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Las especies de levadura osmotolerantes difieren en los parámetros fisiológicos

básicos y en la tolerancia a los estreses no osmóticos.

Osmotolerancia: es la capacidad que tiene un microorganismo de crecer en un entorno


con una elevada presión osmótica.
presión osmótica: Es consecuencia de la diferencia inicial de concentraciones, produce el
pasaje de moléculas de solvente, a través de la membrana, hacia la parte de mayor
concentración.

Se compararon los parámetros fisiologicos( tamaño celular o la capacidad de


crecimiento) de:
tres especies de levaduras osmotolerantes, Debaryomyces hansenii, Pichia farinosa
(sorbitophila) y Zygosaccharomyces rouxii, con las de tipo nativo de Saccharomyces
cerevisiae.
Éstas tienen diferentes habilidades para sobrevivir:
1.anhidrobiosis: Se da para poder sobrevivir a largos periodos sin agua, es un estado
reversible y en el cual ocurre casi una pérdida total de agua en el cuerpo para la formación
de la capa protectora que le permite sobrevivir.
2. La limitación de potasio
3. La presencia de fármacos catiónicos tóxicos
Cuando se comparó su osmotolerancia, los resultados revelaron que:
1. Algunas de las especies aisladas como tolerantes al azúcar / poliol (por ejemplo, P.
farinosa) también son altamente tolerantes a las sales y, viceversa.
2. Algunas cepas aisladas de un ambiente con alta concentración de sal (por ejemplo,
Z. rouxii ATCC 42981) toleran altas concentraciones de azúcares.
3. Ninguna de las cepas y especies probadas era osmofílica.
nuestros resultados mostraron que: P. farinosa (sorbitofila) es la especie más robusta
cuando se enfrentan con diversos estreses, mientras que Z. rouxii CBS 732, aunque es
osmotolerante en general, no es específicamente tolerante a la sal y es bastante sensible a
la mayoría de las condiciones de estrés probadas.
INTRODUCCIÓN
Las levaduras son microorganismos esenciales, no sólo para la producción de muchos tipos
de alimentos si no también en los procesos biotecnológicos, por ejemplo, vitamina o la
producción de biocombustibles. Las levaduras osmotolerantes se distinguen por su
capacidad de sobrevivir a una alta presión osmótica en el medio ambiente.
Para la adaptación a un ambiente con alta presión osmótica generalmente las levaduras
combinan varios mecanismos como cambios en la composición de la membrana, el
metabolismo redox, producción y transporte de glicerol y en la actividad de varios
transportadores de iones. Al parecer, todas las especies de levadura utilizan glicerol como
osmolito (son compuestos que afectan la osmosis. Tiene un papel muy importante en
el mantenimiento del volumen celular y el equilibrio de fluidos del medio intracelular y
extracelular). para compensar el aumento de la presión osmótica externa. Una de las
características cruciales para tolerar ya sea concentraciones de azúcar o de sal extremas es
transportar eficientemente el glicerol en la célula.
En un extenso estudio de los mecanismos comunes de halotolerancia en levaduras, se
examinaron varias decenas de especies de levaduras y se demostró que
Zygosaccharomyces rouxii , Debaryomyces hansenii y Pichia sorbitophila ( P.
farinosa)) se encuentran entre las levaduras más osmotolerantes debido a su capacidad de
retransportar activamente glicerol perdido (en simportamiento con protones o cationes de
sodio) de vuelta a las células (Lages et al ., 1999 ). Esta notable capacidad de acumular
glicerol producido por las células en respuesta a la presión osmótica, pero perdida por
simple difusión, distingue las especies osmotolerantes de las osmosensibles.

✓ Zygosaccharomyces rouxii es una especie de levadura osmotolerante que es un


pariente cercano de S. cerevisiae pero que es capaz de crecer en un ambiente de
actividad de agua muy baja, especialmente cuando es causada por altas
concentraciones de azúcar (hasta 60% p / v de glucosa). Como resultado, es la
levadura más notoria, que causa graves pérdidas por deterioro en la industria
alimentaria.
✓ Z. rouxii desempeña un papel insustituible en la fermentación tradicional necesaria
para la producción de vinagre balsámico, miso o salsa de soja. Otra característica
notable de esta especie es su fructofilia, es decir, Z. rouxii prefiere la fructosa a la
glucosa como fuente de carbono.
✓ Debaryomyces hansenii es una levadura marina criotolerante que puede tolerar>
20% de salinidad en su ambiente y que, de acuerdo con estudios fisiológicos, se
clasificó como una levadura halófila. Aunque es una levadura no patógena, su
secuencia de genoma se agrupa con el grupo de especies de Candida patógenas.
Se cree que esta levadura es halófila, principalmente cuando se cultiva a una
temperatura óptima.Se aislaron cepas de D. hansenii de diversos ambientes con
altas concentraciones de sal, como agua marina o quesos y salchichas tradicionales.
Un estudio reciente reveló que cinco cepas pertenecientes a las especies
halotolerantes estrechamente relacionadas Debaryomyces hansenii / fabryi (pero
aisladas de diversos ambientes) son muy diferentes con respecto a su tolerancia a la
sal y al estrés oxidativo. La cepa utilizada en este estudio (CBS 767) proviene de los
laboratorios Carlsberg y puede tolerar concentraciones de NaCl de hasta el 25%.
✓ Pichia farinosa (CBS 7064) se aisló originalmente a partir de una solución de
sorbitol al 70% y se describió como una nueva especie llamada Pichia sorbitophila.
Aunque P. farinosa es extremadamente osmotolerante y, a pesar de que las
concentraciones elevadas de azúcar o poliol pueden crecer en una solución
saturada de KCl, no es ni halófila ni osmótica. Su crecimiento óptimo se observó en
ausencia de presión osmótica extra. Se encontró que P. farinosa usaba un
gradiente de protones hacia adentro como fuente de energía para acumular glicerol.

(YPD) Extracto de levadura-Peptona-Dextrosa


(YNB) Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos
cloruro de potasio (KCl)
Cloruro de sodio (NaCl)
Litio (Li)
Cloruro de Litio(LiCl)

Metodología
Cepas de levadura
Las cepas de levadura utilizadas en este estudio fueron:
1.Zygosaccharomyces rouxii CBS 732 (ATCC 2623), aislada de mosto de uva.
2.Zygosaccharomyces rouxii ATCC 42981, aislada de condimento salado.
3.Debaryomyces hansenii CBS 767 (ATCC 36239),fue aislada del ambiente.
4. Pichia farinosa CBS 7064,fue aislada de solución de sorbitol
5. Saccharomyces cerevisiae FL100 (ATCC 28383).(Nativa)

Medios y condiciones de crecimiento


Las cepas de levadura se cultivaron respectivamente en los siguientes medios:
6. YPD (1% de extracto de levadura, 2% bactopeptona y glucosa al 2%; Agar al 2%
para medios sólidos)
7. YNB-NH4 (0,67% de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, glucosa al 2%;
Agar al 2% para medios sólidos)
8. YNB- F libre de K + (0.175% YNB-F sin amino ácidos, sulfato de amonio y potasio ,
ajustado a pH5.8 y complementado con 0,4% de sulfato de amonio, 2% de glucosa,
varias concentraciones de KCl y 2% de agar para medios sólidos).
9. Para fuentes de carbono no fermentables, la glucosa en YPD y en YNB fue
reemplazado con 3% de glicerol, 3% de etanol o 1.5% de glicerol, en combinación
con 1.5% etanol.
10. Prueba de tolerancia a la temperatura, todas las cepas fueron cultivadas a 30 ° C.
RESULTADOS
FIGURA N°1

Tamaño de celda
Las características más visibles de una célula de levadura son su tamaño y forma.
Con el fin de estimar diversos parámetros fisiológicos, se estimó el peso seco, el
tamaño celular y el número de células viables en cultivos de crecimiento exponencial
de 1 ml ( A 600  = 1) de las cinco cepas.
No encontramos diferencias marcadas, con la excepción del tamaño de la celda (Figura  1
). Nuestros datos indican que, en general, el diámetro promedio de la celda está en el rango
de 4-6 μm. A excepción de D. hansenii , todas las células eran más grandes cuando se
cultivaban en YPD rica que en YNB mínima. Para P. farinosa y S. cerevisiae esta diferencia
fue muy pequeña, pero tanto para Z. rouxiiel crecimiento de cepas en YPD dio como
resultado células sustancialmente más grandes que las células cultivadas en YNB (Figura  1
). La razón de la distribución más amplia de valores para ambas cepas Z. rouxii en medio
YPD (Figura  1 ) es la agrupación de células en cadenas cortas. Las células de D. hansenii
eran más grandes cuando se cultivaban en un medio mínimo que en un medio rico, y tenían
una fase de retraso significativamente mayor y un tiempo de duplicación en comparación
con otras cepas evaluadas que crecían en YNB (datos no mostrados).
Crecimiento en presencia de estrés osmótico.
Figura 2
Crecimiento en presencia de estrés osmótico Para comparar directamente el nivel de
osmotolerancia de las cinco cepas de levadura probadas, primero comparamos su
crecimiento en YPD suplementado con 1  m de KCl o 1  m de NaCl (Figura  2 A).
Esta comparación nos mostró que todas las especies probadas toleran una solución de 1  m
de KCl, pero no NaCl. Z. rouxii CBS 732 y S. cerevsiae FL100 fueron muy sensibles al
NaCl, lo que sugiere que, aunque Z. rouxii CBS 732 es osmotolerante en general, los
cationes de sodio son más tóxicos para él que para las otras tres cepas osmotolerantes.
Para probar el efecto de solutos no tóxicos con más detalle, utilizamos medios con un
moderado (0.3  m) y alta concentración (2  m ) de KCl no tóxico, glucosa (hasta 45%) y
sorbitol (hasta 30%, no mostrado).
Se obtuvieron resultados similares con altas concentraciones de glucosa y sorbitol. Las
cepas Z. rouxii y D. hansenii crecieron ligeramente mejor en medio con 0,3  m KCl que sin
ninguna sal añadida. Sorprendentemente, D. hansenii era sensible a 2  m KCl, y Z. rouxii
aislado de mosto de uva (CBS 732) fue más inhibido por la alta concentracion de glucosa en
el medio que Z. rouxii ATCC 42981 procedente de alimentos salados (Figura  2 B).
Crecimiento en presencia de sales: (A) crecimiento en YPD sólida suplementada con 1  m
KCl o NaCl; (B) crecimiento en YPD sólida complementada con KCl o glucosa, como se
indica; (C) comparación del crecimiento en YPD sólido y medio YNB suplementado con 0,6 
m NaCl Cuando se repitieron los mismos experimentos con medios de YNB mínimos, se
obtuvieron resultados similares,
es decir, mejor crecimiento de Z. rouxii y D. hansenii en presencia de concentraciones
moderadas de sal (Figura  2 C). Por otro lado, sorprendentemente, Z. rouxiiCBS 732 era
sensible a 0.6  m NaCl en placas YPD pero toleraba la misma cantidad de sal en medio
YNB.
P. farinosa era extremadamente osmotolerante; su crecimiento solo fue significativamente
limitado en placas con altas concentraciones de sal (> 2  m NaCl o KCl). En esta serie de
experimentos, repetidamente observamos que D. hanseniicreció bastante mal y su
osmotolerancia no fue tan alta como se esperaba (Figura  2 A-C)

Figura 3: Crecimiento y tolerancia a la sal a diversas temperaturas:


Para verificar si esto fue una consecuencia de la temperatura de crecimiento utilizada de 30
° C, que es supraóptima para esta especie de levadura, probamos el crecimiento de las
cinco cepas en placas YPD a diversas temperaturas (18-37 ° C; Figura  3 A) y en presencia
de una concentración moderada de NaCl (0,4  m ; Figura  3 B). Nuestros resultados
mostraron que, en general, las especies no convencionales preferían una temperatura más
baja y solo S. cerevisiae crecía muy bien en todo el rango de temperatura probado. Este
fenómeno fue más significativo con D. hansenii, cuyo crecimiento óptimo estuvo en el rango
de 18-25 ° C.
Se observó una diferencia significativa en la temperatura de crecimiento óptima entre Z.
rouxii CBS 732 y ATCC 42981. Ambas cepas crecieron de manera similar a 25 ° C, pero
CBS 732 se las arregló mejor con 18 ° C (Figura  3A). Cuando se añadieron 0,4  m de NaCl,
mejoró significativamente el crecimiento de Z. rouxiiATCC 42981 a 25-37 ° C (Figura  3 B) y
también el crecimiento de D. hansenii a temperaturas supraóptimas. En general, las tres
especies no convencionales ( Z. rouxii ATCC 42981, D. hansenii y P. farinosa) creció mejor
en presencia de concentraciones moderadas de sal a temperaturas supraóptimas. figura 3
(A) crecimiento en YPD sólido a las temperaturas indicadas; (B) efecto de 0,4  m NaCl sobre
el crecimiento en YPD a las temperaturas indicadas (después de 3 días) En base a esta
serie de experimentos, decidimos realizar todas las pruebas posteriores a 30 ° C, aunque
no es la temperatura óptima para D. hansenii , y los experimentos en los que el efecto de la
temperatura no óptima podría afectar los resultados se repitieron en temperatura más baja.

Figura 4
Uso de fuentes de carbono no fermentables y producción de glicerol en condiciones
estándar
El crecimiento de células en presencia de etanol y / o glicerol en lugar de glucosa mostró
que solo S. cerevisiae FL100 podía usar estas dos fuentes de carbono (Figura  4 ), y solo Z.
rouxii ATCC 42981 podría crecer en glicerol. La capacidad de Z. rouxii ATCC 42981 y S.
cerevisiae para usar glicerol como única fuente de carbono, y la incapacidad de las otras
tres cepas para hacerlo, se confirmó mediante mediciones de crecimiento en medios
líquidos (no mostrados).
Como ya se mencionó, se cree que las levaduras osmotolerantes alcanzan más
eficazmente las concentraciones intracelulares de glicerol necesarias y producen menos
glicerol total sobre el estrés osmótico . Queríamos saber si las especies osmotolerantes
producen diferentes cantidades de glicerol que S. cerevisiae en condiciones estándar, es
decir, cuando se cultivan en YPD sin estrés osmótico.

Figura 6
Resistencia a cationes tóxicos, fármacos catiónicos y potencial de membrana
plasmática
Cuando probamos la tolerancia de las células al Li + tóxico , observamos diferencias
sorprendentes (Figura  6 A). Z. rouxii CBS 732 fue altamente sensible incluso a una baja
cantidad de LiCl, mientras que la otra cepa Z. rouxii (ATCC 42981) podría crecer en
presencia de altas concentraciones de LiCl. Las células de D. hansenii también fueron
extremadamente tolerantes al LiCl (hasta 1  m ). Este resultado sugirió dos cosas. Primero,
la sensibilidad observada de Z. rouxii CBS 732 a cationes tóxicos de metales alcalinos (Na
+ y Li + , Figuras  2A y 6)A) podría deberse a una menor capacidad para exportar o
secuestrar estos cationes; y, viceversa, la alta tolerancia al litio de Z. rouxii ATCC 42981 y
D. hansenii podría ser causada por un sistema muy eficaz para el flujo de salida de litio. En
general, hay dos tipos de exportadores activos de catión de metal alcalino en la membrana
plasmática de la levadura; una ATPasa y un antiporter. En S. cerevisiae , el sistema más
poderoso para exportar cationes tóxicos de metales alcalinos es la Ena ATPasa, y el
antiportador Nha1 juega un papel menos significativo en la desintoxicación de cationes. Un
catión, ATPasa, aún no se ha caracterizado en Z. rouxii CBS 732. En esta cepa, solo se ha
descrito un exportador de Na + y Li + antipuerto. Los exportadores de cationes en Z. rouxii
ATCC 42981 aún no se han estudiado, pero se han descrito tanto ATPasas eficientes como
antiporter en D. hansenii (Almagro et al ., 2001 ; Velkova y Sychrova, 2006 ). Figura 6
Efecto de cationes tóxicos, fármacos catiónicos y estimación del potencial de membrana
relativo: crecimiento en placas de YPD sólidas con varias concentraciones de: (A) cloruro de
litio; (B) higromicina B, espermina y TMA; (C) potencial de membrana relativa de células
cultivadas en YPD líquido a la fase exponencial media; resultados promedio de tres
experimentos independientes ± SD se presentan En segundo lugar, las diferencias en las
tolerancias de litio pueden ser el resultado de una diferencia en el potencial de la membrana
plasmática, que sirve como la fuerza motriz para la afluencia de cationes y fármacos
catiónicos. Para dilucidar si las diferencias observadas en la tolerancia al litio podrían
atribuirse a un aumento de la afluencia de Li + en las células, se evaluó la tolerancia de las
células a diversos fármacos catiónicos. Estos tres medicamentos, higromicina B, espermina
y tetrametilamonio (TMA), afectan a las células de levadura de diferentes maneras y, por lo
tanto, un aumento simultáneo de la tolerancia / sensibilidad a todos estos fármacos sugiere
una diferencia en el potencial de membrana (Barreto et al ., 2011 ). Como se muestra en la
figura 6 B, Z. rouxii ATCC 42981 fue ligeramente más tolerante a los fármacos catiónicos
que Z. rouxii CBS 732. Además, P. sorbitophila fue bastante tolerante a los fármacos
catiónicos, en contraste con su sensibilidad relativa al LiCl (Figura  6A). Las células de D.
hansenii fueron muy sensibles a la higromicina B tanto a 30 ° C como a la temperatura
óptima (aproximadamente 25 ° C, ver información de apoyo, figura S1), lo que contrastaba
con su alta tolerancia a Li + (Figura  6 A). Finalmente, estimamos el potencial de membrana
relativo de las células que crecen en YPD (Figura  6 C). Nuestros resultados mostraron que,
a excepción deD. hansenii , las otras cuatro cepas podrían tener un potencial de membrana
similar. Con D. hansenii , observamos hiperpolarización significativa en comparación con las
otras cepas. Las curvas de tinción obtenidas para D. hansenii (no mostradas) fueron más
similares a las de las especies de Candida (Elicharova y Sychrova, 2013 ) que a las de S.
cerevisiae , lo que probablemente reflejó su proximidad filogenética. La hiperpolarización
relativa observada de la membrana plasmática de D. hansenii confirmó, por un lado, los
resultados de las pruebas de caída en presencia de fármacos catiónicos, principalmente
higromicina B (Figura  6).B), y por otro lado, sugirió que la alta tolerancia al litio de las
células de D. hansenii se debía a la presencia de un mecanismo eficiente de desodificación
de Li + (¿exportación?). Resistencia al estrés oxidativo

Conclusiones
•Resultados mostraron que algunas especies osmotolerantes son más robustos cuando se
enfrenta a varios tipos de estrés que otros, que algunas de las especies aislado
también son altamente tolerantes a sales y otras tensiones y,viceversa, algunas cepas
aisladas de un ambiente salino tolerar altas concentraciones de azúcares.
• Una comparación de los parámetros fisiológicos y capacidad de crecimiento, tanto en
condiciones normales y de estrés reveló diferencias importantes entre las cepas
osmotolerantes y especies, y nos hacen creer que, nuestros resultados pueden
contribuir a la futura selección de cepas y especies osmotolerantes apropiadas para
mejorar la productividad de los diversos procesos biotecnológicos relacionados con la
levadura.
Aplicación en Microbiología industrial y ambiental
Los productos biotecnológicos obtenidos a partir de levaduras influyen sobre diversos
sectores de interés comercial como: alimentos, bebidas, químicos, enzimas
industriales, productos farmacéuticos, agro y medio ambiente