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ACRILAMIDAS

ANTECEDENTES

1. La acrilamida fue evaluada en 1994 por la Agencia Internacional de Investigación del


Cáncer (IARC) y debido a los resultados de experimentación con animales fue
clasificada como probable carcinógeno en humanos (Grupo 2A) debido a que la
acrilamida es biotransformada en el metabolito glicidamida con actividad genotóxica
(IARC, 1994) con especial afinidad por el sistema nervioso. Y por la Agencia
Estadounidense de Protección Medioambiental (EPA) en la categoría B2, ambas
sustancias definidas como “probablemente carcinogénica en humanos”

2. El Comité del Codex sobre Aditivos Alimentarios y Contaminantes de los


Alimentos (CCFAC), en su 35ª reunión, acordó que un grupo de redacción
dirigido por el Reino Unido y los Estados Unidos de América, con la ayuda de
Australia, Irlanda, Japón, Suiza, la Comisión Europea, el International Nut
Council y la Organización Mundial de la Salud, preparara un documento de
debate sobre la acrilamida con el fin de distribuirlo, recabar observaciones y
someterlo de nuevo a examen en su 36º período de sesiones.

3. El Comité tomó nota de las dificultades que habían encontrado los países para la
determinación y cuantificación de la acrilamida y otros contaminantes. Debería
prestarse especial atención a los niños, habida cuenta de que eran el grupo de la
población que más consumía algunos de los alimentos relacionados con la
exposición a la acrilamida. El Comité también destacó que se necesitaba la
ayuda de la FAO y de la OMS para reforzar la creación de capacidad en este
ámbito, particularmente en los países en desarrollo.

4. El CCFAC, en su 35ª reunión de sesiones, también incluyó la acrilamida en su


lista de sustancias prioritarias para la evaluación de riesgos por parte del Comité
Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA). Las
Secretarías conjuntas tenían previsto evaluar la acrilamida en la 65ª reunión del
JECFA, en febrero de 2005.

I. OBJETIVO GENERAL

II. OBJETIVOS ESPECIFICOS

III. FUNDAMENTO TEORICO


La acrilamida (2-propenamida) (figura 1) es un producto químico de amplio uso
en la industria (se utiliza en la síntesis de poliacrilamidas), del cual se conocen
varias características físico-químicas (tabla 1). Se presenta como un polvo
blanco cristalino soluble en agua, etanol, metanol, dimetiléter y acetona; no es
soluble en heptano ni benceno. Se polimeriza rápidamente al alcanzar el punto
de fusión o al ser expuesto a la luz ultravioleta. La acrilamida sólida es estable a
temperatura ambiente, pero puede polimerizarse violentamente cuando se
mezcla o expone a agentes oxidantes. La acrilamida se emplea
fundamentalmente en el tratamiento del agua potable, en el procesado de la
pulpa de papel y también para retirar sólidos en suspensión de las aguas
residuales de la industria antes de ser eliminados o para su eventual
reutilización. Sin embargo, existe un gran número de otras posibles aplicaciones,
como aditivo en cosméticos, acondicionador de suelos, procesado de minerales y
en la formulación de agentes selladores para diques, túneles, represas y
alcantarillados.

FIGURA 1: Estructura química de la acrilamida

CUADRO 1: Características fisicoquímicas en las acrilamidas

NOMBRE QUIMICO 2- propenamida


SINONIMO Etilen carboxamida;amida acrílica;vinil
amida
PESO MOLECULAR 71.09
FORMULA QUIMICA CH2CHCONH2
PUNTO DE EBULLICION 125°C
PUNTO DE FUSION 87.5°C
PRESION DE VAPOR 1.6 mm Hg a 85°c
PUNTO DE INFLAMABILIDAD 138°c
SOLUBILIDAD EN AGUA Miscible
ASPECTO Solido
OLOR Inodoro
PH 5.5 – 7.5

MECANISMO DE LA FORMACIÓN DE LA ACRILAMIDA.

Las acrilamidas se forman cuando los alimentos son sometidos a temperaturas superiores de
120ºC, aumentando con el tiempo de calentamiento y el corte del producto Aunque la
concentración máxima de acrilamidas se da después de ocho minutos, la concentración tiende
a disminuir espontáneamente, sugiriendo una degradación por el calor. La formación de
acrilamidas en los alimentos fritos depende de no solo del tipo de aceite utilizado, sino
también de la presencia del aminoácido asparagina y glucosa en el mismo alimento (

Durante el calentamiento de los alimentos, los azúcares reductores reaccionan con


aminoácidos iniciando una cascada de eventos químicos que conducen al pardeamiento
de alimentos, conocido como la reacción de Maillard.

Se sabe que este proceso genera compuestos reactivos como monocarbonilos y


dicarbonilos los cuales son los responsables de la reacción de pardeamiento.

Para entender mejor el mecanismo de formación de la acrilamida desde la asparragina,


se investigó la capacidad de otros compuestos carbonilos, para generar acrilamida en un
sistema modelo de papas snack (Zyazak et. al. 2003)

Se encontró que una gran variedad de fuentes de carbonilos, podían generar acrilamida
de la asparagina bajo calor. Mientras la cadena del azúcar es más corta, la molécula se
tensiona, para formar una estructura cíclica hemiacetal y posteriormente el carbonilo
llega a estar más fácilmente disponible para el ataque nucleofílico alfa-amino de la
asparagina. Así, las cadenas más cortas de azúcares llegan a ser más reactivas. En base
de los resultados de la sustitución por isótopo y los estudios de carbonilos descritos
arriba, se propone el mecanismo exhibido en la figura 2. El grupo libre alfa-amino de la
asparagina reacciona con un azúcar fuente de grupo carbonilo, formando una base de
Schiff. Bajo calor, la base Schiff se descarboxila (facilitado por la descolocación de la
carga negativa, que permite la formación de la base de Schiff), formando un producto
que puede reaccionar por dos vías. Se puede hidrolizar para formar 3-
aminopropionamida que se puede degradar más aún, vía la eliminación del amoníaco
para formar la acrilamida cuando se somete a calor.

Alternativamente, la base descarboxilada de Schiff puede descomponerse directamente


para formar acrilamida vía la eliminación de una imina (Zyazak et. al. 2003). Los
factores más importantes que determinan la cinética de formación de acrilamida y su
posterior degradación son la composición de las papas y las variables de proceso. La
papa aporta los precursores en una concentración dependiente de su variedad, de las
condiciones del suelo, del periodo de cosecha y de las condiciones de almacenamiento
postcosecha (Low et al., 2006).

Exposición dietaría y niveles de acrilamida en los alimentos


Después de los primeros hallazgos de acrilamida en alimentos cocinados de alto
contenido de almidón como son las papas fritas, las investigaciones se centraron en
buscar acrilamida en otro tipo de alimentos. Los resultados de estos estudios
establecieron que la acrilamida se producía en distintos alimentos de acuerdo a su
origen y composición y al modo de preparación. Dentro de éstos destacan el pan, pastas,
arroz, salsas, carnes, galletas, cereales, cerveza, pizza y productos a base de papas, maíz
y harina. Se ha reportado una concentración promedio de acrilamida en papas horneadas
de 1000 µg/kg y en papas fritas de 500 µg/kg. Otro grupo de alimentos que produce
niveles importantes de acrilamida son los derivados de cereales, galletas y palomitas de
maíz.

La acrilamida se forma probablemente en muchos alimentos, pero no todos han sido


estudiados. La cantidad a la que el consumidor está expuesto está relacionada con los
niveles presentes en el alimento y la cantidad de alimento consumida. Los alimentos
que no son fritos no contienen cantidades apreciables de acrilamida (crudos o cocidos
en agua). En un estudio en el que participaron 1200 personas entre 17-70 años se
registró el consumo de alimentos por una semana y se estimó una exposición a
acrilamida de 25 µg/día (siendo la ingesta máxima seis veces mayor). Dentro de los
alimentos que contribuían a estos niveles de exposición destacaban los productos de la
papa con un 36%, pan 16%, galletas 5%, cereales 3% y otros con un 40%. Un tema
interesante de abordar es el que tiene relación con los niveles de exposición a acrilamida
en los alimentos de acuerdo a la edad del individuo; aunque aún no se ha podido
establecer una diferencia etárea significativa. En la tabla 2 se muestra los niveles de
acrilamida promedio en distintos alimentos obtenidos por grupos de investigadores
noruegos, suecos, suizos, ingleses y norteamericanos. Otras investigaciones han
reportado formación de acrilamida en alimentos preparados en el hogar (17-18)
Mecanismos de formación de la acrilamida en los alimentos
Poco después del descubrimiento de acrilamida en ciertos alimentos cocinados,
investigadores de distintas universidades, industrias y laboratorios oficiales comenzaron
una serie de estudios con el objeto de comprender el origen de la producción de
acrilamida en los alimentos. Al inicio de las investigaciones se plantearon varias
hipótesis sobre las posibles vías de formación, enfocándose inicialmente en vegetales,
grasas y aceites, abarcando principalmente a los alimentos ricos en carbohidratos
cocinados (hervidos o fritos)

Importancia de la asparragina y la reacción de Maillard

Las primeras evidencias concretas sobre el origen de la acrilamida en los alimentos que
involucraban a la asparragina se publicaron en el año 2002 por varios grupos de
investigadores, que trabajaron de forma independiente en los Estados Unidos, Canadá,
Suecia, Alemania e Inglaterra. Utilizando asparragina marcada con nitrógeno
radioactivo y posterior detección por espectometría de masa, se demostró que los tres
carbonos del esqueleto y la amida que forman la acrilamida corresponden a la molécula
de asparragina. En la figura 2 se ilustra un esquema simplificado con las moléculas
iniciales y los precursores que se han propuesto para la formación de acrilamida en los
alimentos.
Se encontró que a altas temperaturas, la decarboxilación y deaminación de la
asparragina producía acrilamida. Sin embargo, otros estudios no detectaron formación
de acrilamida al someter asparragina por sí sola a altas temperaturas. Finalmente, se
estableció que la formación de acrilamida requería la presencia de azúcares reductores y
temperaturas sobre 100 ºC. Esto llevó a la conclusión de que la formación de acrilamida
está íntimamente ligada a la bien conocida reacción de Maillard.
EFECTOS
TOXICOLOGÍA
Se ha demostrado que la acrilamida causa tumores en los animales de experimentación,
y el Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer (CIIC) la ha clasificado
como “probablemente cancerígena para el hombre”. La acrilamida produce mutaciones
genéticas y alteraciones cromosómicas en células cultivadas in vitro. También ha dado
resultados positivos en estudios de genotoxicidad in vivo. Se sabe que como
consecuencia de la acción metabólica da lugar a glicidamida, un epóxido químicamente
reactivo que origina aductos de ADN y puede ser la sustancia directamente genotóxica.
En estudios a largo plazo realizados con ratas se puso de manifiesto un aumento
dependiente de la dosis en la frecuencia de tumores de las glándulas mamarias y tiroidea,
de la boca y del aparato reproductor, así como ciertos indicios de tumores cerebrales
Asimismo, en las pruebas de detección realizadas con ratones, se ha demostrado la
existencia de una acción cancerígena. La consulta FAO/OMS también examinó en
detalle las propiedades tóxicas de la acrilamida y llegó a la conclusión de que era
necesario realizar más estudios sobre diferentes aspectos relacionados con la toxicidad
de esta última. En el Anexo 1 se resumen los datos de toxicidad de la acrilamida.
En 1991, el Comité Científico de los Alimentos (CCA) de la Unión Europea (UE)
evaluó la acrilamida como monómero presente en materiales que entraban en contacto
con los alimentos, y llegó a la conclusión de que se trataba de una sustancia cancerígena
con acción genotóxica. Tras los resultados obtenidos en 2002 en relación con la
acrilamida de los alimentos, el CCA llevó a cabo una nueva evaluación de dicha
sustancia y mantuvo la conclusión de que la acrilamida era una sustancia cancerígena de
acción genotóxica, pero señaló que, en ese momento, no era posible determinar el riesgo
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real de la presencia de acrilamida en los alimentos . El CCA llegó a la conclusión de
que debería reducirse la exposición tanto como fuera posible y razonable, aunque era
necesario recabar más datos en distintos ámbitos para poder reducir los niveles de
acrilamida y ayudar a aclarar sus efectos tóxicos. Además, el CCA destacó que la
acrilamida era neurotóxica para los animales de experimentación y para las personas
expuestas a la sustancia en sus lugares de trabajo. En los estudios realizados con ratas y
ratones, se habrá demostrado que la acrilamida disminuyía la fertilidad en los machos,
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aunque no estaba claro si dicho efecto se debía a la acción neurotóxica . No obstante,
basándose en los datos disponibles, el SCF señaló que las cantidades de acrilamida
ingeridas en la alimentación probablemente eran muy inferiores a las concentraciones
con efectos neurotóxicos.

EXPOSICIÓN Y RIESGO (EN EL SER HUMANO)


Exposición alimentaria
Desde la primera comunicación sobre el contenido de acrilamida en los alimentos, se ha
descrito una gama de concentraciones en distintos alimentos y productos alimenticios.
En el Cuadro 1 se ofrece un resumen de los resultados específicos obtenidos hasta el
momento de los análisis de acrilamida en los alimentos. En algunos de estos grupos de
productos el número de análisis realizados ha sido escaso. Se han observado diferencias
significativas en las concentraciones de acrilamida dentro de las categorías específicas
de alimentos y de lotes de productos elaborados en las mismas condiciones
Otras vías propuestas para la formación de acrilamida en los alimentos
Algunas investigaciones han descrito un importante rol de la acroleína en la formación
de acrilamida, particularmente en los alimentos ricos en lípidos. La acrilamida puede
formarse a partir de la acroleína o del ácido acrílico. Se ha descrito en la literatura varias
rutas para la formación de acroleína, incluso múltiples procesos oxidativos asociados a
la degradación térmica de triacilglicéridos, glicerol, carbohidratos, aminoácidos o
productos de la reacción de Maillard. La acroleína puede aportar a la reacción su
carbonilo funcional y en la presencia de asparragina libre puede generar apreciables
concentraciones de acrilamida. Una ruta más directa es la reacción de la acroleína con el
amoníaco, seguido por la oxidación del hidróxido de amonio que es intermediario en la
formación de la acrilamida. Todo esto aún requiere de más estudios, especialmente la
oxidación de la acroleína y el acido acrílico.

Posibles estrategias para mitigar la formación de acrilamida en los alimentos


FIGURA 3: Moléculas iniciales y precursoras propuestas para la formación de
acrilamida en los alimentos

Una vez confirmados los resultados arrojados por el estudio sueco, los investigadores se
focalizaron en encontrar estrategias para mitigar la formación de acrilamida en los
alimentos. Los resultados de estas investigaciones permitieron establecer dos líneas
principales de acción destinadas a reducir la formación de acrilamida en los alimentos.
Estas acciones se enfocan en: - controlar la influencia de la concentración de
precursores y - controlar las temperaturas de cocción.

A. Influencia de la concentración de precursores.

Como se ha señalado, la formación de acrilamida depende de la presencia de


algunos aminoácidos (principalmente la asparragina) y azúcares reductores en
los alimentos. En consecuencia, se ha descrito que la concentración de estos
precursores podría afectar la formación de acrilamida lo que implica que si se
logra controlar la concentración de estos precursores se reduciría la formación
de acrilamida en los alimentos. Debido a que elevados niveles de asparragina
aumentan la formación de acrilamida en los alimentos porque interactúan con
los azúcares reductores, se ha sugerido el uso de asparraginasa para interrumpir
la interacción de la asparragina con los azúcares reductores. El problema que
surge es que la asparragina es un aminoácido que cumple un rol importante en el
alimento, por ejemplo en la papa, por lo cual usar asparraginasa no sería
recomendable.

La disminución de azúcares reductores en los alimentos también puede


contribuir a evitar la formación de acrilamida. Existen medidas alternativas
como es la de seleccionar variedades de alimentos con una concentración menor
de azúcares reductores (no superior a 1g /kg de alimento). Blanquear o remojar
los alimentos también puede contribuir a reducir los niveles de azúcares
reductores; un ejemplo es el pre-blanqueo en agua tibia o caliente de las papas
cortadas, o sumergirlas en agua a temperatura ambiente antes de freír o asar.
Una disminución del pH utilizando ácido cítrico (0.5 - 1% por un período menor
que 20 minutos) reduce la cantidad de acrilamida formada. El almacenamiento
de las papas a temperaturas menores a 8 ºC causa un aumento de los niveles de
azúcares reductores, por lo que no es recomendable almacenar las papas a
temperaturas tan bajas. El tipo de aceite utilizado no influye significativamente
en la formación de acrilamida. El uso de microondas antes de la cocción
aumenta la formación de acrilamida debido a la disminución de la humedad. El
contenido de azúcares reductores también depende de factores estacionales,
condiciones de cultivo y almacenamiento.

B. Influencia de las temperaturas de cocción.

Una causa importante en la formación de acrilamida es la temperatura de


cocción; la formación de acrilamida es creciente a medida que aumenta la
temperatura (11).

Temperaturas y regímenes de cocción sobre los 175 ºC aumentan


significativamente la formación de acrilamida, por lo que se sugiere no
sobrepasar los 120 ºC. La presencia de acrilamida es fácilmente detectable
cuando un aminoácido precursor en presencia de glucosa procedente de almidón
se somete a una temperatura superior a 175 ºC, especialmente cuando la
temperatura sobrepasa los 200 ºC. Por el contrario, a temperaturas bajo 120 ºC
no se detecta acrilamida. La disminución del tiempo de cocción también reduce
la formación de acrilamida; se evita el ennegrecimiento. Los principales
alimentos en los que aumentan los niveles de acrilamida como consecuencia del
ennegrecimiento por la cocción son papas, cereales y café.

El café es otro producto en el cual se ha detectado la presencia de acrilamida,


por lo cual el desarrollo de estrategias para disminuir su formación adquiere
importancia considerando que el elevado consumo de café puede contribuir a
aumentar los niveles de exposición (26-30). La acrilamida se forma durante el
proceso de tostado del café y sus niveles pueden variar dependiendo de las
diferentes variedades de café utilizadas. Esto dificulta la identificación de un
método para optimizar el tostado, y así desminuir la formación de acrilamida.
No hay estudios que permitan bajar los niveles de acrilamida formados y se
sugiere el tostado por convección, aunque no está claro si es posible utilizarlo.
No se dispone aún de tecnología adecuada para disminuir los niveles de azúcares
reductores en el café.

CONCLUSIONES

Los antecedentes expuestos permiten concluir que en cierto tipo de alimentos se


puede formar acrilamida, especialmente aquellos ricos en azúcares reductores
sometidos a un sistema de cocción a elevadas temperaturas. Si bien los
resultados de estudios in vivo e in vitro han demostrado que la exposición a
acrilamida puede producir efectos cancerígenos y alteraciones en el sistema
reproductivo, nervioso y genético, aún no es posible establecer una asociación
directa entre la presencia de acrilamida en los alimentos y un riesgo para la
salud. No obstante, se recomienda tomar medidas, algunas de las cuales son
bastante simples, para reducir su producción. El desafío actual consiste
principalmente en mejorar la sensibilidad de los métodos de detección y llegar a
establecer el real daño que la exposición a la acrilamida puede producir en la
salud de la población.

PARTE EXPERIMENTAL
MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAR ACRILAMIDAS
Se han utilizado varios métodos analíticos para la determinación cuantitativa de la
acrilamida en los alimentos. Los más habituales son:
 La cromatografía de gases/espectrometría de masas (derivado), (CG-EM
(derivado))
 La cromatografía de gases-espectrometría de masas (no derivado) CG-EM (no
derivado).
 La cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM).
 La cromatografía de líquidos de alto rendimiento/espectrometría de masas en
tándem (HPLC-EM/EM).

MATERIALES Y METODOS
Materia prima
La variedad escogida para el desarrollo del estudio fue la Frisia, siendo ésta una
variedad óptima para fritura. Se trata de una variedad semitemprana a semitardía, de
piel amarilla y carne blanca-amarillenta y forma ovalada. Puesto que el trabajo
experimental se prolongó durante 6 meses se trabajó con patata con un contenido bajo y
alto de azúcares reductores.

Acondicionamiento de la materia prima


Las patatas se laminaron con ayuda de una corta fiambres hasta un espesor de 0,7 mm.
Posteriormente, se obtuvieron cilindros de patata con un sacabocados, cuyo diámetro
fue de 2,5 cm.

METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Aplicación de un pre tratamiento

Los cilindros de patata se sometieron a los distintos tratamientos previamente a la


fritura. Concretamente, las muestras se sometieron a:

 Congelación a -18 ºC durante 24h.


 Escaldado a 85 ºC durante 5 minutos o inmersión de las muestras en
disoluciones de diferentes agentes químicos:

 Ácido cítrico (Merck (Darmstadt, Germany).


 glicina (VWR, Fontenay-sous-Bois, France),
 lactato cálcico (Scharlan, Barcelona, Spain).
 cloruro sódico (sal fina de 5 mesa, Consum)
 ácido nicotínico (Merck, Darmstadt, Germany) al 1 y 2% a temperatura
ambiente durante 60 minutos.

Así mismo, se realizó un control consistente en la inmersión de las muestras en agua a


Tª ambiente durante 60 minutos. La relación muestra /disolución fue en todos los casos
de 1/5 (p/v). Una vez se extraen del pretratamiento correspondiente se retira el exceso
de agua con papel absorbente durante 2 minutos para someter las muestras a
continuación, a la etapa de fritura.

Etapa de fritura

La fritura se lleva a cabo a 180 ºC en una freidora por inmersión en aceite de 2L de


capacidad , volumen de aceite utilizado para la fritura. El aceite se calentará hasta la
temperatura indicada por contacto de éste con el serpentín situado en el fondo. Una vez
el aceite alcanzó la temperatura de fritura, lo cual vino indicado por el encendido de un
dispositivo luminoso, se llevaron a cabo los experimentos de fritura en patatas fritas
sometidos a los pretratamientos anteriormente descritos así como el patata sin pretratar.
El aceite de fritura se cambió cada 2 experimentos.

La toma de muestras se llevó a cabo a diferentes tiempos de fritura en función de las


determinaciones analíticas de color, contenido en azúcares reductores y acrilamida, y
han sido especificados en cada uno de los apartados concernientes.

Selección del tiempo óptimo de fritura

El tiempo óptimo de fritura se seleccionó únicamente en los experimentos llevados a


cabo con las patatas que presentaban un contenido medio-alto de azúcares reductores,
puesto que éstas fueron las utilizadas para realizar posteriormente las determinaciones
de acrilamida y de azúcares reductores. La selección del tiempo óptimo se llevó a cabo
en función de las características colorimétricas de las muestras a un tiempo dado de
fritura. Se considera que las patatas fritas presentan una tonalidad óptima (color) cuando
el parámetro a* presenta valores comprendidos entre 0 y -5 y b* superiores a 10
(Krokida et al., 2001). El tiempo seleccionado fue el mismo por tanto, para los
experimentos llevados a cabo, con independencia del pretratamiento aplicado a las
muestras, y poder así comparar los resultados.

DETERMINACIONES ANALÍTICAS

Tanto el contenido en azúcares reductores como en acrilamida se analizaron por


triplicado en patata cruda y tras el pretratamiento. Además el contenido en acrilamida se
determinó al tiempo óptimo de fritura (4 min.) y al doble del tiempo óptimo de fritura (8
min.) con el fin de analizar el efecto de un tiempo superior al óptimo.

Determinación de azúcares reductores

El estudio del contenido de azúcares reductores se determinó mediante un método


espectrofotométrico (modelo V-630; Jasco Inc., Tokyo (Japan). Esta técnica de oxido-
reducción se basa en la capacidad de estos azúcares en reducir el ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas condiciones. La reducción del DNS produce
una coloración más intensa cuanto mayor es la concentración de azúcares reductores. La
coloración se evidencia con la medida de la absorbancia en el espectrofotómetro. El
protocolo analítico seguido fue obtenido a partir de un procedimiento específico de
azúcares reductores (Ruiz y Ortiz, 2008):
 Preparación de la disolución de ácido dinitrosalicílico: Dilución de 4,8 g de
NaOH (Scharlan, Barcelona, Spain) en 60 mL de agua destilada.
 Se adicionan 3 g de ácido dinitrosalicílico (Panreac, Barcelona, Spain) y 150 mL
de agua destilada.
 Se diluye y añade 90 g de Sal de Rochelle (L(+) Tartrato de potasio-sodio
tetrahidrato, VWR, Fontenay-sous-Bois, France) y se enrasa a 300 Ml.
 Desestructuración de la muestras de patata (cruda, pretratada o frita). Se
pesan 0,3 g en un tubo de ensayo y diluye con 1 mL de agua destilada. Se
adicionan 2 mL de la disolución de ácido dinitrosalicílico. También se prepara el
blanco al cual contiene 1mL de agua destilada y 2 mL de la disolución de ácido
dinitrosalicílico.
 Se someten las muestras y el blanco al baño maría durante 5 minutos.
 Se enfrían bajo agua fría durante 2 minutos agitando y 10 minutos en reposo.
 Se diluyen las muestras y el blanco cogiendo 1mL y diluyendo en 5mL de agua
destilada.
 Se mide la longitud de onda a 546 nm. La cuantificación de azúcares reductores
se calcula partir de la fórmula siguiente (ecuación 1):

%Azúcares reductores = (Absorbancia - 0.00385) x 1.07893

DETERMINACIÓN DE ACRILAMIDA

La determinación del contenido en acrilamida se llevó a cabo usando el método de


extracción en fase sólida dispersiva denominado QuEChERS según una nota de
aplicación de Agilent Technologies (Al-Tasher, F., 2011) con algunas modificaciones.

Este método consiste en 2 fases:

 Una primera dispersiva cuya composición es: 4 g de MgSO4 y 0.5g de NaCl


(Queehers1).
 Seguida de una fase de limpieza y purificación de la muestra: 50 mg de PSA y
150 mg de MgSO4 (Quecehers2).

Reactivos y Solución Estándar

El estándar de acrilamida (≥99%) se obtuvo en Merck (Darmstadt, Germany). El cloruro


de sodio PA se adquirió en Scharlab (Barcelona, Spain). Acetonitrilo (calidad HPLC),
ácido fórmico (pureza de 99-100%) y sulfato de magnesio(MgSO4) seco PA, fueron
adquiridos en VWR (Fontenay-sous-Bois, France). El hexano (calidad UV-IR-HPLC)
fue de Panreac (Barcelona, Spain). El PSA se obtuvo en Supelco ( Bellefonte, PA). El
agua bidestilada se preparó para su uso cromatográfico (Milli-Q, Millipore Corp.,
Bedford, MA).

 Para la preparación de la solución de stock se pesaron 100 mg de acrilamida y se


disolvieron en acetonitrilo hasta un volumen final de 100 mL. A partir de ésta se
elaboraron disoluciones de trabajo de 1 y 10 µg/mL. Toda ellas fueron
almacenadas a 4ºC.

Extracción de la muestra

El proceso que se aplicó para la extracción de la acrilamida fue el siguiente:

 Se pesaron 2 g de patata en un tubo Falcon de 50mL, se le añadieron, con la


finalidad de eliminar la grasa de la muestra, 5 mL de n-hexano y se agitó en el
vortex durante 30 segundos.
 A continuación, se añadieron 10 mL de agua bidestilada, 10 mL de acetonitrilo y
el contenido del QuEChERS 1. Se agitó de nuevo en el vortex durante un
minuto. Después se centrifugó el tubo a 3500 rpm durante 5 minutos, la fase de
hexano (fase superior) se descartó y se recogió una alícuota de 1mL de la fase de
acetonitrilo, donde queda retenida la acrilamida. Ésta se transfirió a un
eppendorf de 2 mL que contenía el QuEChERS 2 y se agitó durante 30
segundos. Posteriormente se centrifugó a 5000 rpm durante 1 minuto y
finalmente, 500µL del sobrenadante se transfirió a un vial para su posterior
análisis por LC/MS/MS.

Análisis HPLC/MS-MS.

El análisis cromatográfico se realizó utilizando un cromatógrafo 1200 Series (Agilent


Technologies, Inc., CA; USA) acoplado a un espectrómetro de masas 6410 TripleQuad
LC/MS de Agilent (Agilent Technologies Inc., CA; USA), con fuente de ionización tipo
Electrospray, en modo positivo. La columna usada en el presente estudio fue una
Zorbax Eclipse XDB C-18 (2.1mmx50mm, 1.8µm). El gradiente de elución fue el
siguiente: inicialmente la composición fue de 0% de fase B (disolución de ácido
fórmico al 0,1%) y 100% de fase A (agua bidestilada), hasta el minuto 4. A partir del
minuto 4.10 un 30% de fase B hasta el minuto 6 y en el minuto 6:10 se ajusta al valor
inicial: 0% de fase B. La temperatura del horno de columna se mantuvo constante a 30
ºC. El flujo empleado fue de 0.2mL/minuto, y un volumen de inyección de 10 µL. Las
condiciones usadas en la fuente de ionización fueron: Tª del gas de secado (N2) de
350ºC a 12L/min, presión del nebulizador de 40 psi y voltaje del capilar de 4000
voltios.

Validación del método

Tal como exige la Directiva 96/23/CE, en cuanto al funcionamiento de los métodos


analíticos, se realizó una validación del método con el fin de garantizar la fiabilidad a
los resultados.

Los parámetros que se tuvieron en cuenta para la validación fueron:

 Linealidad
La linealidad del método (R2 ) se estudió mediante la fortificación de la matriz,
cruda y frita (patata escaldada 85ºC, 5min y posteriormente frita en aceite
durante 4 min), estudiando 4 niveles (0, 10, 20 y 50 µg/kg) para la matriz cruda
y 6 niveles (0, 10, 20, 50, 100 y 200 µg/kg) en el caso de la matriz frita. En la
matriz frita se estudió un mayor rango de concentraciones, puesto que cabía
esperar un mayor contenido de acrilamida en ésta. Para la construcción de las
curvas de linealidad se representó el área obtenida del pico cromatográfico (ión
producto de m/z 55.2) frente a la concentración de estándar de acrilamida
adicionada.

 Exactitud
La exactitud o recuperación, se calculó por el método de adiciones con tres
niveles para la matriz cruda (10, 20 y 50 ppb) y cinco para la frita (10, 20, 50,
100 y 200ppb). La recuperación se evaluó a partir de tres curvas de cruda y tres
de frita realizadas en tres días diferentes.
Se calculó a partir de la fórmula siguiente (ecuación 2):

% R = (Cobtenida /Cañadida) x 100

Siendo C añadida, la concentración de estándar añadida (de referencia) y C


obtenida, la concentración calculada a partir de la respuesta (área) obtenida del
cromatógrafo.

 precisión.
La precisión, la cual se define a partir de la repetibilidad y reproducibilidad, se
calculó en base a los resultados de recuperación. Con los resultados obtenidos en
el primer día, para cada nivel estudiado, se obtuvieron los estudios de
repetibilidad. Para ello se extrajeron las medias (X) y desviaciones (SD) para
cada nivel, a partir de los cuales se calcularon los coeficientes de 9 variación
(SD/ X · 100). Los cálculos de reproducibilidad se obtuvieron a partir de los
resultados de recuperación tanto del día 1, como del día 2 y 3, para cada nivel.
Los criterios de aceptación o tolerancias de repetibilidad y reproducibilidad se
basaron en la ecuación de Hortwitz (ecuación 3):

Hortwitz %CV = 2(1-0,5logC)

 Siendo C la concentración esperada. Para los valores de reproducibilidad, se


consideraron aceptables los valores de coeficiente de variación (CVR) menores
o iguales al valor predicho por Horwitz. El CVr (repetibilidad) se admite como
válido hasta 0,66 veces el valor de la reproducibilidad.
RESULTADOS

 Como era de esperar, tanto la patata fresca como tras el pretratamiento


presentaron ausencia de acrilamida, confirmándose así la formación de este
compuesto durante la fritura. La tabla 1 muestra el contenido medio y desviación
estándar de acrilamida en patata frita durante 4 min (tiempo óptimo) y 8 min de
fritura.

TABLA 1: Contenido en acrilamida (μg/Kg patata frita) al tiempo óptimo y 8 minutos


de fritura y las respectivas variaciones relativas.

Los resultados obtenidos muestran un claro efecto del tipo de pretratamiento aplicado
En el tiempo óptimo de fritura se observa como los pretratamientos más efectivos para
reducir el contenido en acrilamida son el escaldado, la inmersión de ácido cítrico o
ácido nicotínico, seguidos del lactato cálcico, glicina y del NaCl, siendo mayor esta
reducción conforme aumenta la concentración de la disolución de pretratamiento
empleada, a excepción de la glicina. Por otro lado, la congelación favoreció la
formación de acrilamida, generando incluso más del doble que en muestras sin pretratar,
como consecuencia del aumento del contenido de azúcares reductores generado por el
estrés por frío. La reducción de acrilamida a la inmersión de la muestra en ácido cítrico
estaría relacionada con la protonización del grupo amino (-NH2) de la asparagina
limitando su unión con el grupo carbonilo de los azúcares (Rydberg et al., 2003; Stadler
et al., 2004).

CONCLUSIONES
El contenido en azúcares reductores en la patata fresca condicionó el tiempo óptimo ya
que a menor contenido inicial mayor tiempo transcurre hasta alcanzar valores del
parámetro de color a* superiores a 0. El efecto del pretratamiento sobre el color no fue
significativo, a excepción del escaldado y de la congelación, para los últimos tiempos.
Los pretratamientos aplicados 19 dieron como resultado una disminución del contenido
inicial de azúcares reductores de la patata fresca, siendo el escaldado el pretratamiento
más efectivo. Por otro lado, el contenido en azúcares reductores inicial de la materia
prima condicionó el tiempo óptimo de fritura, aunque sin embargo es posiblereducir
dicho contenido mediante la aplicación de ciertos pretratamientos entre los que destaca
el escaldado, el cual provoca una lixiviación de compuestos solubles, entre ellos los
azúcares reductores, al medio externo.
Respecto a la reducción de acrilamida, los resultados ponen de manifiesto que es posible
reducir su contenido mediante la aplicación de diferentes pretratamientos, siendo los
más efectivos, de entre los evaluados, la inmersión de la patata en disoluciones de ácido
cítrico o nicotínico al 2%. Además, la aplicación de una elevada temperatura y poco
tiempo (condiciones de escaldado) también resultó más efectiva frente a la aplicación de
temperaturas moderadas y tiempos prolongados de inmersión (control). Por último, es
importante tener en cuenta que el pretratamiento óptimo no será aquel que más limite la
generación de acrilamida durante la fritura sino también el que no modifique las
características organolépticas del alimento frito tales como color, textura, aroma y
sabor. Por lo que sería necesario llevar a cabo un análisis sensorial de las muestras para
evaluar la percepción de estos atributos por parte del consumidor.

https://es.scribd.com/document/361220309/determinacion-de-acrilamida