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24 DE MAYO DE 2018

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
PARTE A: FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE JUGO DE POMELO
PARTE B: USO DEL SACARÍMETRO DE EIHÖRN

DOCENTES:
STELLA, LAURA INES
GARCIA, ROCIO

ALUMNO: NOLTE RAFAEL


COMISIÓN 5
UTN FRRe
1 Biotecnología Fermentación Alcohólica UTN FRRe

Introducción
Todos los organismos vivos se caracterizan por tener asociada consigo el proceso de metabolismo.
El mismo es el medio por el cual los organismos sintetizan energía para satisfacer las demandas
internas que tienen de la misma. El metabolismo en si consiste en dos etapas, el anabolismo y el
catabolismo. El catabolismo comprende los procesos asociados a la transformación de
macromoléculas complejas en otras moléculas más sencillas, con su consecuente almacenamiento
de energía proveniente de los enlaces que se rompen de estas moléculas complejas, en forma de
ATP. Las levaduras son microorganismos anaeróbicos facultativos (es decir, capaces de vivir en
ausencia de oxigeno). Esto implica que pueden obtener energía independientemente de si hay o
no oxígeno. Para las levaduras y en general, la respiración celular es el proceso catabólico
mediante el cual el rendimiento energético es mayor. No obstante, poseen la capacidad
adaptativa de poder obtener energía en ausencia de oxígeno. Este proceso alternativo de
obtención de energía se denomina fermentación alcohólica. La fermentación alcohólica se origina
al ponerse en contacto varias especies de levaduras que atacan el azúcar y otras sustancias
presentes en el jugo, formando etanol y otros compuestos. Para esta experiencia se empleara jugo
de fruta (pomelo), el cual será un sustrato óptimo para llevar a cabo la práctica.

Materiales
 Vaso de precipitado
 Pisetas
 Probeta
 Varas de vidrio
 Exprimidor
 Pomelo amarillo (dos unidades)
 Sacarímetro de Eihörn
 Varilla de vidrio

Instrumentos
 Balanza granataria
 pH metro
 Cámara de Neubauer
 Cubre cámara
 Microscopio óptico

Reactivos y/o sustancias


 Agua destilada
 Levadura de panadería
 Azúcar
 Alcohol etílico
 Glucosa

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Parte A: Fermentación Alcohólica de Jugo de Pomelo


Objetivos
 Conocer la biología de las levaduras como responsables de la fermentación alcohólica.
 Realizar un proceso fermentativo espontáneo de jugo de pomelo en el laboratorio.
Estudiar las reacciones de la fermentación alcohólica.

Desarrollo
El desarrollo del práctico dio inicio con la preparación del jugo de pomelo, comenzando por
exprimirlo y tomar nota de las características apreciables en el mismo. Para extraer el jugo se utilizó
un exprimidor eléctrico. A razón de favorecer el proceso de fermentación se añadió azúcar al jugo
de pomelo, con el posterior agregado de levaduras de panadería, siendo estas las responsables de
llevar a cabo el proceso fermentativo.

La extracción consistió en extraer en total unos 350ml de jugo de pomelo aproximadamente.


Posteriormente se pesaron y agregaron las cantidades requeridas de azúcar y levadura al jugo de
pomelo recién extraído. A este último se le hicieron las mediciones de pH correspondientes al antes
y después de agregársele el azúcar y levadura antes mencionados. Las propiedades organolépticas
de la muestra preparada fueron registradas adecuadamente.

Pasados unos 30 minutos aproximadamente, se extrajo una alícuota de 5ml para preparar en un
matraz de 50ml, una dilución 1/10 a fin de realizar un primer recuento de células de levadura en la
cámara de Neubauer bajo microscopio óptico. Las observaciones microscopio se realizaron con un
aumento total de 400x, siendo 10x correspondientes al lente ocular y 40x al lente objetivo.

El vaso de precipitado donde se dispuso la muestra de pomelo con azúcar y levadura se cubrió con
papel metálico de modo que se mantengan las condiciones de anaerobiosis y además, impedir que
cuerpos extraños puedan alojarse o disponerse dentro del vaso afectando a la experiencia.

La toma de una alícuota con su inmediata dilución o no, se realizó luego a diferentes tiempos
posteriores correspondiendo a: pasadas 12hs, 36hs y luego 120hs (5dias) de la preparación de la
muestra de juego de pomelo con azúcar y levaduras. Cada análisis de estas alícuotas consistió en
observar al microscopio para realizar el conteo correspondiente de células de levadura presentes
en la muestra para cada tiempo.

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Observaciones:
A continuación se presentan las características observadas en la muestra preparada del jugo de
pomelo, a distintos tiempos de análisis.

1. Jugo de pomelo recién exprimido


i. Color: amarillo claro
ii. Sabor: amargo
iii. Olor: cítrico, característico del pomelo
iv. pH medido: 3,21
v. Presencia de sombrero: no
vi. Presencia de borra: no
2. Jugo de pomelo con azúcar y levaduras agregadas
i. Color: amarillo opaco
ii. Sabor: disminución en la intensidad del sabor amargo por el agregado de
azúcar. También presento sabor propio a la levadura presente.
iii. Olor: cítrico, con trazas de aroma a las levaduras agregadas.
iv. pH medido: 3,12
v. nº células/ml: 117.500.0001
vi. Presencia de sombrero: si
vii. Presencia de borra:
3. Jugo de pomelo a las 12hs de agregarse las levaduras
i. Color: amarillo opaco
ii. Sabor: amargo intenso.
iii. Olor: aroma penetrante y astringente.
iv. pH medido: 4
v. nº células/ml: 194.000.0002
vi. Presencia de sombrero: si
vii. Presencia de borra: no
4. Jugo de pomelo a las 36hs de agregarse las levaduras
i. Color: amarillo opaco
ii. Sabor: intenso y amargo, con presencia de sabor del etanol.
iii. Olor: aroma penetrante y astringente. Podía apreciarse la presencia de
alcohol formado a partir del aroma.
iv. pH medido: 3,8
v. nº células/ml: 375.000.0003
vi. Presencia de sombrero: si
vii. Presencia de borra: si
5. Jugo de pomelo a las 120hs de agregarse las levaduras
i. Color: amarillo claro
ii. Sabor: intenso y amargo, con presencia de sabor del etanol.

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Observadas en cámara de Neubauer con aumento ocular 10x y lente objetivo 40x (aumento total: 400x).
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Observadas en cámara de Neubauer con aumento ocular 10x y lente objetivo 40x (aumento total: 400x).
3
Observadas en cámara de Neubauer con aumento ocular 16x y lente objetivo 40x (aumento total: 640x).
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iii. Olor: aroma penetrante y astringente. Podía apreciarse la presencia de


alcohol formado a partir del aroma.
iv. pH medido: 3,8
v. nº células/ml: 1.600.0004
vi. Presencia de sombrero: si
vii. Presencia de borra: si

Resultados y gráficos
nº Células/ml tiempo [h]
117.500.000 0,5
194.000.000 12
375.000.000 36
1.600.000 120

Curva de Crecimiento para Levadura


400,000,000
375,000,000 375,000,000
350,000,000

300,000,000
194,000,000
N [n° celulas/ml]

250,000,000

200,000,000

150,000,000

100,000,000 117,500,000

1,600,000
50,000,000

0
0 20 40 60 80 100 120 140
tiempo [h]

En la gráfica puede apreciarse un proceso de fermentación espontanea a partir de jugo de pomelo


al cual se le agrego azúcar y levadura. Puede establecerse que de la experiencia se obtuvo una curva
representativa de los tres periodos o etapas típicas en una curva de crecimiento.

En el primer tramo, representado por la línea continua, puede apreciarse un crecimiento en número
de células en las muestras tomadas para distintos tiempos. Esta etapa corresponde a la
multiplicación donde la reproducción de las células es rápida, de manera tal que el medio es
ocupado en mayor medida por aquellos microrganismos capaces de reproducirse con mayor
velocidad respecto a otros, o que sean capaces de generar productos metabólicos o sustancias

4
Observadas en cámara de Neubauer con aumento ocular 10x y lente objetivo 40x (aumento total: 400x).

4
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inhibidoras para el desarrollo de otros microrganismos. Para la experiencia realizada el crecimiento


en número, de las levaduras fue tan grande que al principio se realizaron diluciones 1/10 de la
muestra para realizar las observaciones microscópicas, mientras que para el tercer punto, fue
necesario diluir 1/20 veces para lograr visualizar a un nivel que permita el conteo de las levaduras
como también la visualización de la cuadricula de la cámara. El aumento en el número de células
podría verse reflejado en un aumento en la turbiedad de la muestra preparada.

A partir del tercer punto se estima (debido a la falta de tiempo para obtener más datos) que se
alcanza la segunda etapa observable en el gráfico (en línea de puntos), la fase estacionaria. En esta
etapa las levaduras dejan de reproducirse con tanta velocidad debido a que la fuente de carbono
(azúcar agregada y presente en el jugo de fruta) ya no es suficiente para cubrir la demanda de la
población de células. El cuarto punto correspondiente para las 90hs de realizarse la extracción del
jugo, es solamente estimativo para determinar un rango en el que podría haberse mantenido la fase
estacionaria.

Luego de aproximadamente 90hs de prepararse la muestra, las células de levadura comienzan a


morir, representando en la tercer etapa del grafico (en línea de puntos) donde se aprecia la etapa o
fase de muerte. Durante esta etapa las levaduras mueren como consecuencia de agotarse su fuente
de alimento y energía, el azúcar. Las levaduras muertas se depositan en el fondo y puede apreciarse
eso en los fondos o borra del vaso de precipitado que contiene la muestra del jugo de pomelo
preparado

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Esquemas

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Parte B: Uso del Sacarímetro de Eihörn


Objetivo
 Estudiar la cinética de la fermentación alcohólica.

Desarrollo
Se procedió a pesar la glucosa necesaria para preparar 50ml de solución de glucosa al 10% (5g
aproximadamente) y la levadura seca a agregar, que fue de 0,015g aproximadamente. Para
favorecer la actividad de las levaduras se preparó la solución utilizando agua tibia. A esta solución
de glucosa se la preparo en un vaso de precipitado. Una vez lograda la solución se le añadió la
levadura pesada agitando con una varilla de vidrio para favorecer la disolución de esta en el agua. A
este preparado se lo dispuso luego en el sacarímetro de Eihörn, evitando que queden burbujas de
agua. Al mismo instante se comenzó a tomar el tiempo con cronometro para poder determinar, a
partir de las graduaciones en el sacarímetro, los volúmenes de gas generado a distintos tiempos.

Observaciones, resultados y gráficos


De la experiencia realizada se obtuvieron los siguientes datos de volumen de dióxido de carbono
generado a distintos tiempos medidos:

tiempo [min] volumen de CO2 [ml] tiempo [min] volumen de CO2 [ml]
0 0 30 0,8
5 0,01 35 1,6
10 0,05 40 2,4
15 0,1 45 3,3
20 0,2 50 4,1
25 0,5 30 0,8

Volumen de CO2 vs tiempo


4.5
4
3.5
3
2.5
ml CO2

y = 1E-05x3 + 0.0015x2 - 0.0277x + 0.0691


2
R² = 0.9953
1.5
1
0.5
0
-0.5 0 10 20 30 40 50 60
minutos

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Conclusión/es
Los objetivos propuestos para la experiencia fueron alcanzados de manera satisfactoria. Logro
realizarse el proceso de fermentación alcohólica espontanea en una muestra de jugo de pomelo en
laboratorio. A partir de los datos obtenidos se construyó y analizo la curva de crecimiento
correspondiente para las levaduras, siendo estas los microorganismos dispuestos en el jugo para
realizar la fermentación en el mismo. A partir de la curva de crecimiento, se distinguieron las
diferentes etapas que suceden durante el mecanismo asociado a la cinética del crecimiento
microbiano.

A su vez, fueron aplicados los conocimientos adquiridos en prácticos anteriores acerca del uso del
microscopio, preparación de cámara Neubauer y el conteo de microorganismos.

La realización de este práctico permitió comprender la importancia que posee el estudio de la


cinética microbiana como parte del estudio de una operación muy utilizada tanto en industria
alimentara como en biotecnología.

Bibliografía
 Apuntes proporcionados por la catedra de Biotecnología, UTN FRRe.
 http://www.fmed.uba.ar/depto/microbiologia/catedra2/sem101.pdf
 Aquiahuatl Ramos, María de los Ángeles. Manual de prácticas de laboratorio de
microbiología general. Primera edición. Año 2004.

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