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VALDIVIA – CHILE
2004
PROFESOR PATROCINANTE Dra. Erika Gesche R.
Nombre Firma
RESUMEN ................................................................................................................ 1
SUMMARY ............................................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 3
RESULTADOS ........................................................................................................ 16
DISCUSION ............................................................................................................. 18
BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 22
ANEXOS .................................................................................................................. 27
AGRADECIMIENTOS ........................................................................................... 31
3. RESUMEN
Las muestras analizadas para cada bacteria se asociaron a las variables de procedencia
(provincia) y sexo de los animales. E. coli presentó algunas diferencias (p<0,05) entre las
provincias de origen las cuales no son concluyentes. Enterococcus en cambio, no presentó
diferencias (p>0,05). En el caso de la variable de la asociación a la variable de sexo de los
bovinos muestreados no se presentaron diferencias (p>0,05) por parte de ninguna de las
bacterias indicadores lo que permite concluir que las variables consideradas no tienen relación
con la frecuencia de aislamiento.
Isolation of Escherichia coli and Enterococcus spp. from bovine rectal contents.
Given the great importance of innocuously in food supplies, as also in the resistance that
the pathogen microorganisms have developed against antimicrobial agents, the main objective
of this study was the determination of the presence of Escherichia coli and Enterococcus in
bovine feces as indicators of faecal contamination and resistance to antibiotics. The isolation
of the bacteria was done from 117 samples of feces of bovines in apparent good health
condition originary from four province of southern Chile. This samples were obtained from a
slaughterhouse in Valdivia and were analysed in the Food Laboratory at the Universidad
Austral de Chile. MacConkey agar N° 3 was used for the isolation of E. coli, and for
Enterococcus the Enterococcosel agar was used. Later, biochemical tests were applied for the
confirmation of both bacteria and for the identification of the Enterococcus species (E.
faecalis, E. faecium and Enterococcus spp).
The presence of both bacteria in bovine feces was low. The 23,9% of Enterococcus
positive samples reflects his low presence in adult bovines. On the other hand, E. coli was 2,8
times more abundant than Enterococcus with a 67,5% of positive samples, being a better
indicator of faecal contamination than Enterococcus. Only two samples of Enterococcus were
identified as E. faecalis and only one as E. faecium from all the 28 positive samples. The rest
was identified as Enterococcus spp.
The variables of origin (province) and sex of the bovines were associated to the positive
samples of each bacteria. E. coli positive samples showed some differences (p<0,05) which
were inconclusive between the provinces of origin. Enterococcus didn’t show differences for
this variable (p>0,05). None of this two indicator bacteria showed differences (p>0,05) in the
association of the positive samples with the sex variable of the bovines. This leaves to the
conclusion that there isn’t an association between the variables and the presence of the
bacteria.
Los microorganismos están presente en el ambiente natural del hombre (agua, suelo,
aire, etc.), en el propio hombre y en todos los seres vivos de los que el hombre se alimenta. De
hecho, cualquier producto alimenticio, transformado o no, que el hombre consume, puede
estar contaminado con microorganismos (Bourgeois y col, 1994).
Una enfermedad transmitida por los alimentos (ETA) ha sido definida por la
Organización Mundial de la Salud (OMS) como: “cualquier enfermedad de naturaleza
infecciosa o tóxica producida, o que se piensa sea producida por el consumo de alimentos o
agua” (Adams y Moss, 2000).
Algunas cepas bacterianas son resistentes a varios antibióticos lo que se conoce como
“resistencia múltiple”. Este fenómeno puede ocurrir entre organismos patógenos, entre
organismos de distintas especies e incluso entre bacterias patógenas y no patógenas (Okolo,
1986). La resistencia múltiple adquirida limita el uso de muchos antibióticos en forma
importante en especies de la familia Enterobacteriaceae tales como Escherichia coli,
Salmonella, Shigella y Proteus (Biberstein y Zee, 1994).
Lukasova y Sustackova (2003) señalan que algunos estudios han demostrado que el
nivel de resistencia ha aumentado no sólo en bacterias patógenas sino también en bacterias
comensales. Estas últimas constituyen un reservorio de genes resistentes para bacterias
patógenas y su nivel de resistencia es considerado como un buen indicador de la presión de
selección ejercida por el uso de antibiótico y de los problemas de resistencia esperados en
bacterias patógenas. El monitoreo de la prevalencia de resistencia en bacterias indicadoras
como E. coli y Enterococcus en diferentes poblaciones, animales, pacientes y humanos sanos
hace factible comparar la prevalencia de resistencia y detectar transferencias de bacterias o
genes resistentes desde animales a humanos o viceversa.
E. coli y Enterococcus son también microorganismos indicadores de la condición
microbiana censurable de los alimentos como contaminación fecal, presencia de potenciales
patógenos, así como también de las condiciones sanitarias en el procesamiento, producción o
almacenamiento de los alimentos (Banwart, 1979; Venegas y col, 1990; Doyle y col, 1997).
Sin embargo el uso actual de estos microorganismos está dirigido, con mayor frecuencia, hacia
la evaluación de la inocuidad de los alimentos a través de la cuantificación de E. coli o
Enterococcus como indicadores de la calidad sanitaria (Jay, 1992).
E. coli se caracteriza por ser un bacilo recto de 1.1-1.5 x 2.0-6.0 µm, individuales o en
pares. Móviles por flagelos perítricos o inmóviles. Su temperatura óptima es 37 °C con un
rango que va de los 15 °C a los 45 °C, el pH óptimo es de 7 tolerando grandes variaciones y
posee una actividad de agua (aw) mínima para crecer de 0.95. Es catalasa positiva, oxidasa
negativa, produce ácido y gas a partir de glucosa, lactosa y otros carbohidratos, reduce los
nitratos a nitritos y no produce H2S (Merchant y Packer, 1975; Sneath y col, 1984; Robinson y
col, 2000).
Fue aislada por primera vez por el alemán Theodor Escherich en 1885 de material fecal
de niños, mostrando una notable capacidad para colonizar a su hospedador (Robinson y col,
2000). Es el habitante universal del tracto intestinal del hombre y otros animales de sangre
caliente en donde es la bacteria anaerobia facultativa predominante, sin embargo constituye un
porcentaje pequeño del total de la microbiota (menos del 1%) (Adams y Moss, 2000;
Robinson y col, 2000). Cumple una función importante en el organismo suprimiendo el
crecimiento de bacterias dañinas y sintetizando apreciables cantidades de vitaminas. A pesar
de esto, hay tipos de E.coli capaces de producir enfermedad en el hombre (FDA, 2002).
Escherichia coli es la causa más frecuente de algunas de las infecciones bacterianas más
comunes, como la de las vías urinarias, meningitis neonatal, infecciones respiratorias y
gastroenteritis. La población de mayor riesgo la constituyen las personas jóvenes y los adultos
mayores. La prevalencia es mayor en niños menores de 5 años de edad, lo que va
disminuyendo con el tiempo, para después volver a aumentar en personas de 65 años o más
(Murray y col, 1992).
A pesar de ser una bacteria habitual del tracto intestinal, hay serogrupos que son
patógenos. Las cepas de E.coli que producen diarrea se clasifican en grupos específicos
basados en la virulencia, patogenia, signos clínicos y distintos grupos serológicos O: H. Estas
categorías son: E.coli enteropatogénico (ECEP) del cual el hombre es reservorio importante;
E.coli enterotoxigénico (ECET); E.coli enteroinvasiva (ECEI); E.coli enteroagregativa
(ECEAg); E.coli enteroadherente (ECEA) y E.coli enterohemorrágica (ECEH) (Venegas,
1990; Doyle y col, 1997).
Por muchos años se ha sabido que los rumiantes aparentemente sanos albergan
transitoriamente al patógeno humano Escherichia coli enterohemorrágico O157: H7 en sus
tractos gastrointestinales. Aunque se ha señalado al ganado bovino, ovejas, ciervos y cabras
como reservorio de este patógeno, el ganado bovino es la fuente principal de la infección en
humanos (Grauke y col, 2002). También se describen como reservorios a pavos, cerdos,
corderos, perros, gatos, caballos y experimentalmente a polluelos (Beuchat, 1996; Doyle y col,
1997; Yilmaz y col, 2000).
Escherichia coli se puede diferenciar de otras enterobacterias por test bioquímicos. Las
pruebas bioquímicas más comúnmente usadas son las conocidas como IMViC. Las reacciones
de estas pruebas son: Indol y Rojo de metilo positivo, Voges Proskauer y Citrato negativo
(Jay, 1992). Otra prueba bioquímica consiste en el uso del agar hierro tres azúcares (TSI) que
determina la fermentación de glucosa y lactosa o sacarosa, la formación de gas y H2S por
parte de bacilos Gram negativos. E. coli presenta una reacción ácida sobre ácida (fermentación
glucosa y sacarosa y/o lactosa) con formación de gas (Forbes y col, 1998).
5.3. ENTEROCOCCUS
Las especies del género Enterococcus son cocos Gram positivos, generalmente de forma
esférica u ovoide, de menos de 2 µm de diámetro. Se encuentran solos, en pares o formando
cadenas y generalmente son inmóviles. No forman endosporas, son catalasa negativos,
hidrolizan la esculina, fermentan los hidratos de carbono para producir principalmente ácido
láctico pero no gas. Sus requerimientos nutricionales son complejos y variables (Sneath y col,
1984; Jay, 1992; Robinson y col, 2000). La mayoría son anaerobias facultativas y mesófilas,
pero existen especies con rangos o características distintas. En la naturaleza son no
pigmentados y microaerofílicos. Tienen la capacidad de crecer a temperaturas que varían entre
10-45°C, en medios con 6,5% de NaCl, a un pH de 9.6 y un 40% de bilis. Sobreviven a la
temperatura de 60°C por 30 minutos, y presentan el antígeno del grupo D. Algunas bacterias
de otros grupos o géneros, cumplen con alguna de estas características, por lo tanto es
necesario una diferenciación más específica (Jay, 1992; Hardie y Whiley, 1997; Robinson y
col, 2000).
Los enterococos han sido reconocidos desde que Thiercelin, en 1899, los describió como
“enterocoque” enfatizando su origen intestinal. A pesar de esto, la taxonomía de este grupo ha
sido siempre un poco vaga. El género Streptococcus fue dividido en los años ochenta en tres
géneros distintos: Enterococcus, formado por miembros del grupo D de Lancefield,
Lactococcus y Streptococcus sensu stricto que incluye la mayoría de las especies.
Consecuentemente algunas especies fueron cambiadas de género como ocurrió con
Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus avium y Streptococcus
gallinarum, actualmente pertenecientes al género Enterococcus. Posteriormente, se realizaron
otros cambios taxonómicos y se incluyeron nuevas especies a este género, alcanzando
actualmente un total de 20 especies distribuidas en 5 grupos reconocidos del I al V (Devriese y
col, 1993; Hardie y Whiley, 1997; Robinson y col, 2000; Tyrrell y col, 2002).
El origen primario de Enterococcus spp es el fecal, ya sea del intestino del hombre o de
los animales de sangre caliente. Son prevalentes en el cuero, pelo, plumas y pezuñas de los
animales y, una vez faenados, se pueden encontrar en los equipos, manos de los trabajadores y
productos alimenticios (Banwart, 1979). La transmisión de estas bacterias puede ser por
contacto fecal-oral, el contacto con fluidos corporales de animales y contacto con superficies
contaminadas (Lukasova y Sustackova, 2003).
Especies del género Enterococcus han surgido recientemente como patógenos asociados
a infecciones nosocomiales serias en humanos y pueden ser responsables de diversas
afecciones como colecistitis, peritonitis, endocarditis, meningitis, entre otras, que son cada vez
más difíciles de tratar debido a la resistencia a antibióticos que han desarrollado (Reinert y col,
1999; García-Garrote y col, 2000).
Las cepas resistentes a los antibióticos de uso común pueden ser reducidas por medio de
la terapia con vancomicina o teicoplanina. El problema surge cuando estas cepas son también
resistentes a estos dos últimos antibióticos transformándose en un asunto de gran importancia
para la salud pública (Chingwaru y col, 2003). La resistencia a vancomicina se ha asociado al
uso intrahospitalario de glicopéptidos y otros agentes antibióticos como las cefalosporinas de
3a generación y aminoglicósidos. Sin embargo, se han aislado cepas resistentes a vancomicina
en personas sin historial de haber sido hospitalizadas o de haber recibido algún tratamiento
antibiótico y también de carne, aguas servidas y de animales domésticos y de granja
principalmente en Europa. Esto último se ve reflejado en un estudio en que se analizaron
bacterias del género Enterococcus aisladas de carne de animales distintos. En todas ellas se
presentaron cepas resistentes a vancomocina y teicoplanina principalmente en las muestras de
carne de pollo y siendo E. faecium más resistente que E. faecalis (Pavia y col, 2000).
*
SAN MARTIN, B., C. BORIE, E. GESCHE, M.A. MORALES. 2003. Monitoreo de la resistencia bacteriana
en animales de producción. FONDECYT 1030857.
6. MATERIAL Y METODOS
6.1. MATERIAL
En el período comprendido entre los meses de Mayo y Julio del año 2003 se obtuvieron
117 muestras de materia fecal de bovinos, cuyas características de procedencia se señalan en
el cuadro N° 1.
Las razas predominantes fueron Frisón Negro con un 54,7%, Frisón Rojo con un
20,5% y un 8,6% correspondió tanto a Holstein Freesian como a Hereford. El 16,2% de los
bovinos restantes no respondían a características raciales específicas. En cuanto al sexo, los
bovinos muestreados se pudieron subdividir en 64 (54,7%) machos, todos correspondientes a
la categoría de novillos y 53 (45,3%) hembras, de las cuales 10 (8,5%) correspondieron a
vacas y 43 (36,8%) a vaquillas.
1
BBL
6.2. METODOS
tórula estéril
tórula
37°C por 24 h.
35°C por 24 h
Pruebas bioquímicas:
TSI (A/A + -)
Indol (+)
Rojo de metilo (+)
Citrato (-)
2
Laboratorio Oxoid
3
Según Norma Chilena 2636 Of. 2001
6.2.2. Método de aislamiento de Enterococcus (Carter 1984b) (Figura 2)
Para el aislamiento de Enterococcus, el procedimiento inicial era igual al realizado
para E. coli sólo que la siembra era realizada en agar Enterococcosel4. La lectura de las placas
se llevaba a cabo a las 48 horas después de una incubación a 37°C. De estas placas se
seleccionaban colonias sospechosas que eran pequeñas, cóncavas, de coloración oscura y con
un halo café grisáceo correspondiente a esculina positiva. Estas se pasaban a agar Plate Count
para ser nuevamente incubadas por 24 horas. Posteriormente se realizaban pruebas
bioquímicas para la determinación de género (Enterococcus) y luego pruebas bioquímicas
para determinar la especie (E. faecalis, E. faecium, Enterococcus spp).
4
BBL
5
Según Norma Chilena 2658 Of. 2001
6
Laboratorio Merck
7
Laboratorio Difco
Muestra de materia fecal en medio Cary and Blair
tórula estéril
tórula
37°C por 48 h
37°C por 24 h.
II. Pruebas bioquímicas para determinación de especies faecalis, faecium y spp (Cuadro 2):
a. Acidificación de Glicerol en anaerobiosis
b. Acidificación de Melibiosa
c. Acidificación de Arabinosa
d. Reducción de Tetrazolium a pH 6,0
e. Tolerancia al Telurito de potasio al 0,04%
a b c d e
E. faecalis + - - + +
E. faecium - + + - -
Es importante considerar que, por el hecho que las muestras fueron tomadas en la sala de
vísceras verdes, el tiempo transcurrido entre el sacrificio del animal y la toma de muestras y de
ahí hasta el análisis en el laboratorio, haya sido el suficiente para que la bacteria no
sobreviviera, pero esto también se descarta porque son sólo algunos minutos lo que demoran
las vísceras en llegar a la sala y éstas lo hacían en perfectas condiciones y sin previa
manipulación. El traslado al laboratorio se hacía dentro de máximo una hora una vez
terminada la toma de muestras y se hacía en un medio adecuado de transporte y a temperatura
de refrigeración que permitía la mantención de la bacteria. Además, al ser E. coli una bacteria
entérica, indicadora de contaminación fecal, su tasa de muerte es algo menor y resiste por más
tiempo las condiciones extra-intestinales (Venegas y col, 1990).
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A mis padres, Ivonne y Roberto, a mis hermanos, cuñados y familia por el esfuerzo
puesto en el largo camino para llegar a esta instancia, por el enorme cariño entregado, el apoyo
y la ayuda dada.
A David Ergas por su apoyo incondicional, sus consejos, fuerza y confianza transmitidos
durante la realización de este trabajo y a través de toda la carrera.
A Dra. Erika Gesche y Mónica Saez por sus conocimientos y las oportunidades dadas,
por la gran paciencia, disposición, apoyo y fundamental ayuda.
A Rodrigo C., Claudia C., Eva B. y amigos por hacer que el trabajo realizado haya sido
más ameno y entretenido, por la compañía, preocupación y los buenos momentos compartidos.
A Bernarda, Irma y Vivi por toda la ayuda brindada, la inagotable paciencia, buena
disposición, la compañía y todos los buenos momentos.