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Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias Biologías

Laboratorio de Biología Molecular y Genética General

Profesores:

TRABAJO PRACTICO Nº5:


PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y ELECTROFORESIS EN GELES SDS-PAGE
BIO-041

Autores: Fernanda Avendaño


Alan Bastias
Alejandra Bravo

2018
Introducción

Las proteínas tienen una real importancia en nuestro organismo, ya que de ellas
dependen prácticamente todos los procesos biológicos (1). Las proteínas son las
moléculas orgánicas más abundantes en la célula, que desempeñan papeles
fundamentales en los seres vivos y constituyen más del 50% del peso seco de la célula.
Son las biomoléculas más versátiles y más diversas. En los procesos biológicos las
proteínas son el centro de acción, realizan una enorme cantidad de funciones diferentes.
Cada tipo celular, tiene un rol específico determinado por su composición proteica, el cual
está determinado por el conjunto de genes que se estén activando. Es por esta razón que
para poder analizarlos se necesita ocupar diferentes métodos para su extracción y
posterior purificación. (2)

Para poder detectar las proteínas se usa la técnica de Western blot, se somete antes a
una electroforesis SDS PAGE en el gel de poliacrilamida vertical con presencia de
detergente SDS, que separa solo en función de su tamaño molecular para luego
transferirlo a una membrana de nitrocelulosa. Finalmente, para poder detectarlas se usa
la unión específica de un anticuerpo marcado contra la proteína a estudiar (3)

El SDS en esta técnica es utilizado para la desnaturalización de las proteínas, formando


complejos proteína-SDS al asociarse a la zona hidrofóbica de esta, haciendo que todas
las proteínas por separar adquieran la misma forma, y además le otorgara la carga neta
negativa a la proteína permitiendo que estas migren todas en la misma dirección en el gel
y puedan ser separadas solo por masa molecular, y no por su forma y carga. (4)

Para realizar la electroforesis SDS- PAGE en el práctico se debe extracto que contenga el
componente requerido en forma soluble, para su separación en el gel, para esto se realiza
la homogenización. Esta técnica consiste en el disgregar el tejido animal, que en este
caso es hígado de rata, provocando el rompimiento masivo de sus células lo que produce
la liberación de sus componentes intracelulares. Luego sigue una serie de
centrifugaciones con la finalidad de eliminar los contaminantes de la muestra
(sobrenadante) y así obtener las proteínas nucleares purificadas (pellet);se purificó
proteínas nucleares de hígado de rata las cuales posteriormente fueron visibles, a través,
de bandas en el gel previamente teñido con un colorante específico (azul de comassie), el
cual hace posible evidenciar las bandas que contienen las distintas proteínas.(5)

Objetivos

• Aislar proteínas nucleares del hígado de rata mediante procesos continuos de


homogenización y centrifugación.

• Separar en una electroforesis SDS-PAGE las proteínas nucleares encontradas en


el pellet obteniendo un bandeo característico.

• Visualizar dicho bandeo mediante un proceso de tinción y distinción del gel


acrilamida- bisacrilamida.
Materiales y métodos

Para realizar este experimento primero con un homogeneizador (Ultra turrax), el hígado
de pollo y una solución del buffer de homogenización (Cloruro de sodio) se procedió a
homogeneizar la muestra, posterior a esto se procedió a visualizar al microscopio el
homogenizado a 40x para comprobar si fue realizado de forma adecuada, se tomo una
gota del homogenizado y una gota de azul de tripán el cual marca las células muertas.

Posteriormente se procedió a filtrar el homogenizado con una gasa para que así cualquier
resto de mayor tamaño esté completamente fuera de nuestra solución. Luego de esto se
sacaron 5 ml de la muestra homogeneizada y se depositó en un tubo limpio, se le agregó
además 3 ml de la solución buffer de homogenización y se llevó a centrifugar por 10
minutos a 1.300 rpm a temperatura ambiente. Paralelamente y mientras los tubos se
encontraba en centrifugación un grupo procedió a preparar las muestras para la creación
del gel, se comenzó con la preparación del gel separador, para ello en un tubo se
agregaron 3.3 ml de H2O, 4.0 ml de Acrilamida-bisacrilamida (30%), 2.5 ml de Tri-HCl 1,5
M pH 8.8, 100 l de SDS 10%, 100 l de PSA 10% y finalmente se agregó 10 l Temed el
cual ayuda en la polimerización. Posterior a esto se comenzó a realizar la preparación del
gel espaciador, para el cual en un tubo se le agregaron 4.1 ml de H2O, 1 ml de Acrilamida-
bisacrilamida (30%), 750 l de Tri-HCl 1 M pH 6.8, 60 l de SDS 10%, 60 l de PSA 10%
y finalmente se agregó 10 l Temed. Con estas soluciones ya preparadas se sacaron las
muestras de la centrífuga y se procedió a sacar completamente el sobrenadante el cual
corresponde a la fracción citoplasmática, se tomaron 10 l de este sobrenadante y más 10
l de azul de tripán se puso en un portaobjeto para ser observado al microscopio (10x y
40x) en busca de diferencias con nuestro homogenizado antes de la centrifugación,
cuando ya se le sacó todo y quedó solo el pellet que contiene la fracción nuclear se
resuspendio en un tubo eppendorf con cloruro de sodio el cual también fue observado al
microscopio.
A la muestra resuspendida del pellet se le sacó 10 l y se agregó en un tubo de
eppendorf, luego a este tubo se le agregó 10 l del buffer de carga y se calentó la muestra
a 100ºC por 10 minutos. Pasado este tiempo se sacaron y se les hizo un pequeño spin en
la centrifugadora. Posterior a este spin se sacaron y se procedieron a cargar las muestras
en el gel.

Pasado el tiempo en que se dejó correr el gel se procedió a teñirlo con el buffer de carga
de proteínas (Metanol 50%, Ac acético glacial 10%, azul de coomasie 0,25% y agua 40%)
calentando el gel con la tinción y agitando posteriormente 15 minutos, luego se llevó a
cabo el desteñido del con una solución de desteñido de proteínas (Metanol 50%, Ac
acético 10% y agua 60%) siguiendo el mismo procedimiento que al teñirlo.
Finalmente se vieron los resultados obtenidos.

Resultados

Figura 1. Homogenizado del hígado


de rata con azul de tripán.10x.

Figura 2. Aumento del


homogenizado con azul de
tripán.40x
Figura 3. Fracción molecular
(pellet) resuspendido con 100
um de Cloruro de sodio.
Aumento 40x.

Figura 4. SDS-PAGE, electroforesis de proteínas con marcadores de peso molecular.


Estándar 1: Precision plus kaleidoscope. Estándar 2: Marcador de proteínas rango amplio.
Figura 5. Gel de poliacrilamida teñido con azul de coomasie. Con esta tinción se
puede observar la migración de proteínas.
Discusión

Analizando los resultados obtenido podemos en primera instancia ver la comparación de


la figura 2 con la figura numero 3 y decir que la separación entre la porción citoplasmática
y la porción nuclear fue llevada a cabo de forma prolija lo cual beneficia enormemente a
una correcta obtención de la proteína nuclear nucleolina que nos interesa.
Luego en la figura numero 5 podemos observar el resultado de nuestro gel de
poliacrilamida tenido con azul de coomassie en el cual se logran distinguir las bandas de
los marcadores de peso molecular pero no se pueden apreciar de buena manera las
bandas cargadas por los distintos grupos, pero ¿a qué se debe? El azul de coomassie es
un marcador de proteínas el cual se une por interacciones débiles a estas y la unión tinte-
proteína es reversible pero también para una correcta visualización de las bandas en el
gel este debe ser lavado entre 2 y 3 veces posterior a su tinción y en nuestro caso por
escases de tiempo solo se lavo una vez lo cual vuelve compleja la interpretación en el gel.
(6)
El objetivo final del practico consistía en la detección de la presencia de una fosfoproteína
nuclear eucariótica llamada nucleína la cual esta vez proviene de un hígado de pollo. Esta
proteína pesa aproximadamente 76,614 Dalton (7) por lo cual en nuestro gel y por los
marcadores utilizados deberíamos ser capaces de observar una banda entre los 70 kDa y
los 93 kDa pero por la dificultad de observación en el gel no se puede distinguir la
presencia o ausencia de esta banda. Otra forma con la cual se pudo haber comprobado
de forma mas especifica si esta proteína se encuentra es con la técnica de western blot la
cual estaba dentro del procedimiento del practico, pero a causa de la gran cantidad de
horas que toma esta técnica no se llevó a cabo.
Conclusión

Finalizado el practico se puede concluir que si bien se siguieron los protocolos


establecidos en la guía y se aprendió la técnica de homogenización para la
purificación de las proteínas y la electroforesis SDS-PAGE, los resultados fueron
visibles, pero no en buena calidad, lo que deja en evidencia que el trayecto del
practico pudo haber sucedido algo no presupuestado que haya repercutido en el
rendimiento de la técnica electroforética.
Bibliografía

(1) http://proteinas.org.es/funciones-de-las-proteinas

Fecha de ingreso: 04/05/2018

(2) Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt. “Fundamentos de Bioquímica: la vida
a nivel molecular” (2007). Editorial Medica Panamericana, 2° edición. Madrid. Página 95

(3) Ángel Biología molecular e ingeniería genética. (2012). Elsevier, 2º edición, España.
Pp.178.

(4) Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Jonhson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter,
P. “introducción a la biología celular” (2006). Editorial Médica Panamericana. 2° edición.
Buenos Aires. Página 163

(5) Universidad Andrés Bello. Guía de Laboratorio Nº5: Purificación de Proteínas y


Electroforesis en Geles SDS-PAGE, curso BIO-041. Laboratorio de Biología Molecular y
Genética, 2018.

(6)
http://www.academia.edu/12280062/Fundamento_de_la_tinci%C3%B3n_con_Azul_de_C
oomassie_y_con_plata

Fecha de ingreso: 06/05/2018

(7) http://www.uniprot.org/uniprot/P19338

Fecha de ingreso: 06/05/2018