto
 el olor suele ser fuerte. Es conveniente añadir perfume
 el tiempo de conservación de la crema disminuye al introducir materia orgánica viva. Esto implica que el
uso de bactericidas y fungicidas debe ser grande. Entra en conflicto con la naturalidad del producto
 la emulsión puede desestabilizarse, por eso se realizan los test de estabilidad.
3.- MATERIAL Y METODOS

3.1.- Preparación del extracto de Spirulina

 Se cosecharán los cultivos de Spirulina en 12 botellas de 500 ml y se centrifugarán a 8.000 rpm durante
10 min.
 La pasta concentrada se somete a ultrasonidos para romper la pared celular con una sonda durante 5
minutos al 80% de potencia, en vasos de precipitado de 25 ml y manteniendo la temperatura tan baja
como sea posible con hielo picado.

Utilizaremos diferentes porcentajes de microalgas en la crema, del 1 al 4%. Se realizarán 4

preparaciones diferentes. Este conjunto de preparaciones se denomina gama de preparación. Cada
grupo usará un porcentaje diferente para completar la gama entre todos.

3.2.- Preparación del fotoprotector

1.- Fase lipofílica (%)

Base OW L-200 16
Aceite de almendras 3
Manteca de Karité 2
Isopropilo miristato 3
Filtro solar 1
D-L.-Tocoferol 0.3
2.- Fase hidrofílica
Dióxido de Titanio 1
Extracto de algas 10
Glicerina 4
Agua destilada c.s.p

3.- Conservante
Kathon GC 0.1

1. Pesar todos los compuestos de la fase grasa y calentar al baño maría a 70ºC.
2. Pesar todos los compuestos de la fase acuosa, calentar ligeramente
3. Una vez homogeneizadas se incorpora la fase lipofílica en la fase hidrofílica bajo agitaciónn constante
hasta que aparezcan homogeneas.
4. Incoprorar al conjunto el consrvantea unos 30-35 ºC. Una vez realizada la emulsión se deja enfriar y se
añade la pasta de microalgas en frio. La adición de la pasta en frio evita la desnaturalización de los
componentes activos de las algas.

3.3.- Test de Estabilidad

1. Test cutáneo. La crema debe ser suave, esparcirse fácilmente y tener una buena penetración cutánea.
2. pH. Tras calibrar el pH-metro, medimos el pH de la solución, que debe estar en torno a 6,8.
3. Estabilidad en caliente. Se colocan 20 g de crema en un bote a 40ºC durante 4 h. La emulsión debe
permanecer inalterable.
4. Estabilidad en frio. Se mantiene la crema en una nevera a 4 ºC durante varios dias. No debe alterarse.
5. Centrifugación. Se centrifuga la preparación a alta velocidad durante 15 min. La homogeneidad no debe
cambiar.

Otros posibles análisis de estabilidad son:

6. Test de viscosidad. La media de las mediciones debe rondar 105 cp.

7. Test de envejecimiento. Se trata de acelerar el proceso de envejecimiento de la crema mediante un aparato
hermético que, variando la temperatura y humedad durante 16 dias, simula 1 año de envejecimiento del
producto.
8. Test microbiológico. Análisis microbiológico en 1 gramo de preparación, siguiendo los límites establecidos
por el Comité Asesor de Cosmetología en España.
4.- TERMINOLOGIA

 Base O/W L-200: mezcla de alcohol estearílico-stareh 7, éster isooctadecílico, triglicérido de ácidos
grasos y petrolatum.Base emulgente no iónica, dermatologicamente inócua

 Manteca de karité: extracto natural de nues de Karité.. Presenta propiedades emolientes, estimulantes del
metabolismo y vasodilatadoras que la hacen apropiada en preparados destinados a combatir la sequedad
cutánea, la inflamación y el eritema solar.

 Aceite de almendras: Se emplea por sus propiedades emolientes en emulsiones cosméticas.

 Filtro solar: filtro químico de banda ancha UV A+B

 Dióxido de titanio: filtro físico

 Isopropilo miristato: mezcla de ésteres isopropílicos de los ácidos mistíricos, láurico y palmítico. Tiene
propiedades emoliente, espesante y reengrasante. Confiere tacto graso, facilita su extensión y ayuda a la
penetración.

 Glicerina: propanotriol.. Su empleo, de forma diluida, proporciona suavidad y protección a la piel.

 Kathon GC: contiene 5-cloro-2-metil-4-isotiazolina-3-ona, 2-mentil-4-isotiazolina-3-ona, nitrato y cloruro de

magnesio. Agente microbiano de amplio espectro.

5.- BIBLIOGRAFÍA

Simon, V. (1991) Formulation d'une crème cosmétique au Phytoplankton, BTS biochimie, 40 pp.

D Roeck-Holtzhauer, Y et al. (1993) Vitamin, free amino acids and fatty acids composition of some marine
planktonic microalgae used in aquaculture. Bot. Mar. 36, 321-325.

Berasategui del Alamo, E. (1989) Aplicación de Las Algas a La Cosmética, Diputación Foral de Vizcaya, 251 pp.

Comité Asesor de Cosmetologia (1994) Manual para el control microbiológico de Productos cosméticos, Ministerio
de Sanidad y Consumo, 63 pp. ISBN. 84-7670-383-X.
PRACTICA N 5.- CARACTERIZACION DE MACROALGAS MARINAS PARA ALIMENTACION HUMANA

1.- OBJETIVOS

1. Familiarizar al alumno, potencial consumidor, con el consumo de algas

2. Determinar el efecto de diferentes procesos de preservación de algas sobre las propiedades
organolépticas de las especies seleccionadas.
3. Determinar el nivel de aceptación de consumo de algas sobre un determinado sector poblacional.
4. Elaborar un perfil organoléptico de las algas seleccionadas

2.- INTRODUCCION

El reciente crecimiento del mercado de los procesados de productos marinos ha conducido al desarrollo de gustos
específicos. Un gusto es una combinación de compuestos solubles responsables del sabor y compuestos volátiles
que dan olor y aroma. En la industria de los productos marinos, los gustos están constituidos por extractos
naturales (que dan cuerpo al sabor), sabores artificiales, productos que aumentan el sabor y agentes que
enmascaran otros gustos (produciendo sensación de frescura).

El análisis básico de las propiedades organolépticas da dos tipos fundamentales de información:

1. la descripción de los caracteres organolépticos: sabor, olor, textura, que permiten elaborar perfiles
sensoriales
2. el nivel de aceptación de los consumidores, en este caso el personal que juzga el producto

El objetivo fundamental de esta práctica es conocer cuales son los parámetros básicos a la hora de caracterizar y
decidir si un alga (u otro producto procedente del mar) cumple los requisitos para ser comercializada como
alimento humano. Algunos de los parámetros a estudiar son utilizados usualmente en alimentos ya establecidos y
comercializados a escala industrial: sopas, patés, cremas etc.

3.- MATERIAL Y METODOS

3.1.- Determinación de la humedad y del peso seco

 Calentar dos cristalizadores a 100C en una estufa

 Añadir 500 ml de agua destilada en un vaso de precipitado
 Pesar 25 g de algas secas y añadirlos al vaso de precipitado (proporción alga:agua=1:20). Controlar el
tiempo
 Despues de calentar los cristalizadores y con la ayuda de un guante seco, situarlos en un desecador y
dejarlos enfriar.
 Pesar los cristalizadores con la mayor precisión. Evitar tocarlos con los dedos ya que la humedad puede
alterar el peso del cristalizador
 Pesar entre 5 y 10 g de alga seca en un cristalizador y dejarlos en la estufa a 100C durante 24 h.
 2 horas después del comienzo de la extracción filtrar el líquido con un embudo Büchner usando una malla
de nylon como filtro. Presionar el residuo para extraer todo el líquido retenido.
 Guardar 5 muestras del filtrado (líquido) en botellas de plástico, marcarlas y guardarlas en la nevera
 Añadir el residuo algal en el segundo cristalizador pre-pesado. Secar este residuo en la estufa a 100 C
24 h
 Después de las 24 h sacar los cristalizadores de la estufa y enfriarlos en el desecador (sin tocarlos con los
dedos)
 Pesarlos en la balanza
 Determinación de la humedad:

donde:
(FW - PW)
% H 2 O = 100 * (1 - )
IW

IW= peso inicial de las algas (entre 5 y 10 g)

PW= peso del cristalizador
FW= peso final después de enfriar (cristalizador + alga seca)
  Determinación del peso en materia seca (DM) en 25 g de algas troceadas

% H2O
DM = 25 * (1 - )
100

 Determinación de la tasa de solubilidad (SR) durante el proceso de extracción

(FW + PW)
SR = 100 * (1 - )
DM

donde:
FW= peso final después de enfriar (cristalizador + residuo algal)
PW= peso del cristalizador

¿?.- Discutir y comparar los valores de las tasas de solubilidad. Los rendimientos de extracción de compuestos
aromáticos y otras moléculas (p.e. polisacáridos o proteinas) normalmente aumentan con la tasa de solubilidad.

2.2.- Caracterización aromática del material; análisis sensorial

 (Dia 1) Oler las algas secas y anotar 3 o 4 descriptores a los que te recuerden el olor (puedes usar
cualquier descriptor: palabra o adjetivo siendo tan preciso como sea posible: por ejemplo; en vez de
escribir vegetal escribe tomate, pescado salado en lugar de pescado.
 (Dia 2) Utilizando los extractos preparados el dia anterior. Oler las muestras y anotar los tres o cuatro
olores principales que te recuerdan.
 En la lista de descriptores aromáticos que se adjunta, específica para algas, anota los tres descriptores
que encuentras más precisos para describir los olores.

A RELLENAR POR EL ALUMNO

 ¿Que especies has utilizado para realizar esta práctica?

 Describe las diferencias entre los diferentes extractos y sus correspondientes olores
 Compara también los descriptores de aromas de los extractos con los del material de partida.

2.3.- Determinación de la actividad de agua aw

Principio: En el sector alimentario, se entiende como actividad del agua (valor aw), la humedad en equilibrio de un
producto, determinada por la presión parcial del vapor de agua en su superficie. El valor aw depende de la
composición, la temperatura y el contenido en agua del producto y tiene incidencia sobre las características de
calidad como: propiedades biológicas, contenido en proteínas y vitaminas, características sensoriales (olor, color y
sabor), estabilidad de la composición, solubilidad o consistencia y el tiempo de conservación.

 Utilizando el medidor de actividad de agua, calcular las diferentes actividades de las muestras de algas en
función de:
o su temperatura de secado
o tiempo de secado, y
o tiempo de almacenamiento

¿?.- Anota los resultados obtenidos

.- A la vista de los resultados ¿que conclusiones sacas?; ¿cual sería el mejor tratamiento para mantener la muestra
conservada durante más tiempo?
 4.- TEST ORGANOLÉPTICO
Las algas han sido consumidas tradicionalmente en Asia y de forma marginal en el resto de Europa. En los
países occidentales, las algas son empleadas principalmente en la industria de coloides como fuente de
gelificantes, espesantes y aditivos estabilizantes. En 1990 el Gobierno Francés autorizó 10 especies de
macroalgas para consumo como vegetales o condimentos. Esto ha permitido la venta de diferentes tipos de
algas en tiendas de alimentación, así como su uso en la industria alimentaria bajo diferentes formulaciones
como sopas, galletas, ensaladas, etc.

Muchos productos desarrollados en la agroindustria deben pasar test organolépticos por los consumidores
antes de puesta en el mercado. Este análisis puede ser logrado a través de un análisis sensorial con la ayuda
de personal asesor. El análisis sensorial nos da dos tipos de información básicamente:

1. Descripción de las características organolépticas del producto: sabor, olor, textura, etc.
2. Determinar el nivel de aceptación por los consumidores

Material y métodos

Las especies seleccionadas para realizar este test son las siguientes:
Gracilaria cornea
Hypnea spinella
Ulva rigida

Las muestras a valorar se presentan bajo dos formas en fresco y secas. Los procesos que se han realizado
para la preservación de las muestras secas son:
- Secado con aire caliente
- Liofilización

Rellenar el test que se presenta. Oler y probar las diferentes muestras de algas y anotar 3 o 4 descriptores a
los que te recuerden (puedes usar cualquier descriptor, palabra o adjetivo siendo tan preciso como sea posible,
por ejemplo en vez de escribir vegetal escribe tomate, pescado salado en lugar de pescado.

TEST ORGANOLÉPTICO PARA MACROALGAS (Descriptores aromáticos)

1.- Edad < 20 20-25 25-30 30-35 35-40 >45

2.- Sexo H M
3.- ¿Qué opinión tienes del consumo de algas? Positiva Indiferente Negativa
4.- ¿Has comido alguna vez algún tipo de algas? Si No
5.- ¿Te gustaron? Si No
6.- ¿Dónde las probaste? Restaurante Casa Otros
7.-¿Te gustan las verduras? Si No
Por favor rellena en la siguiente tabla tu apreciación organoléptica de las muestras de algas que se ofrecen (por favor
no expreses tu opinión en voz alta). Aporta tu propia descripción del gusto y olores que percibas.
 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5
DESCRIPTOR
Marino / Mar

Pescado
Pescado fresco …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Pescado hervido (sopa) ……............. ……............. ……............. ……............. …….............
Pescado seco / salado …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Pescado asado …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Pescado aumado …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Pescado podrido …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..

Crustáceos (langostinos..)
Crudo / fresco ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Hervido / cocinado ……………… ……………… ……………… ……………… ………………

Moluscos (mejillones..)
Crudo / fresco ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Hervido / cocinado ……………… ……………… ……………… ……………… ………………

Algas (verdes, rojas…) ……………… ……………… ……………… ……………… ………………

Costa (agua costera) ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Lodos (estancadas) ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Otros marino (definir) ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Plantas / Vegetales

Hierba fresca …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..

Verduras crudas (lechuga.) ……............. ……............. ……............. ……............. …….............
Perejil …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Té …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Vegetales hervidos (sopa..) …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Vegetales asados (cebolla..) …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Flores ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Fruta ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Hierba húmeda ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Champiñones, liquenes ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Hongos / moho ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Animal

Carne cruda …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..

Carne hervida ……............. ……............. ……............. ……............. …….............
Carne asada / frita …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Carne aumada …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Carne podrida …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Piel …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Miscelánea

Chocolate …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..

Café ……............. ……............. ……............. ……............. …….............
Dulce, azúcar, miel, vainilla …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Azucar tostada, caramelo …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Pan tostado …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Especias (clavo, orégano) …………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
Goma quemada ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Orina ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Fuerte, desgradable ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Acido ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Salado ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Amoniaco ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Otros (definir) ……………… ……………… ……………… ……………… ………………
Otros (definir)