Guia Cultivo de Tej Veg II 2012 PDF

Guia de Cul tivo de Tejid os Vegetales Page 0
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INDICE GENERAL
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PRÁCTICA PÁ GINA
Indice General……………… ………… ………………… ………………………… ……………….. 1

Programa y Planificación …… ………… ………………… ………………………………….. 2
Abre viaturas......................................... .................................. ................. 7
Práctica N1. Preparación de Medios de Cultivo. Condiciones de asepsia 8
Práctica N2 Inducción de Embriogénesis Somática................................ 14
Práctica N3 Organogénesis............................................ ...................... 16
Práctica N4 Cultivo de Yemas y Microesquejes......................... .......... 18
Práctica N5 Cultivo de Embriones Cigóticos...................................... . 20
Práctica N6 Extracción de Proteínas.................................... .... 22
Práctica Nº 7 Ext racción de ADN 31
Anexo 1. Formulaciones de Medi os de Cultivo.............................. 38
Anexo 2. Términos utilizados en Cultivo de Tejidos Ve getales...... 42
Anexo 3 Traducción de Términos............................ .................... 51
Guia de Informes……………………… ………………………… ………………… ………… …. .52
Guía de informe para la práctica Nº2 .......................... ......................... 53
Guía de informe para la práctica Nº3................ .................................. . 55
Guía de informe para la práctica Nº6................ .................................. .. 58
Guía de informe para la práctica Nº7................ .................................. . 60
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales Page 1

PRO GRAMA DE TEO RIA
Cultivos de Tejidos Vegetales.

Tema 1. Introducción al cultivo in vitro de tejidos vegetales.
a. Term inología. b. Historia. c. Conceptos de Determinación, Competencia,

Totipotencia, Regeneración, Morfo génesis, Or ganogénesis, y Embriogénesis. d. Tipos
de cultivos. e. Fases del cultivo. f. Aplicaciones.
Tema 2: Factores que influyen en el crecim iento y desarrollo de los cultivos

vegetales in vitro.
2.1. Factores extrínsecos

a. Composición química de los medios de cultivo. Com ponentes inorgánicos:
m acronutrientes, micron utrientes. Com ponentes orgánico s: f uentes de car bono,
vitam inas, m ezclas de sustancias no definidas y otros com ponentes.
b. Composición química de los medios de cultivo. Horm onas: auxinas,
citoquininas, giberelinas, ácido abscísico, etileno. Estructura y bio síntesis,
naturales y sintéticas. Ef ectos fisioló gicos en cultivo in vitro.
c. Condiciones físicas del cultivo y de los medios: m edios de soporte, pH,

temperatura, hum edad r elativa y luz.
2.2. . Factores intrínsecos: genotipo, edad de la planta, edad del órgano o tejido, estado
fisio ló gico, estado fitosanitario, tamaño del explante.
Tema 3: Procesos de rediferenciación.

3.1. a. Procesos de dedifer enciación y r edifer enciación in vitro. El ciclo celular y la
rediferen ciación. Callo: concepto, tipos, in ducción.
b. Or ganogénesis directa e indirecta.
c. Micropropagación: concepto, ventajas y desventajas. Fases y aplicaciones.

3.2. Embrio génesis somática: con cepto, im portancia in ducción de em brio gén esis
som atica in vitro , cambio s estruct urales, factores que afectan la em br io génesis
som ática in vitro. Expresión génica.
Tema 4: Relación entre Cultivos de tejidos vegetales y Fitopatología.
Contaminación de los cultivos in vitro. Pro ducción de plantas libre de patógenos.
Producción de plantas resistentes a p atógenos.
Tema 5: Suspensiones celulares.

Cultivo de células en suspensión. Cultivo de células fotoautotróficas. Medio
condicion ado y Medio nodriza. Aplicaciones: pro ducción de m etabolitos secundario s.
Tema 6: Protoplastos.
Aislamiento y p urif icación. Cultivo y regen eración. Ap licaciones: obtención de híbr idos
somáticos y cíbrido s, estudio s bioquím icos y f isiológicos.

Tema 7: Variabilidad de las plantas regeneradas in vitro.
a. Var iación som aclonal, : concepto. orígen factores que la afectan. b. Hip erhidricidad
Tema 8: Polaridad.
Concepto, polaridad a nivel celular. formación de la p ared celular. Factores externos e
internos que inf luencian la polar idad. Relación entre polar idad y diferenciación.
( 3 horas)
Tema 9 : Ingeniería genética de plantas.
a. Con ceptos básicos y m étodo s de Biología m olecular.
b. Método s de transform ación en p lantas.

c. Marcadores m oleculares
d. Aplicaciones de la In geniería Gen ética en el fitomejoramiento.
Tema 10: Marco legal de la Biotecnología. Bioética y Bioseguridad.

Patentes , Derechos de Obtentor y Secretos Em presariales. Bio segur idad.
(3 horas)
______________________________________________________________________
EVALUACIO N
TEO RÍA (65 %) PRÁC TIC A (35 %)
Cada parcial= 17% Inform es= 15%
Seminario teórico= 14% Proyecto= 20%
O BSERVAC IÓ N: Los temas y fech as de los sem inarios teóricos serán fijados el
segun do día de clases.

ABREVIATURAS.
(entre paréntesis se indica la abreviatura utilizada generalmente en inglés)
AIA (I AA) Acido Indol Acético
ABA Acido Abscísico
ANA (NAA) Acido Naftalenacético
BA ó BAP 6-Bencilaminopurina
2,4-D Acido 2,4-diclorofenoxiacético
GA3 Acido giberélico
IBA Acido Indolbutírico
K Cinetina
MS Sales minerales según formulación de Murashige y Skoog

PRÁCTICA N1
Preparación de medios de cultivo.

Condiciones de asepsia.
INTRO DUCCIO N
Las plantas que crecen en la naturaleza tienen tres fuentes esenciales para su
nutrición. Los nutrientes minerales los o btienen, junto con el agua, desde el suelo a través
del sistem a radical. El dióxido de carbono atm osférico es utilizado en el proceso de la
fotosíntesis para proveer carbono como fuente básica de ener gía; por últim o, el cuerpo de
la planta, utiliza los carbohidratos y nutrientes para sintetizar las vitam inas y sustancias de
crecim iento esenciales para su crecim iento y desarrollo normal.
Los requerim ientos para que un tejido vegetal crezca in vitro, en general, son
similares a aquellos de las plantas intactas creciendo en la naturaleza. Sin em bar go, en la
m ayoría de los casos só lo se cultivan tejidos aislado s o una parte pequeña de los órganos
de la planta; estos tejido s u ór ganos aislado s carecen de la capacidad para sintetizar sus
propios carbohidratos, la m ayoría de las vitaminas, y las sustancias de crecimiento
vegetales. Por lo tanto, todas las sustancias que necesitaría una planta intacta en la
naturaleza deben ser sum inistradas artificialmente a los tejidos cultivados.
El establecim iento y crecimiento exitoso de un tejido vegetal in vitro, generalm ente
esta determinado por la naturaleza del explante, por la com posición del m edio nutritivo, y
varios factores am bientales (luz, tem peratura, etc.).

SUSTANCIAS Q UE SE AÑADEN USUALMEN TE AL MEDIO NUTRITIVO
PARA INDUCIR C RECIMIENTO Y DESARRO LLO
Requerimientos nutricionales y hormonales de los tejidos vegetales y cultivos de
órganos
AGUA
SUSTANCIAS MACRO MICRO
ORGANI CAS elementos
azúcares
am inoácidos N Fe Co
vitaminas P Zn Ni
auxinas Ca B Al
citoquininas Mg Mn Mo pH
giberelinas S Cu I
ácido abscísico K
etileno
MEZCLA Extracto de Levadura
INDEFINI DA DE Agua de coco
SUSTANCIAS Extractos vegetales
Hidrolizado de Caseína
Peptona y Triptona
PRO CEDIM IENTO PARA LA PREPARAC IO N DE LO S MEDIO S DE CULTIVO .
1- Añada una porción de agua destilada a un m atraz aforado
2- Las sales (m acro y micronutrientes están preparadas en form a concentrada y se
almacenan en la nevera (4oC).

º
En el ANEXO N 1 hay una tabla en la cual se in dica que volum en es necesario
añadir para preparar un litro de m edio según la form ulación de Murashige y Skoog
(1962).
Añada las soluciones de sales en el orden y volum en indicado s, haciendo los
cálculos de acuer do al volum en de m edio que se va a preparar.
3- Agregue las vitaminas: la Tiamina esta preparada en una solución 0.08 g/l.
4- Pesar el mio-Inositol, disolverlo en una pequeña cantidad de agua destilada y
añadirlo al m edio.
5- Pese la sacarosa, disuélvala en agua destilada y añádala al medio.

6- Las horm onas están preparadas en solución a 1 m g/m l y se almacenan en nevera
o
(4 C) por lapsos cortos de tiempo.
Las horm onas utilizadas dependen del o bjetivo del experimento, en cada práctica
indica la com posición hormonal de los medios necesarios. Al final de esta práctica
hay una tabla resumen de los m edio s que se prepararán para las prácticas Nros. 1,
2, 3 y 4.
Calcule el volum en de solución horm onal que debe añadirse a cada medio y
agréguelo al medio correspondiente.
7- Una vez que el m edio contenga todos sus componentes, enrase con agua destilada
hasta el volum en deseado.
8- Ajuste el pH a 5,8 con NaOH ó HCl.
9- Pese el agar o gelrite para tener una concentración final de 8 g/l o 2 g/l
respectivamente y añádalo al medio.
10 - Caliente el m edio en el horno m icroondas hasta que el agar esté disuelto; y luego
reparta el m edio en envases adecuado s previamente rotulados: tipo de m edio,
equipo, fecha.
BIBLIOGRAFIA.
- Ozias-Akins, P. y I.K. Vasil. 1985. Nutrition of Plant Tissue Cultures. En: Cell
Culture an d Som atic Cell Genetics of Plants, Ed. I.K. Vasil., V.2. pags. 129-147.
- Pierik, Ir. R.L.M. 1984. In vitro culture of Higher plants. Department of
Horticulture Agricultural University, Wageningen, 107 pags.
- Gamborg, O.L., T. Murashige, T.A. Thorpe y I.K. Vasil. 1976. Plant Tissue
Culture Media. In Vitro 12(7): 473-478.

EJ EMPLO DE PREPARAC IO N DE 100 M L DE MEDIO NRO . 2.
MEDIO 2 = Medio básico de Murashige y Skoo g (1962) + 1 m g/l 2,4-D
Balón aforado de 100 m l + un poco de agua


AGREGAR SALES DE MURASHIGE Y SKOOG
2 ml A
2 ml B
0.5 m l C
0.5 m l D
0.5 m l E
1 ml F

AGREGAR LA VITAMINA Tiam ina-HCl (0.5 m l)

AGREGAR 10,0 mg Mio-Inosit ol

AGREGAR 3 g DE SACAROSA PREVI AMIENTE DI SUELTA
EN AGUA

AGREGAR HORMONAS
0.1 m l 2,4-D (stock 1 m g/m l)

AFORAR A 100 m l

AJUSTAR pH a 5,8 con NaOH ó HCl

AGREGAR 0.8 g AGAR Y DI SOLVERLO EN EL MICROONDAS

SERVI R EL MEDIO EN 10 TUBOS PEQUENOS

TABLA DE MEDIO S DE C ULTIVO PARA LAS PRAC TICAS 2, 3, 4, 5
MEDIO AUXINA C ITOQ UININA V DE NRO . DE TEJIDO Q UE SE VA A

(m g/l) (m g/l ) MEDIO ENVAS E SEMBRAR
(ml) S
1 - - 600 30 fcos. floema zanahoria

callo tabaco
yem as y micro-esquejes
embriones
2 1 2,4-D - 200 10 fcos. floema zanahoria
3 0.5 AIA - 100 5 fcos. callo tabaco
4 - 2 K 100 5 fcos. callo tabaco
5 0.5 AIA 2 K 100 5 fcos. callo tabaco
6 0.1 ANA 0.5 BA 100 5 tubos hojas Begonia
7 0.1 ANA 1 BA 100 5 tubos yem as-microesquejes
8 0.1 AIA 1 K 100 5 tubos embriones
NO TA: Todo s los medios contienen los com ponentes básicos de Murashige y Skoog
(1962) indicados en el anexo N°1.

CO NDICIO NES DE ASEPSIA.
Los tejidos cultivados in vitro deben mantenerse en condiciones asépticas:
1. Los explantes que se siem bran para establecer cultivos iniciales son
sometidos a un proceso de desinfección que se describe en detalle en cada
práctica. El procedim iento de desinfección depende del tipo de tejido y en
qué condiciones f ue cultivado.
2. Es recom endable realizar todas las manipulaciones del tejido y m edios ya
esterilizados en una cám ara de flujo lam inar que elimina por filtración las partículas
suspen didas en el aire garantizando un ambiente no contam inado.
3. Para trabajar en el cuarto de cultivos donde están las cámaras de flujo laminar se
deben seguir las norm as siguientes:
El am biente debe m antenerse limpio, la superficie de trabajo se desinfecta con
alcohol 70% antes y después de usarla, se debe usar bata de laboratorio y lavarse
bien las manos antes de entrar, los in strumentos como pinzas, bisturí, etc. se
desinfectan flameándolos, la vidr iería utilizada se esteriliza en el autoclave.
Las m anipulaciones que se hacen en la cám ara de flujo lam inar, se hacen cerca de
la llam a del m echero,
PRECAUCI ON: MANTENGA ALEJADO EL FRASCO DE ALCOHOL Y EL

ALGODON IMPREGNADO DE ALCOHOL DE LA LLAMA DEL MECHERO,
PUEDEN PRENDERSE.
4. Al finalizar el trabajo, se apaga el m echero, se cierra la llave del gas, se lim pia con
alcohol la m esa de la cámara (no las paredes porque se manchan), se apaga la
cámara y se deja el cuarto con la luz ultravioleta.
PRECAUCION: LA LUZ ULTRAVI OLETA ES DAÑINA PARA LA SALUD,

NO SE EXPONGA A ELLA NI LA MIRE.

PRACTICA N° 2
Inducción de embriogénesis somática.

1. O BJETIVO S
a. Inducir el proceso de em brio génesis som ática a partir de explantes de zanahoria.

b. Establecer las características f undam entales del proceso de embriogénesis som ática
a partir de los tejido s sem brados de zanahoria, y en otros sistemas (caña de azúcar
y café) establecidos en el laboratorio.
1. INTRO DUCCIO N.
La em briogénesis somática es el proceso por el cual células somáticas haploides o

diploides se desarrollan hasta form ar un em brión, sin que hay a f usión de gametos. Este
proceso ocurre en form a natural en una cantidad de especies, pero generalmente se le
conoce m ejor como una ruta para la regeneración in ducida por cultivo de tejidos.
Un embrión som ático puede definirse com o una planta en su etapa inicial de desarrollo
que presenta una estructura bipolar, con raíz y vástago en polo s opuestos de un mismo eje,
no tiene conexión vascular con los tejido s m aternos y su origen es unicelular o multicelular
pero las células que lo originan no son productos de la fusión gam ética. Hay do s formas
esenciales de em brio génesis somática in vitro: La em briogénesis somática directa, es
aquella en la cual los embriones se originan directamente de un tejido sin que haya
previamente proliferación de callo, y la embriogénesis somatica indirecta, es aquella en
la cual la proliferación de callo es un requisito previo para el desarrollo del embrión.
La inducción de em briones somáticos tiene diversas aplicaciones: permite la
propagación vegetativa masiva de genotipos selectos, es m uy útil en las plantas don de la
propagación vegetativa por métodos agronómicos tradicionales no es eficiente. En varios
cultivos se están utilizando em briones somáticos para producir las llamadas sem illas
sintéticas, donde el embrión es encapsulado en un medio artificial que sim ula la semilla y
luego puede utilizar se de modo similar a la misma. La inducción de em brio génesis
somática in vitro se ha visto como un sistem a m ás fácilmente manipulable para hacer
estudios que perm itan determ inar los eventos bioquímicos y genéticos que ocurren durante
el proceso.
En la presente práctica se sembrarán explantes tom ados de una zanahoria, este fue
el primer sistema en el cual se logró inducir el proceso de embr iogénesis somática in vitro,
y ha sido muy estudiado, por ello es uno de lo s sistem as que ha sido mejor caracterizado
hasta el presente y se lo considera un m odelo de cultivo in vitro y en especial de
embriogénesis somática, por ello lo hemos escogido para este trabajo de laboratorio,
adem ás se o bservarán otros sistem as de cultivo que se trabajan en el laboratorio, para
compararlos con la zanahoria, y permitirá considerar las aplicaciones que dichos métodos
han tenido en la investigaciones que llevamos a cabo actualmente.
3. MATERIALES Y METO DOS.

Procedimiento de siembra de los explantes.
a. Desinfección de lo s tejidos
Lave la zanahoria con agua, jabón y cepillo. Córtela en trozos de
aproximadam ente 4 centímetros de largo y colóquelas en una solución de cloro
al 20 % por 15 m inutos. Lleve a la cámara de flujo lam inar y enjuague 2 veces
con agua destilada estéril.
b. Siembra
Se sem brarán los explantes en los medios 1 y 2.
Tome un trozo de zanahoria con una pinza estéril, colóquelo en una placa
de Petri y con un sacabocados saque cilindro s de xilem a + floema + cambium .
Corte disco s con un bisturí y siémbrelos sobre el m edio, tomando en cuenta la
polaridad. Siembre 3 discos en cada frasco, selle los frascos con envoplast e
incube en el cuarto de cultivo o en luz.
c. Repique
Bajo con diciones asépticas, transfiera los tejidos a m edio control (m edio 1,
sin hormonas) fresco.
6. BIBLIO G RAFIA.
 Street, H.E. y L. A. Whiters. 1974. The anatomy of embryogenesis in culture. En:
Tissue culture & Plant Science. H.E. Street (Ed.) Ed. Acad. Press, Londres, pp. 71-100.
 Reinert, J. y Yeoman, J.J. 1982. Plant Cell and Tissue Culture. A Laboratory Manual.
Ed.Sprin ger- Verlag, Berlín, 83 pags.

PRÁCTICA Nº 3
Organogénesis
1. O BJETIVO S
a. Inducir organo génesis usan do hojas como explantes.
b. Inducir or ganogénesis indirecta en callos de tabaco.
c. Establecer curvas de crecim iento de callos utilizan do diferentes parám etros.
2. INTRO DUCC IO N
La organogénesis es el proceso de r egeneración que ocurre mediante la formación
de órganos de novo, com o vástagos, raíces, flores, hojas, etc. Puede ser directa si ocurre
sin la formación previa de callo o indirecta si se requiere la formación previa de callo. El
callo es un tejido no or ganizado y poco diferenciado formado por células en proliferación
que se producen tanto in vivo como in vit ro. Estos últimos pueden ser de dos tipos según
su consistencia. a) friables, formados por células unidas en forma laxa, cuyas paredes
celulares presentan mayores concentraciones relativas de hem icelulosa y pectina que de
celulosa. b) com pactos form ados por células f uertemente unidas entre si, cuyas paredes
celulares presentan m ayores concentraciones de celulosa que de hemicelulo sa y pectinas.
Los callos in vitro en general se forman a partir de explantes cultivado s en
presencia de altas concentraciones de auxinas.
La organo génesis indirecta tiene interés en program as de selección en lo s que se
requiere variabilidad gen ética adicional a la ya existente en la naturaleza como por ejemplo
la resistencia a antibióticos, herbicidas, sequía, etc. La organogénesis directa se utiliza en la
m icropropagación de plantas élites.
3. MATERIALES Y METO DOS

3.1. Procedimiento de siem bra de los explantes
Tome el callo o la hoja suministrada con una pinza estéril, coloque cada uno en una
placa de Petri, córtelo en trozos de tam años sim ilares y siembre uno por frasco en los
m edios respectivos (medios 1, 3, 4, 5 y 6). Selle los frasco s con env-o-plast e incube
en el cuarto de cultivo.
3.2. Determinación de peso fresco y peso seco.

El día en que se inicie el cultivo, tom e una m uestra del callo y anote su peso (peso
fresco). Luego envuélvalo en papel de alum inio y colóquelo en la estufa bien
identificado, por varios días, hasta que esté totalmente seco y determine su peso seco.
Repita el procedimiento tom ando m uestras del material en cultivo durante 6 semanas.
Elabore las respectivas curvas de crecim iento.
4. BIBLIO G RAFIA.
- Reinert J. M. M. Yeoman. 1982. Plant Cell and Tissue Culture. Laboratory
Manual. Ed. Sringer- Verlag, Berlín.

PRACTICA Nº4
Cultivo de yemas y microesquejes.
1. O BJETIVO
Observar la form ación de brotes en yemas de ro sa y microesquejes de crisantem o.
2. INTRO DUCC IO N
Las plantas adultas presentan meristemas en los extremos del eje principal y en las
ramificaciones del vástago de la raíz. Los m eristem os del vástago o domo meristemático
se encuentran rodeados por los prim ordios foliares y en conjunto constituyen las yemas
apicales o axilares dependiendo de su posición en la planta. Las yemas axilares aisladas o
las presentes en núm ero variable en los n udo s de microesquejes cultivados in vitro en
presencia de hormonas, generalmente de citocininas, form an brotes. El número de brotes
formados dep enderá del n úm ero de yem as preexistentes, de la concentración de horm onas
endó genas, así como de las concentraciones relativas de las hormonas añadidas. Lo s brotes
formados pueden provenir de yemas axilares preexistentes o de yemas adventicias; estas
últim as pueden form arse al proliferar en si m ism a la yema axilar. Generalm ente las yemas
adventicias se forman en presencia de altas concentraciones de citocininas.
El cultivo de yem as y m icroesquejes se utiliza en la m icropropagación clonal masiva
de plantas élites. El cultivo de lo s domos meristemáticos o de yemas con pocos primordios
se utiliza para la obtención de plantas libres de virus.
3. MATERIALES Y METO DOS

3.1. Aislam iento y desinfección del explante:
Corte secciones de m icroesquejes que contengan un nudo con su
yema, lávelos con agua y jabón azul. Colóquelos en una solución de cloro
comercial al 20% y agite en una plancha m agnética por 15 a 20 minutos. En la
cámara de flujo laminar lave las secciones de tallo con agua destilada estéril.
3.2. Siembra:
Los explantes serán sembrado s en los medio s de cultivo 1 y 7.
Cortar los extrem os del microesqueje y con la ayuda de una pinza siem bre
un microesqueje por frasco, tom ando en cuenta siem pre la polaridad. Para sem brar
yemas, aisle ésta con la ayuda de un microscopio estereoscópico y material de

disección. Siembre una yema por frasco, selle los frascos con envoplast e incube en
el cuarto de cultivo.
4. EVALUACIO N DE LO S RESULTADOS.
Realice observaciones semanales en el microscopio estereoscópico:
- Observe el m omento de form ación de los brotes.
- Estim e cualitativamente la form ación de brotes y com pare lo que
ocurre en los distintos medios.
5. PREG UNTAS.
a. ¿Por qué los brotes regenerados a partir de yemas adventicias presentan m ayor
variación som aclonal que los regenerado s a partir de yemas axilares?
b. ¿Cuál es la estructura general de una yema y qué criterios se utilizan para
clasificarlas?
c. ¿Cuáles son las técnicas que se combinan con el cultivo de m eristem as para
obtener plantas libres de vir us?
6. BIBLIO G RAFIA
- Margara J. 1988. Multiplicación vegetativa y cultivo in vitro. Los meristemos y la
organogénesis. Ed. M undi-Prensa. Madrid.

PRACTICA Nº5
Cultivo de embriones cigóticos.
1. OBJETIVO
Observar la regeneración de plantas a partir del cultivo in vitro de em briones
cigóticos.
2. INTRO DUCCIO N.
El cultivo de embriones cigóticos consiste en el aislam iento y crecimiento in vitro
en condiciones estériles de un embrión inm aduro con el fin de obtener una planta viable.
En principio existen dos tipos de cultivos de embriones: a. cultivo de em briones
inmaduros, los cuales se originan de semillas que no acabaron de m adurar. El éxito de
este tipo de cultivo depen de principalmente del estado de desarrollo del em brión utilizado.
b. Cultivo de em briones maduros, los cuales a su vez se encuentran en semillas m aduras.
Este tipo de cultivo es relativamente fácil.
Algunas de las aplicaciones del cultivo de em briones son: acortamiento del ciclo de
m ejoram iento, prevención del aborto em brionario, producción de haploides y para
conseguir la form ación de callos, rescate de embriones híbridos interespecíficos.
3. MATERIALES Y METO DOS.

3.1. Desinfección de las semillas.
Lave las sem illas con agua y jabón. Colóquelas en una solución de cloro com ercial al
20 % y agite en una plancha magnética por 15 minutos. Luego colóquelas en una
cápsula de Petri con agua destilada estéril en condiciones asépticas por 30 minutos. En
la cámara de flujo laminar lave con agua destilada estéril.
3.2. Siem bra.
Los embriones serán cultivados en los m edios 1 (control) y 8.
Colo que una sem illa en una cáp sula de Petri, separe lo s cotiledones y aisle el embrión
cuidadosamente. Siembre un embrión por frasco, selle los frasco s con env-o-plast e
incube en el cuarto de cultivo.

4. EVALUACIO N DE LO S RESULTADOS.
Realice observaciones semanales en relación a:
- Porcentaje de sobrevivencia y porcentaje de germinación de los em briones
en los diferentes tratamientos.
- Longitud del vástago
5. PREG UNTAS.
a. ¿Cuáles otras aplicaciones tienen los cultivos de embriones?
6. BIBLIO G RAFIA.
- Pierik, R.L.M. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ed. Mun di-Prensa.

PRÁCTICA N° 6
Extracción de proteínas en tejidos vegetales
cultivados in vitro
1. O BJETIVO S
Al fin alizar esta práctica el estudiante debe ser cap az de:
1.1. Realizar extracciones de proteín as de tejido s vegetales cultivado s in vitro.
1.2. Aplicar el m étodo de Bradford p ara estimar la con centración proteica.
1.3. Preparar geles de poliacrilamida
1.4. Realizar corr idas electroforéticas de proteínas en geles de po liacrilam ida
1.5. Visualizar proteínas en geles de poliacrilam ida por tinción con Azul de
Coom asie e interpretar los p atrones electroforético s de proteínas.
2. INTRO DUCCIÓ N
Una form a de est udiar la diver sidad genética es analizar la expresión de

proteínas, que son los pro ductos primarios de los genes. También han sido muy
utilizadas las iso enzimas que son las difer entes formas m oleculares de un a proteína que
presenta la m ism a especificidad en zim ática. Han sido establecido s mapas genóm icos
isoen zim áticos para varias especies de plantas. Las proteínas e isoen zim as también son
m uy útiles para detectar diferen cias en la expr esión genética durante el desarro llo. Uno
de lo s métodos m ás utilizados para est udiar las proteínas es la electroforesis, m ediante
la cual las proteínas migran por el efecto de la aplicación de un cam po eléctrico so bre
un m edio de soporte sólido, que en esta práctica estará con stituido prin cipalm ente por
poliacrilamida. El gel tam bién p uede ser de alm idón, agarosa, etc. Según las
condicion es de la corrida electroforética, en geles con SDS (Do decil sulfato de so dio)
las proteínas adquieren car ga negativa y se separan de acuer do a su tamaño. Cuando las
proteínas son colocadas en un gel con un gr adiente de pH, las proteínas migran de
acuer do a su punto isoeléctrico (valor de pH al que la molécula no posee car ga eléctrica
y es incap az de desplazarse en un cam po eléctrico). Para detectar isoenzimas se realiza
una corr ida electroforética en condiciones no desnat uralizantes y luego se debe
suministrar el sustrato y los cofactores apropiado s para que ocurra una reacción tal que

se o bten ga un pro ducto coloreado. El pro ducto coloreado se deposita en el gel,
formando una ban da visible en el lugar don de la isoenzim a h a sido localizada
electroforéticamente. Las ban das visualizadas de enzimas específicas repr esentan
productos proteínicos, lo s cuales tienen una base gen ética, y p ueden proveer
información genética como marcadores co dom inantes. Sin em bar go el problem a es que
los lo ci isoenzimáticos están sujetos a m odif icación po st-transcripcional lo cual
restrin ge su utilidad com o m arcador es genético s.
El análisis de lo s cam bio s en las proteínas e isoenzim as durante los proceso s de

dif erenciación y desdif erenciación in vitro es de much a im portancia p ara lo grar una
m ayor comprensión de la regulación de la expresión génica asociada a ciertos eventos
m orfogénico s. La detección de proteínas asociadas con ciertos patrones de
dif erenciación se ha utilizado como punto de p artida para lograr el aislam iento de genes
asociado s a un aspecto determ inado del desarrollo, por ejem plo para identificar genes
relacionados con el pro ceso de em brio génesis. Kiyosue et al. (1992) lo graron aislar un
clon de cDNA que codif ica ECP31, una proteín a asociada con células em br iogénicas de
zanahoria.
En esta práctica se harán extracciones de proteínas de tejido s vegetales

cultivados in vitro, posteriormente se separar án por electroforesis en geles de
poliacrilamida y serán visualizadas por tinción con Azul de Coomassie. Fin alm ente, se
analizarán los resultado s o btenidos y su aplicación al est udio de los cultivos de tejidos
vegetales.

3. MATERIALES Y M ÉTO DO S
3.1. Extracción y cuantificación de proteínas.
a. Pesar 500 mg de hojas, p ulver izar las con nitrógeno líquido y m acerar en frío con 1 m l
(2 volúm enes) de am ortiguador de extracción A. (2,3 v eces). Prep arar el
am ortiguador de extracción A en el momento de usar (10 ml Stock Buff er A + 150
mg PVP, 100 l -Mercaptoetanol).
b. Transferir el macerado a tubos de microcentríf uga y centrifugar por 20 m inutos a

13.000 rpm.
c. Recoger el so brenadante en otro tubo y centrif ugar nuev am ente por 10 minutos.
d. Tomar 100 l del sobr enadante para determ inar la concentración de proteínas
solubles por el m étodo Bradfor d. Par a esto, se le añade 1 m l del r eactivo de Bradfor d
a los 100 l del extracto, usan do 100 l de Amortiguador de Extracción A como
blanco, la con centración se estim a utilizando una curva patrón de Albúmina de Suero
Bovino ( el método de Br adford se encuentra descrito al fin al de esta práctica).
e. Medir el volumen del resto del sobrenadante y calcular la cantidad total de proteínas
en el extracto.
f. Para precip itar las proteínas, se añ aden al so br enadante 1/10 vo lúm enes de Ácido
Tricloroacético 100% (-20C) con 1 % -Mercaptoetanol, y se incuba durante 2
horas a -20 C, en este punto se p uede dejar toda la noche.
g. Recoger las proteínas por centrif ugación a 5.000 rpm, 4C, 5 m inutos.
h. Descartar el so brenadante decantando. Elim inar la mayor cantidad po sible de Ácido

Tricloroacético invirtien do lo s tubo s so bre pap el absor bente.
i. Lav ar el precipitado con etanol 100% (-20C) tres veces, 5 minutos cada vez. En cada
lavado, use el vortex para despegar el p ellet del tubo.
j. Descartar el etanol decantando, y dejar que se evaporen los restos de etanol en frío, es
decir, sobre hielo y en la cam pana extractora de gases.
k. Resuspen der las proteínas en am ortiguador de m uestra Laemm li 2X m odif icado (5 m l

Laemmli 4X + 500 l -Mercaptoetanol + 4.5 m l Agua destilada).
El cálculo del vo lum en del Amortiguador Laem mli que se utilizará para resuspen der
las proteín as precipitadas, se determ ina en base a la cuantificación de proteínas que
se hizo por el m étodo de Bradfor d. La p astilla se resuspen de en un volumen de
am ortiguador tal, que permita cargar en el carril del gel 50-200 g de proteína. Por
ejemplo, que en 25 l de am ortiguador (volum en máximo que p uede car gar se en el
bolsillo del gel) queden disueltos 50 a 200 g de proteín a.
l. Transferir el extracto de proteínas a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar 3-5

minutos, calentar a 95 C por 5 m in y aplicar la muestra al gel el m ism o día. Si no se
va a aplicar el m ismo día, se almacena a -70C por el menor tiempo posible. Nota:
Hacer un pequeño agujero a los tubo s eppen dorf antes de calentar para que las tapas
no se abr an por la pr esión del vapor.
3.2. Preparación de geles de poliacrilam ida y separación electroforética de

proteínas.
a. Lim piar lo s vidrio s cuidadosamente con agua y jabón, lim piar con alcohol, enjuagar
con agua destilada y dejar secar.
b. Armar el dispositivo de la cámara de electroforesis que serv irá como m olde para el
gel, luego llen arlo con agua destilada para comprobar que no hay f uga de líquido.
Descartar el agua y secar.
c. Utilizan do el peine como guía, hacer una marca en el nivel hasta el cual debe llegar el
gel.
d. Preparar las m ezclas de acrilamida para el gel sep arador y el gel con centrador según
la siguiente tabla. Se prepar a la mezcla para am bos geles sim ultáneamente pero sin
agr egarle el N,N, N´, N´- Tetrametil-etilendiam ina (TEMED) n i el Per sulfato de
Am onio (P SA), estos do s se agr egan justo antes de vertir la mezcla en el m olde.

Solución Gel Separador Gel C oncentrador
(14%) (5%)
Stock Acr ilamida 4.67 m l 0.84 ml
30 - 0.8%
1 M TRI S pH 8.8 3.76 m l -
1 M TRI S pH 6.8 - 0.63 ml
H2O 1.46 m l 3.48 ml
SDS 20% 50 l 25 l
TEMED 10 l 5 l
PSA 10% 50 l 25 l
PREC AUCIÓ N IMPO RTANTE: La acr ilamida es neurotóxica por lo tanto

debe utilizar se propipeta o micropipetas para pipetearla, adem ás todo el proceso
de manip ulación (prepar ación de la mezcla y del gel, tinción, etc.) debe llev arse
a cabo con guantes.
e. Agregar el TEMED y el PSA a la m ezcla del gel separador, m ezclar bien y con una
pipeta Pasteur llenar con esta m ezcla el espacio entre lo s dos v idrio s, hasta la
marca hecha prev iam ente. Esto debe realizar se rápidamente y evitando que queden
bur bujas en el gel.
f. Con un a pipeta Pasteur, agregar suavem ente agua sobre el gel, y esper ar hasta que el
gel polimerice (aprox imadam ente 20 min).
g. Se saca el agua con mucho cuidado y se seca utilizan do pap el de filtro. Colocar el
peine, agregar el TEMED y PSA a la mezcla del gel concentrador y vertirlo de la
misma forma que el gel separador.
Esper ar que polim erice el gel concentrador (aproximadam ente 10 m in), y retirar el
peine con m ucho cuidado. Lavar lo s bolsillo s con un piceta con agua destilada.
h. Agr egar una pequeña cantidad de grasa de vacío a la U gris del electrodo y arm ar el
“sandwich” con los geles. Agr egar am ortiguador de corrida en la estruct ura que
contiene lo s geles par a comprobar que no hay f uga de líquido. Colocar el sandwich
dentro de la cubeta de electroforesis que ha sido llenada previamente con
am ortiguador de corr ida.
i. Usando un a jerin ga Ham ilton, car gar en el gel lo s m arcador es de peso m olecular
previamente calentados a 95 º C dur ante 5 min utos, y luego el volum en de muestra

previamente calculado. Recuer de tom ar nota, del orden en el cual car gó lo s
estándares de peso m olecular y las m uestras en los bolsillos del gel.
j. Tapar la cubeta de electroforesis y conectarla a la f uente de po der ap agada, tener

cuidado que el electrodo rojo esté conectado al con ector rojo de la fuente de poder, y
el electrodo negro esté conectado al conector negro de la f uente de poder. Encienda
la f uente de poder y aum ente el voltaje hasta 70 voltio s. Después de unos min utos
debe verificarse visualmente si las m uestras están corrien do en la dirección correcta.
Mantener este voltaje hasta que las m uestras pasen el gel con centrador y luego
aumentar a 120 voltios hasta que el frente de corrida de color azul llegue hasta el
bor de inferior del gel.
k. Apagar la fuente de po der y desconectar la cám ara. Desensamblar el sandwich,

separ ar los vidrio s cuidadosam ente y sacar el gel, que será colocado dur ante 20
minutos en la solución de tinción con azul de Coom asie, en agitación con stante.
l. Quitar la so lución de tinción y lavar bien el gel con agua destilada.
m . Agregar solución de destinción y dejar el gel en esta solución con agitación

constante, hasta que se p uedan o bservar las ban das de proteínas con claridad.
n. Una vez que se h ayan teñido las ban das de proteínas, el gel debe ser fotografiado para
su registro y p uede ser em pacado en bolsas plásticas, o p uede ser secado en el
secador de geles.
3.3. Soluciones utilizadas en la práctica.
a. 250 m l de Am ortiguador TRIS 1M p H 6.8; 8 ; 8.8: Pesar 30.28 g de Tris- Base y

disolv er en 150 m l de Agua destilada, ajustar al pH deseado con HCl concentrado y
llevar el volum en a 250 m l.
b. 250 m l de Solución Stock Acrilamida - Bisacrilamida 30 - 0.8%: Disolver en agua

destilada 75 g de Acr ilamida y 2 g de Bis- acrilam ida, llevar el volumen a 250 ml,
filtrar con papel W hatman Nro. 1 y almacenar en un frasco oscuro a 4 °C.
PREC AUCIÓ N IMPO RTANTE: La acrilamida es neurotóxica. Usar guantes y

máscara durante su prep aración y m anip ulación.

c. Stock de Amortiguador de extracción A: Mezclar 5 m l de 1M Tris pH 8.0, 5 m l de
100 % Glicerol, 100 l de 0.1 M EGTA, 10 ml de 2 M KCl ó 1.492 g de KCl, llevar
el volumen a 100 ml con agua destilada. Guardar en alícuotas de 10 m l a -20 C.
d. Am ortiguador Laemmli de Muestra 4X: Mezclar 25 ml de 1M Tris pH 6.8, 4 g de

SDS, 40 m l de 100 % Glicerol, 20 mg de azul de bromofenol, llevar el vo lum en a
100 m l y disolver. - Guar dar en alícuotas de 10 ml a -20 C.
e. Mezcla de Marca dores de Peso Molecular: Mezclar 8 l de Ovoalbúm ina, 8 l de

BSA, 8 l de Citocromo C, 8 l m ioglobin a y 48 ul de Amortiguador Laemm li de
muestra 2 X. La mezcla de m arcadores se calienta a 95C por 5 minutos justo
antes de cargar en el gel.- Car gar 12 l de esta m ezcla para un carril en m inigeles
(aprox.3.6 g de cada marcador) o Car gar 30 l en geles gran des. Preparar aparte el
Quim iotripsinógeno: Mezclar 8 l de Quim otripsinógeno con 92 l de
Am ortiguador Laemm li de m uestra 2X.
f. Am ortiguador de Corrida TRIS-G licina 10X: Disolv er en agua destilada 15 g de

Tris Base, 72 g de Glicina y 5 g SDS, afor ar a 500 ml con agua destilada. Para
realizar la corrida tomar 50 ml del stock 10X y llevar a 500 ml con agua destilada,
mezclar bien la solución antes de añ adirla a la cámara de electroforesis.
g. Solución de Tinción Azul de Coom assie R. Mezclar 150 ml de metanol con 50 m l

de ácido acético, llevar el volum en a 500 ml, luego agr egar 1 g de Azul de
Coom assie R y disolver.
h. Solución de Destinción: Mezclar 100 m l de metanol, 100 ml ácido acético y llevar el

volum en a un litro con agua destilada.
4. BIBLIO G RAFÍA
 Bradford, M. 1976. A Rapid an d Sen sitive Method for the Quantitation of

Microgr am Quantities of Protein Utilizin g the Prin ciple of Protein-Dye Bin ding.
Analytical Biochemistry 72: 248-254.
 Harris, E:L. V. y An gal, S. (Eds.). 1989. Protein purification m ethods. Ed. I. R.L.
Press, Oxfor d, 317 pags.

 Kiyosue, T., Yamaguchi-Shino zaki, K., Shinozaki, K., Higashi, K., Satoh, S.,
Kamada, H. and Har ada, H. 1992. Iso lation and characterization of a cDNA that
encodes ECP31, an em bryo genic-cell protein from carrot. Plant Molecular Biology
19: 239-249.
 Laemmli, U.K. 1970. Clevage of struct ural protein s durin g the assem bly of the head
of bacteriophage T4. Nature 227 : 680-685.
 Menéndez- Yuffá, A., Gar cía de García, E. y Segur a-Nieto, M. 1994. Com parative
study of protein electrophoretic patterns during em bryo gen esis in Coffea a rabica cv.
Catim or. Plant Cell Reports 13: 197-202.

C UANTIFIC AC IÓ N DE PRO TEÍNAS PO R EL M ÉTO DO DE B RADFO RD (1976).
1. Preparación del reactivo de Bradford:
a. Disolv er 100 m g de azul de Coom assie G-250 en 50 ml de alcohol al 95%.
b. Añadir 100 ml de ácido fo sfórico al 85%.
c. Aforar hasta 1 l con agua destilada
d. Filtrar con papel Whatman Nro. 1.
2. Elaboración de la curva de calibración:
a. Preparar una solución patrón de proteína con albúmina de suero bov ino ( BSA) de 1
mg/ml.
b. Preparar diluciones de la solución anterior que contengan 1,2,4,6,8,10 g de BSA en
100 l de agua destilada.
c. Preparar un blanco mezclando 100 l de agua con 1 ml del reactivo de Bradfor d.
d. Mezclar 100 l de cada dilución con 1 m l de r eactivo de Bradfor d (hacerlo por
triplicado).
e. Incubar 10 min utos a tem peratura am biente y m edir la absor ban cia a 595 nm.
f. Graficar el peso de proteína contra la absor bancia correspondiente. Aplicar un
cálculo de regresión lineal y dibujar la recta estim ada. Esta curva se utilizará p ara
estimar la cantidad de proteínas en una muestra pro blem a.
Análisis de regresión lineal:
Y = B + AX Donde:
Y = absor bancia
X = concentración de la solución a medir
B = p unto de corte con el eje Y
A = p endiente de la recta
3. Estimación de la concentración de proteínas en una muestra problema
a. Co locar en un tubo eppen dorf 100 l del extracto de proteín a a medir y mezclarlo con
1 ml del r eactivo de Bradfor d.
b. Preparar un blanco con 100 l del amortiguador de extracción y 1 ml del reactivo de
Bradford.
c. Incubar durante 10 minutos a tem peratura am biente.
d. Medir la absor ban cia a 595 nm.
e. Estimar la concentración del extracto de proteín a utilizando la curva de calibr ación.

PRÁCTICA Nº 7
Extracción de A DN vegetal
1. O BJETIVO S
1.1. Fam iliarizar al estudiante con la técnica de extracción y purificación de
ADN genómico de plantas.
1.2. Determinar la p ureza y concentración del ADN extraído m ediante técn icas
espectrofotom étricas.
1.3. Realizar la electroforesis en gel de agaro sa del ADN extraído.
1.4. Enfatizar la importancia de la o btención de ADN vegetal en la aplicación de
la tecnología del ADN recombinante.
2. INTRO DUCCIÓ N
Desde que W atson y Cr ick en 1953 form ularon la natur aleza de doble h élice
complem entaria del ADN, el análisis de su estruct ura y f unción aclaró las bases de los
procesos biológicos. Mucho de nuestro entendim iento actual de la genética m olecular
está basado en lo s hallazgos de las funcion es del ADN, las cuales vien en determinadas
en gr an extensión por la estr uctura física de la doble h élice.
Una cadena de ADN es un polímero lar go, no ramificado, com puesto de sólo
cuatro tipos de subunidades. Estos son los desoxiribon ucleótidos que contienen las bases
Adenina (A), Citosina ( C), Guanina ( G) y Tim ina (T). Los nucleótidos están unido s por
enlaces fo sfo diester covalentes que un en al Carbono 5  de un gr upo desoxiribo sa con el
Carbono 3  del próximo.
La característica esencial del modelo de do ble hélice, es que todas las bases de la
m olécula de ADN están en el lado interno de la doble hélice, con los azúcares fo sfato
del lado externo. Esto hace que las bases de una hélice estén m uy cercanas a las de la
otra hélice, lo cual requier e un apareamiento entre un a base pur ina gr ande (A o G) en
una cadena y una base pirimidina pequeña (T o C) en la otra. Luego los estudios
bioquímicos dem ostraron que el apareamiento ocurría entre A y T y entre G y C.
La estructura del ADN provee las bases de la h erencia. Un gen lleva la

información biológica en una form a que debe ser copiada fielmente y transm itida de
cada célula a todas las de su pro genie.

El contenido de ADN n uclear en plantas superiores es muy var iable. Mientras
que to dos los mamífero s tienen aprox imadam ente 3 x 109 pb por genom a haplo ide, las
plantas superior es po seen un contenido de ADN en genom a h aploide que var ía desde 7 x
7 11
10 pb en Arabidop sis thaliana hasta 2 x 10 p b p ara ciertas gim nosperm as. Estudio s en
biolo gía molecular de plantas han mostrado que la mayoría del ADN en plantas de
genom as gr an des, es ADN repetitivo. En contraste con el ADN que codifica par a genes
que son traducido s a proteín as, el ADN repetitivo, en vez de codificar para genes, juega
un pap el en la or gan ización del genoma vegetal, expresión gén ica y desarrollo.

3. MATERIALES Y M ÉTO DO
3.1. Extra cción y purificación de ADN
Método según Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1990. I solation of plant DNA from fresh
tissue. Focus 12:13-15.
a. Macerar de 100 a 150 mg de material vegetal con Nitrógeno líquido.
b. Mezclar con 700 l de amortiguador par a la extracción de DNA ( CTAB 2X, 10% de
-mercaptoetanol, el cual se añade antes de usar).
c. Co locar el macer ado vegetal en un tubo Epp en dorf de 1.5 ml.
d. Incubar a 65C durante 45 m inutos, agitando en un vortex cada 15 minutos.
e. Permitir que las m uestras se enfr íen a temperatura ambiente durante 2 minutos.
f. Centrif ugar en una centrifuga Eppen dorf a m áxima velocidad durante 20 m in utos.
g. Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf de 1.5 m l y añadir 500 l de CIA

(Cloroform o: Alcohol isoamílico 25:1), mezclando el tubo suavemente por
inversión, para evitar la ruptura del ADN.
h. Centrif ugar la m ezcla durante 5 m in utos a máxima velocidad en un a centrif uga

Eppen dorf.
i. Transferir la fase acuosa (super ior) (teniendo cuidado de no contaminarla con la

interfase blanquecina) a un tubo Eppendorf de 1.5 ml, y agregar 50 l de CTAB
10X. Mezclar suavem ente.
j. Repetir la extracción con CIA (p aso g-h).
k. Agregar 500 l de I sopropanol frío (- 20 C). Mezclar por inversión del tubo varias
veces y m antener a -20 C durante 30 m inutos par a la precipitación del DNA.
l. Centrifugar a 14.000 r.p.m . por 20 m inutos.
m . Eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no perder el pellet de ADN, que se

dejará secar de 1 a 2 minutos invirtiendo el tubo so bre un papel absor bente.

n. Lavar el ADN en 1 ml etanol 70% y centrifugar durante 10 m inutos. Descartar el
etanol. Realizar un segun do lavado con etanol 90 % y dejar secar el ADN dur ante
varios min utos a temperatur a am biente.
ñ. Resuspen der el ADN en 50 l de am ortiguador TE ó agua destilada estéril durante 30

minutos.
o. Incubar el ADN disuelto con 5 l RNAasa H 10 m g/ml, a 37 C durante 1 hora par a la

digestión del RNA total contaminante presente en la m uestra. ( Optativo en este caso).
p. Precipitar el ADN agregando 200 l de alcohol isoprop ílico frio (-20 C), mezclar por
inversión y refrigerar a -20 C durante 30 m inutos.
q. Centrif ugar por 20 m inutos a 14.000 r.p.m. en una centríf uga Epp endorf.
r. Descartar el sobrenadante y secar el pellet por inver sión de lo s tubos sobr e papel
absor bente, durante varios m inutos.
s. Disolver el ADN en 50 a 100 l de TE y alm acenar a -20 C.
3.2. Electroforesis en gel de agarosa del ADN extraído
Para analizar la integr idad del extracto de ADN obtenido, se r ealiza un a

electroforesis en gel de agaro sa 0.8% en amortiguador T BE 0.5 X. La cám ara de
electroforesis debe ser llenada con buff er TBE 0.5 X.
a. Se mezclan 9l del extracto de ADN, con 1l de buff er car gador y se colocan en un
bolsillo del gel.
b. Se mezclan 2 l de m arcador de peso m olecular (ADN del fago  doblem ente

digerido con las endonucleasas Hin d III y Eco RI) con 1 l de buff er car gador y se
colocan en otro bolsillo del gel.
c. Se llev a a cabo la electroforesis, a 50 vo ltios hasta que las m uestras p enetren y luego
colocar la fuente de po der a 100 voltios, hasta que el azul de bromofenol haya
migrado aprox im adamente 3 cm .
d. Se tiñe el gel con 4 l de brom uro de etidio en 200 ml de agua por 5 m inutos

PREC AUCIÓ N: El brom uro de etidio es un po dero so agente mutagénico por lo
tanto debe manip ular se con guantes.
e. Lavar el gel con agua destilada por 10 m inutos.
f. Se observa y se fotografía en un transiluminador bajo irradiación ultravioleta.
PREC AUCIÓ N: La luz ultravioleta es dañina p ara lo s ojo s y la piel, por lo que debe
usarse siempre una p antalla protectora.
3.3. Determinación espectrofotométrica
Para determinar la cantidad y p ureza del extracto, se m ide su absorban cia a 260 y
280 nm, en un espectrofotómetro. La lect ura a 260 nm permite calcular la concentración
de ácido s nucléicos en la m uestra. Una DO de 1, correspon de aproxim adamente a 50
g/m l de ADN de doble cadena, 40 g/m l de ADN y ARN de caden a sencilla, y 20
g/m l de oligon ucleótidos de cadena sencilla. La relación entre las lecturas a 260 y 280
nm, nos da un estim ado de la pureza del ácido nucléico. Las prepar acion es p ur as de
ADN y ARN, tien en un valor DO260/DO280 = 1.8 y 2, respectivam ente. Si existe
contaminación por proteínas y fenoles, esta relación disminuirá.
3.4. PREPARACIÓ N DE SO LUCIO NES
a. Solución de C TAB 2 X
REAC TIVO S [FINAL] [STO CK] 100 ml

2% CTAB( Hexadeciltrimetilamonio) 2% 2,00 g
1,4 M NaCl (la sal CTAB debe disolver se en la solución 1,4 M 8,12 g
desp ués de agregar el NaCl)
20 m M EDTA 20 mM 0,5 M pH 8.0 4 ml
100 m M Tris HCl p H: 8,00 100 mM 1.0 M 10 m l
PVP 1% 1 gr
Agua destilada Volum en final 100 ml
b. Solución de C TAB 10X

REAC TIVO S [FINAL] [STO CK] 100 ml
2% CTAB( Hexadeciltrimetilamonio) 10 % 10,00 g
1,4 M NaCl (la sal CTAB debe disolver se en la solución 0,7 M 4g
desp ués de agregar el NaCl)
20 m M EDTA 20 mM 0,5 M pH 8.0 4 ml
100 m M Tris HCl p H: 8,00 100 mM 1.0 M 10 m l
Agua destilada Volum en final 100 ml
c. Am ortiguador TE
Reactivos [Stock] 1l
10 mM Tris HCl p H: 8,00 1M 10 ml
1 mM EDTA pH: 8,00 0.5 M 2 ml
d. Am ortiguador carga dor de geles

-0.25 % azul de brom ofenol
-0.25 % Xileno Ciano l FF
-30 % Glicerol en agua
-Almacen ar a 4C
e. Bromuro de etidio
-Disolver 1 g en 100 ml
f. Buffer TB E 5 X
54 g Tris base
27.5 g ácido bórico
20 ml EDTA 0.5M, pH 8
Llevar a 1 litro con agua destilada
4. BIBLIO G RAFÍA
 Br uce, A., B. Dennis, J. Lewis, M. Raff, K. Ro berts, J.D. Watson. 1994. Molecular
Bio lo gy of The Cell. Thir d Edition. Gar lan d Publih ing, Inc. N.Y. 1294 pp.
 Nordheim , a., R.E. Herrera, K. Meese, L. Runkel, P.M. Scholten, H. Schröter and
P.E. Shaw. 1988. Str uct ural an d Topological Polymorphism of DNA. In: Kah l, G.

(De.) Architecture of Eukaryotic Gen es. VCH Ver lagsgesellschaft m bH, D-6940
Weinheim . 518 pp.
 Sambrook, J., Fr itsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Clonin g. A Laboratory
Manual. 2nd. Edition. Cold Sprin g Har bor Laboratory Press. N.Y.
 Taiz, L. an d E. Zeiger. 1991. Plant Physiolo gy. The Benjamin/ Cumm ings P ublishin g
Company, Inc. N.Y. 565 pp.
 Doyle, J.J. an d J.L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus
12:13-15.

ANEXO Nº1.
FORMULACIONES DE MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO DE MURASHIGE Y SKO OG (1962)
NO MBRE CONSTITU- CONC. DEL VO L. STOC K CONC. FINAL

YENTES STOC K PARA 1 l EN EL MEDIO
DEL STO CK g/l DE MEDIO mg/l
A NH4 NO3 82.5 20 1 650
B KNO3 95.0 20 1 900
H3BO3 1.24 6.2
KH2PO4 34.00 170.0
C KI 0.166 5 0.83
Na2MoO4.2H2O 0.050 0.25
Co Cl2.6H2 O 0.005 0.025
D CaCl2.2 H2O 88.0 5 440.0
MgSO4.7H2O 74.0 370.0
MnSO4.4H2O 4.46 22.3
E Zn SO4.7H2O 1.72 5 8.6
CuSO4.5H2 O 0.005 0.025
F Na2EDTA 3.72 10 37.2
FeSO4.7H2 O 2.78 27.8
G TIAMINA-HCl 0.08 1.25 0.1
mio-Inositol 100
ácido nicotínico 0.5
piridoxina 0.5
glicina 2.0
SACAROSA 30 g/l
AGAR 8 g/l
o
GELRITE 2 g/l
M EDIO DE MURASH IGE Y SKO OG (RM-1965)

NO MBRE CONSTITU- CONC. DEL VO L. STOC K CONC. FINAL
STOC K PARA 1 lt DE
YENTES MEDIO m l/l EN EL MEDIO
g/l
mg/l
A NH4 NO3 82.5 20 1 650
B KNO3 95.0 20 1 900

H3BO3 1.24 6.2
KH2PO4 34.00 170.0
C KI 0.166 5 0.83
Na2MoO4.2H2O 0.050 0.25
Co Cl2.6H2 O 0.005 0.025
D CaCl2.6 H2O 88.0 5 440.0

MgSO4.4H2O 74.0 370.0
MnSO4.4H2O 4.46 22.3
E Zn SO4.7H2O 1.72 5 8.6
CuSO4.5H2 O 0.005 0.025

F Na2EDTA 3.72 10 37.2
FeSO4.7H2 O 2.78 27.8
G TIAMINA-HCl 0.08 5 0.4

mio-Inositol 100
AGAR 8 g/l
GELRITE 2 g/l

M EDIO B5 DE GAMBO RG
CO NC . DEL V DEL CO NC . FINAL

STOC K g/l STO CK m g/l
ml/l
MACRO NUTRIENTES
KNO3 125.0 20 2 500
MgSO4.7H2O 12.5 20 250
FeSO4.7H2 O 2.78 10 27.8
Na2EDTA 3.36 10 33.6
CaCl2.2 H2O 15.0 10 150
NaH2PO4. H2O 15.0 10 150
(NH4)2 SO4 13.4 10 134
MICRO NUTRIENTES
MnSO4.H2O 1000.0 1 10
H3BO3 300.0 1 3
Zn SO4.7H2O 200.0 1 2
NaMoO4.2H2 O 25.0 1 0.250
CuSO4.5H2 O 2.5 1 0.025
Co Cl2.6H2 O 2.5 1 0.025
KI 75.0 1 0.750
VITAMINAS mg/40 ml
Ac. Nicotínico 20.0 1
Piridoxina 20.0 2 1
Tiamina 200.0 10
Inositol 100 mg/l
Sacaro sa 20 g/l
Cada stock de sales se prepar a separ adamente.
Las vitam inas se preparan en un solo stock y se agregan 2 m l por cada llitro de
m edio.

SO LUC IO N HO AGLAND
MAC RO ELEM ENTO S MO LARIDAD VO LUMEN A AGREG AR

PARA 1 LT DE MEDIO
SO LUCIO NES S TO CK
(ml)
Ca( NO3)2 1M 5
K(NO3)2 1M 5
MgSO4 1M 2
KH2PO4 1M 1
FeCl3 1M 1
MIC RO ELEMENTO S MO LARIDAD VO LUMEN A AGREG AR
SO LUCIO NES S TO CK PARA 1 LT DE MEDIO
(ml)
H3BO3 2.86 g/l 1
MnCl2.4H2O 1.81 g/l 1

ZnCl2 0.11 g/l 1
CaCl2.2 H2O 0.05 g/l 1
Na2MoO4.2H2O 0.025 g/l 1
Para preparar la solución de Hoaglan d se lleva esto a 1 lt y luego se añaden 3 lt de

agua por cada litro de solución m adre.
Se puede usar citrato férrico en vez de clor uro férrico, se prepara una solución con
30.4 g/l (5 m g de Fe/ ml) y se añaden 2 ml por lt de solución m adre.
La solución Fe-EDTA (F) de Murashige y Skoog (1965) puede utilizarse

agregando 2 ml/ lt solución madre.

ANEXO 2
TÉRMINO S UTILIZADO S EN CULTIVO DE TEJIDO S VEG ETALES
ADVENTIC IO . Desarrollo de una estructur a en p untos de origen inusuales, por ejem plo
vástagos o raíces originados de un callo o embriones que no se forman a partir de cigotes.
ANTIBIÓ TICO . Sustancia nat ural, de peso m olecular relativamente bajo, producida por
m icroorganismos, inhiben el crecim iento o destruyen a otros organismos. La toxicidad
generalm ente es selectiva.
ÁPIC E. (shoot tip, stem tip, shoot apex) Comprende el m eristem a y los primordios
foliares.
ASEPSIA. Sin infección o m icroorganismos contaminantes en el cultivo.
BIO TEC NO LO GÍA. Aplicación de principios científicos y de in geniería al

procesam iento de materiales por agentes biológico s para producir bienes y servicio s.
C ALLO (C ALLUS). Un tejido constituido por células dediferenciadas generalm ente

producido como resultado de heridas o al cultivar un explante in vitro.
C EPA C ELULAR. Una cepa celular se deriva ya sea de un cultivo primario o de una
línea celular por la selección o clonaje de células que tienen propiedades o marcadores
específicos. Al describir una cepa celular, deben definir se sus características específicas.
C LÓ N. Grupo de organism os genéticamente idénticos producido por proceso asex ual o

sexualmente por autopolinización (inbreeding) de líneas puras. En cultivo de células
procarióticas o eucarióticas, el térm ino clón es em pleado para describir un a población de
células descen dientes de un solo pro genitor. En biolo gía m olecular se utiliza para copias
m últiples de secuencias idénticas de DNA que son pro ducidos cuando son insertados
dentro de un vehículo como un plásmido u otros vectores.
C RECIMIENTO . Aum ento irreversible en el tamaño, volum en o longitud, el cual

generalm ente es acompañado por un increm ento en peso seco y en la cantidad de
protoplasma. Generalmente el crecim iento incluye división y alargamiento celular.
C ULTIVO DE TEJIDO S VEG ETALES. Mantenimiento o crecimiento de células

vegetales, tejidos, ór ganos o plantas com pletas in vitro. El cultivo de tejido s vegetales son
una serie de métodos que se utilizan en la m ultiplicación y mejoramiento de plantas y
actualmente se emplean para hacer estudios fisioló gicos, bio quím icos, de m orfogénesis,
anatomía, etc.
C ULTIVO DE CÉLULAS. Este término es usado para denotar el crecim iento de células
in vitro incluyen do el cultivo de células aisladas. En los cultivos celulares, las células ya
no están organizadas en tejidos.
C ULTIVO DE Ó RGANO S. Es el mantenimiento o crecimiento de primordio s de

órgano o del total o partes de un órgano in vitro de tal m odo que p ueda permitir la
diferenciación y preservación de su arquitectura y función.

C ULTIVO AXÉNICO . Es un cultivo sin form as de vida foráneas in deseables. Un
cultivo axénico puede incluir el cocultivo de diferentes form as celulares, tejidos u
organism os, con fines específico s.
DES INFEC TANTE. Un agente químico o físico que elim ina la infección de una planta,
órgano o tejido.
DIFERENC IAC IÓ N. Es la transform ación de células ap arentem ente genéticam ente

idénticas todas originadas del cigote u otra célula única, en células diver sificadas con
varias esp ecializaciones bio quím icas, fisioló gicas y estructurales. Es la suma de procesos
por los cuales se adquiere o se pier den competencias metabólicas específicas y se
distinguen las células hijas entre sí o de su célula progenitora. Dif erenciación celular es la
pérdida progresiva de los caracteres citológico s y fisiológicos de las células embrionarias
y adquisición de las características de células adultas, eventualmente ligada a la
especialización.
DEDIFERENCIAC IÓ N C ELULAR. Regresión pro gresiva de células diferenciadas

hacia el estado meristemático. Las células desdiferenciadas, al igual que las células
m eristem áticas, presentan ciertas características citológicas de las células embrionar ias,
tales com o: vacuom a reducido, relación núcleo/citoplasma elevada, plastidios poco
diferenciados. Estas células reco bran la aptitud para dividirse y pueden ser capaces de
expresar su totipotencia rediferenciándo se para pro ducir em briones y órganos.
DIFERENC IADO . Células que m antienen en cultivo todo o m ucha de la estructura

especializada y función típica del tipo celular in vivo
DES ARRO LLO . Denota los cambios pro gresivos en tam año, estructura, y función, los
cuales co lectivam ente comprenden la transform ación de un cigóte en una planta madura
reproductiva. Se suele h ablar del desarrollo de órganos particular es a partir de estruct uras
iniciales o primordios. Puede decir se que el desarrollo es un proceso gr adual que tom a
tiempo para lograrse com pletam ente, generalm ente está acompañado por increm entos en
peso y tamaño, involucra la apar ición de n uevas estructuras y fun ciones y la pér dida de
las originarias, se caracteriza por discontinuidades tem porales y espaciales y cam bios en
la velocidad, y eventualm ente disminución de la velocidad o detención cuando se
alcanzan las dim ensiones maduras. El desarrollo involucra tanto crecim iento como
diferenciación. El crecimiento es utilizado par a denotar los cam bio s cuantitativos que
ocurren durante el desarrollo. La diferenciación se aplica a lo cambios cualitativos.
EMB RIO GÉNESIS. Proceso de iniciación y desarrollo del em brión. Em briogénesis

somática. Proceso de iniciación y desarrollo del em brión a partir de células vegetativas o
no gaméticas.
ENZIMA. Proteína capaz de catalizar una reacción. Es una sustancia, la cual en

cantidades m ínim as promueve el cam bio quím ico sin que ella mism a sea usada en la
reacción, en virtud de su po der par a increm entar la reactividad de una o unas sustancia(s)
específica(s) llam ada sustrato.
EPIG ENÉTICO (EVENTO). Cualquier cam bio en el fenotipo que no resulta de una
alteración en la secuencia de DNA. Este cam bio puede ser estable y her edable e in cluye la

alteración en la metilación del DNA, activación transcripcional, control traduccional y
m odificaciones post-traduccionales.
ETAPA I. Paso de la propagación de p lantas in vitro, caracterizado por el establecimiento

de un cultivo aséptico.
ETAPA II. Paso de la propagación de p lantas in vitro, caracterizado por el aum ento
rápido en el n úm ero de ór ganos u otras estructuras.
ETAPA III. Paso de la propagación de plantas in vitro, caracterizado por la preparación

del propágulo para su transferencia al suelo; proceso que com prende el enraizam iento de
los vástagos, el endurecimiento de las plantas y la iniciación del cam bio del estado
heterotrófico al estado autótrofo.
ETAPA IV. Paso de la propagación de plantas in vitro, caracterizado por el

establecimiento en el suelo de una planta derivada del cultivo de tejidos.
EXPLANTE. Pequeño segmento escin dido de la planta (ápice, órgano, fragm ento de
órgano o de tejido), usado par a el inicio de un cultivo in vitro.
FRIABILIDAD. Término que indica la ten dencia a separarse unas de otras en las células
vegetales es cultivo.
G AM ETO C LÓ N. Plantas regeneradas de cultivos celulares derivados de meiosporas,

gametos o gametofitos.
G ERMO PLASMA. Variabilidad genética total presente en una especie cultivada y sus
especies silvestres.
H ABITUAC IÓ N: La habilidad adquirida por una población de células, de crecer y

dividir se indepen dientem ente del suministro de reguladores de crecimiento exógenos.
H IPERH IDRIC IDAD: Anorm alidades anatómicas y morfológicas de los tejidos

cultivados in vitro que les dan un aspecto vidrio so o traslúcido, y originadas por una
acum ulación inusual de agua en el apoplasto. Anteriorm ente a esta anorm alidad se le
denom inaba vitrificación.
HO RMO NA VEG ETAL (FITO HO RMO NA). Sustancia or gánica que no es un

nutriente (una sustancia que sum inistra carbono y energía o elementos m inerales
esenciales), activa en cantidades muy pequeñas (< 1 m M, a m enudo < 1 mM), la cual se
forma en ciertas zonas de la planta y que usualmente es transportado a otros sitios, donde
evoca respuestas bio químicas, fisio lógicas y morfológicas específ icas. Las horm onas
vegetales son activas en los tejidos donde son producidas así com o a distancia. Las
horm onas vegetales, promueven, inhiben o m odifican el crecim iento y desarrollo. Las
clases más comúnmente conocidas de horm onas son las auxinas, giberelinas, citoquin inas,
el ácido abscísico y el etileno.
INDUCC IÓ N. Iniciación de una estruct ura, órgano, o proceso in vitro.
IN SITU. en su lugar de origen (latín).

IN VIVO . proceso que ocurre en un or ganismo viviente intacto.
IN VITRO . Cultivo de parte de un organismo o m icroorganism os en v idrio. Por ejem plo:

en tubos de ensayo o en frascos, en un m edio artificial y bajo condiciones asépticas.
JUVENILIDAD. Los ciclo s de vida de muchas especies perennes incluyen dos fases en
las cuales ciertas características morfológicas y fisiológicas son diferentes. Desp ués de la
germinación, la m ayoría de las plántulas perennes entran a una fase de crecim iento rápido
en la cual usualm ente la floración no puede ser in ducida. Una m orfología característica,
evidente especialmente en la forma de las hojas, se produce a veces durante este tiempo.
Las p lantas que tienen estas características se dice que están en fase juvenil, en oposición
a la fase m adura o adulta.
LIBRE DE VIRUS. Planta libre de vir us específicos, esta denominación se basa en la

aplicación de tests diseñados par a detectar la presencia de dichos or ganism os.
LINEA CELULAR. Una línea celular sur ge de un cultivo prim ario en el m om ento del
primer subcultivo exitoso. El térm ino línea celular implica que los cultivos de ella
consisten de linajes celulares originalmente presentes en el cultivo prim ario.
M ERISTEMO IDE. conjunto de células par ecidas a las del m eristem a que se encuentran
en una zona de la planta que no es la usual ( generalm ente en un callo) y tienen la
capacidad potencial de originar prim ordios.
M ERISTEMA. Extrem o distal del tallo o de la raíz. Tejido de células indiferenciadas, las
cuales se dividen continuamente y se diferen cian en tejidos especializado s. El tejido
m eristem ático es pues un tejido em brional del que se form a otros tejido s adultos y
diferenciados de diversas m aneras. El cultivo de meristemas forma una especialidad en
la propagación in vitro.
MIC RO PRO PAGACIÓ N. propagación clon al in vitro de plantas a partir de áp ices de

vástago o explantes nodales, usualm ente con una proliferación acelerada de vástago s
durante lo s subcultivos.
MO RFO GÉNESIS. Es la integración y coordinación de lo s eventos de crecim iento y

diferenciación que ocurren e nivel celular y es el proceso que explica el origen de los
caracteres morfológicos y la forma global.
MIC RO PRO PAGACIÓ N. Propagación clonal in vitro de plantas a partir de ápices de

vástago o explantes nodales, usualmente con una proliferación acelerada de vástagos
durante los subcultivos. ( Definición de “The Society for In Vitro Biolo gy”
(http://sivb.or g/edu_term inology.asp)
NUTRIENTE. Elem ento o com puesto necesario para la supervivencia de un organismo,

provee energía y material de crecim iento. Los nutrientes se clasifican en macronutrientes
y micronutrientes.
Ó RG ANO . Parte m ulticelular de un animal o planta el cual forma una unidad estructural
y funcional. Ej. hoja, raíz, etc.

O RG ANO G ÉNESIS. En cultivo de tejido s vegetales, un proceso de dif erenciación por
el cual se forman órganos de la planta de novo o de estruct uras pre-ex istentes. En la
biolo gía del desarrollo, este término se refiere a la diferenciación de un sistem a de
órganos desde células precursoras.
PATÓ G ENO . Microorganismo que causa enfermedad.
PRO TO PLASTO . Son células vegetales en las cuales la p ared celular ha sido eliminada
completamente por métodos físicos o quím ico s. Fusión de protoplastos. técnica por la
cual los protoplastos son fusionados en una sola célula.
PRIMO RDIO . Estado todavía rudimentario de un órgano que empieza a form arse.
PRO PAGAC IÓ N VEG ETATIVA. Reproducción de planta usando proceso s no

sexuales que involucran el cultivo de partes de la planta como cortes de tallo u hojas.
REC ULTIVO . Proceso por el cual un explante o tejido vegetal, m onocapa celular, etc. es
transferido a un m edio fresco sin ser subdividido.
REG ENERACIÓ N. En cultivos de plantas, es una resp uesta m orfogenética a un

estím ulo que resulta en la pro ducción de ór ganos, embriones, o plantas com pletas.
SENESC ENCIA. Se refiere a los procesos de deterioro colectivo y progresivo que

culminan en la m uerte de un órgano u or ganism o.
SUBCULTIVO . Es el proceso por el cual el tejido o explante es primero subdiv idido y

luego transferido a m edio de cultivo fresco.
TEJIDO . Trama celular, de m uchos tipos, de los cuales están hechos los organismos.
Cada tipo de tejido consiste generalmente de células del m ism o tipo (que llevan a cabo la
m ism a función), agr upadas en gran cantidad con un arreglo característico.
TO TIPO TENC IA. Un a característica celular en la cual se retiene el potencial para

formar todos los tipos celulares de un or ganism o adulto.
VARIAC IÓ N SO MACLO NAL. Las plantas regener adas de células somáticas

utilizando cultivo de tejido s no son genéticamente uniform es sino que presentan una
significativa variabilidad gen ética. Esta variabilidad ha sido llam ada v ariación
somaclonal.
VARIANTE. In dividuo que presenta caracteres fenotípicos o genotípicos, hereditarios o

no, diferentes a lo s restantes individuos del clón al que pertenecen. Variación no prejuzga
la naturaleza a diferencia de mutación.
VIRUS. Parásito obligado, sub-m icroscópico con stituido de ácido nucleico (DNA ó
RNA) y proteína. Usualm ente m anifiesta su presencia causando enferm edad. Son
incapaces de multiplicar se f uera del tejido hospedero.

YEMA. Rudimento de un vástago, que se form a habitualm ente en la axila de las hojas y
suele estar protegida por una serie de catáfilo s. Este tipo de yem a se llama axilar, para
diferenciarla de la yema term inal del vástago, constituida por el punto vegetativo y por las
hojitas jóvenes m ás próximas, que, dotadas de rápido crecimiento, se comban sobre él.
G LO SARIO
ADN RECO MBINANTE
BIBLIO TEC A DE DNA. Es un conjunto de fragmentos clonados de DNA que en su

totalidad representan el genoma com pleto de un or ganismo.
BIBLIO TEC A DE cDNA. Secuencias de DNA clonadas deriv adas de la transcripción

reversa de todos los mRNAs de un organism o.
cDNA. Es un DNA de cadena simple complem entario a un RNA.
C EBADO R ("PRIMER"). Es una secuencia corta (a m enudo de RNA) que se aparea

con una hebra de DNA de cadena sencilla y que provee un extremo 3'-OH en el cual la
DNA polimerasa inicia la síntesis de una caden a de desoxiribon ucleótido.
C ISTRÓ N. Un segm ento de DNA que especifica una cadena de polipéptido en la síntesis
de proteína.
C LÓ N. Se denomina así a un gran núm ero de células o moléculas

todas idénticas a una molécula ancestral.
C LO NAJ E. El clonaje de un fragm ento de DNA perm ite producir cantidades in defin idas
del fragm ento.
DES NATURALIZACIÓ N. del DNA o RNA describe la separación de las dos cadenas
de una m olécula duplex de DNA; con frecuencia la separación de las cadenas se logra por
calentam iento. Desnaturalización de una proteína describe su conversión desde la
conformación fisiológica a alguna otra conform ación (inactiva).
DNA RECO MBINANTE. Conjunto de procedim ientos por los cuales se r econstruyen
m oléculas de DNA por unión de secuencias de f uentes diferentes.
DNA SATÉLITE. Consiste de muchas repeticiones en serie (idénticas o relacionadas) de

una unidad básica corta repetitiva.
"DOWNSTREAM". (corriente abajo). Son las secuencias de DNA que se encuentran

después del p unto de iniciación de la transcripción de un gen, la transcripción usual del
m RNA se hace en sentido 5' a 3'. Norm alm ente la transcripción o curre de izquierda
("upstream") a derecha ("do wnstream"). Identifica secuencias que se encuentran más allá
en la dirección de expresión; por ejem plo, la región co dif icante de un gen está
"down stream " desde el co dón de iniciación.

ENZIMAS DE RES TRICCIÓ N. Enzimas aisladas principalmente de procariotes, que
reconocen secuencias cortas específicas dentro de la doble cadena de DNA y clivan la
do ble cadena.
EXÓ N. Cualquier segm ento de un gen interrumpido por intrones, que está representado
en el producto del RNA maduro.
INTRÓ N. Una secuencia de n ucleótidos de un gen eucariótico que no aparece como

m RNA. Los intrones interrumpen las secuen cias co dificantes (exones). Segmentos de
DNA que se transcriben pero son removidos del interior del tránscrito empalm ando las
secuencias (exones) que están a cada lado de él.
G EN. Es el segm ento de DNA que está involucrado en la producción de un a cadena de

polipéptido y al cual se le asigna una f unción. Incluye las regiones que preceden y siguen
la región codificante así com o las secuen cias intervinientes (intrones) entre los segmentos
individuales (exones).
G EN Q UIM ÉRICO. Genes com puestos de promotores de un origen, y secuencias

codificantes de otro y secuen cias 3' de un tercer organismo.
H ÍBRIDO . Un organism o o célula com o resultado de un cruce o fusión de dos padres o

células genéticam ente diferentes.
ING ENIERÍA G ENÉTICA. Alteración del material hereditario de un or ganismo por

técnicas de DNA recom binante de modo que se lleven a cabo f unciones específ icas. El
producto obtenido al aplicar procedim ientos para reconstruir m oléculas de DNA por
unión de secuencias de f uentes difer entes se llama DNA recom binante, y las técnicas son
llamadas ingeniería genética.
kb. Es una abreviatura para 1000 pares de bases de DNA o 1000 bases de RNA.
LOC US. Es la po sición de un crom osoma en el cual reside el gen para una característica
particular; un locus puede estar ocupado por cualquiera de los alelo s del gen.
MARCADO R G ENÉTICO . Térm ino utilizado para denominar genes de interés.
MARCO DE LEC TURA ABIERTO . ("open reading frame"). Secuencia de nucleótidos

en el DNA donde no se encuentran codones de term inación de la transcripción, donde los
tripletes sucesivo s de n ucleótidos pueden ser leídas como codones que especifican
aminoácidos. Secuencia (potencialm ente) traducible a proteína.
MAPA DE RES TRICC IÓ N. Es un un "m apa" que r epresenta el arreglo lineal de sitios
de corte de varias enzimas de restricción so bre una cadena de DNA.
MAPEO GENÉTIC O . Demarcación de la po sición de un gen a lo largo de una cadena

de DNA o de un crom osoma.
MUTAC IÓ N. es el cambio en la secuencia del ADN. El organism o que lleva el gen

alterado se llama mutante.

NO RTH ERN "BLO T". Es una técnica para transferir RNA desde un gel de agaro sa a
una m atriz sólida en el cual p uede se hibr idizado con un DNA com plementario.
PAR DE BASES (bp). es una asociación de A con T o de C con G en una do ble hélice de
DNA; otros pares son posibles en el RNA bajo ciertas circunstancias.
PCR. (Reacción en cadena de la polim erasa). Es la m ultiplicación de un fragm ento de

DNA a partir de un par de cebadores o "primers" (oligonucleótido) en ciclos r epetidos por
acción de una DNA polimerasa termoestable llam ada Taq polim erasa. Representa una
forma de clonaje molecular sin células.
PLÁSMIDO . Es un DNA circular extra cromosóm ico autónom o y autorreplicativo.
PRO MO TO R. Es una región del DNA involucrada en la un ión de la RNA polimerasa

para iniciar la transcripción, por lo cual representa un punto crítico en el control de la
expresión genética.
REPETICIO NES DIREC TAS. Secuencias de DNA idénticas o estrecham ente

relacionadas presentes en dos o más copias en la misma orientación en la m ism a
m olécula:
Ejem plo:
5' AGTCA.................AGTCA 3'
3' TCAGT.................TCAGT 5'
RFLP. (" Restriction Fragment Lenght Polymorphisms"). Se ref iere a las diferencias en el
DNA que alteran los sitios de r estricción de enzimas. Por ejem plo, el cam bio de bases en
el sitio diana de una enzima de r estricción causa que al hacer el clivaje de esta cadena de
DNA con dicha enzima, los fragm entos resultantes tengan diferentes tamaños, lo cual
puede evidenciar se al separar dicho s fragmentos en un gel.
RAPD. (" Ran dom Amplified Polym orphic DNA"). Amplificación al azar de segmentos
de DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (P CR) con cebadores de
secuencias ar bitrarias de nucleótido s.
REPETICIO NES INVERS AS. Comprende dos copias de la misma secuencia de DNA
repetidas en orientación opuesta en la m ism a m olécula. Las repeticiones adyacentes
invertidas con stituyen un palíndrom e.
SECUENCIA CO NSENSO . Es una secuencia idealizada en la cual cada posición

representa la base encontrada m ás frecuentem ente cuando se com paran muchas
secuencias reales.
TERMINADO R. Es una secuencia de DNA, que le in dica a la RNA polim erasa la

terminación de la transcripción.
TRANSC RIPTASA REVERSA. Una enzim a que sintetiza DNA usan do RNA como
templado. Las tecnologías de DNA r ecom binante la utilizan para la síntesis de DNA
complem entario (cDNA) a partir de mRNA.

SO UTH ERN (Transferencia por el m étodo Southern, "So uthern blot"). Describe el
procedim iento para transferir DNA desde un gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa,
donde puede ser hibridizado con un ácido nucléico complem entario.
TRANSFO RMACIÓ N. En cultivos celulares de plantas, la introducción e integración

genóm ica estable de DNA foráneo en una célula vegetal por algún m edio, resultando en
una m odificación genética.
TRANSG ÉNICO . Son todos aquello s organismos superiores que han sido modificados
genéticam ente por ingeniería gen ética.
TRANSPOSÓ N. (elem ento transponible). Segmento discreto de DNA que es capaz de

replicarse o escin dirse e in sertarse en una nueva posición del genoma. (segmentos de
DNA que tienen la capacidad de cam biar su posición en el genoma).
"UPS TREAM" (corriente arriba). Son las secuencias de DNA que se encuentran antes
del punto de iniciación de la transcripción de un gen, la transcr ipción usual del m RNA se
hace en sentido 5' a 3'. I dentifica secuencia que se encuentran en dirección opuesta a al
expresión.
"WESTERN B LO T". Técnica análoga al Southern, la cual luego de la separación de

proteínas por electroforesis en un gel, las transfiere a una m atriz donde son inmobilizadas,
y luego son visualizadas utilizando sondas inm unológicas marcadas con radioactividad o
fluorescencia.

ANEXO N3
TRADUCC IO N DE ALG UNO S TERMINO S USADO S EN LA BIB LIO GRAFIA

SO BRE C ULTIVO IN VITRO
Axilar axilar Measurem ent medida

Blade lámina u hojilla Main principal
Bud yema Mature maduro
Branches ramas Night noche
Glasshouse invernadero Nodal (node) nudo
Culture cultivo Output producción
Clean lim piar, limpio Overgrown sobrecrecimiento
Cut cortar Only solamente
Check verificar Plants plantas
Container depósito Planting transplantar
Culture m edia m edio de cultivo Placed colocar
Dispense distribuir Pot maceta
Dip sumergir Plasticware material de plástico
Develop desarrollo Petri dish placa de Petri
Embryo em brión Primordium (dia) primordio(s)
Excised seccionar Root raíz
Explant explante Rot pudrición
Field campo Rinse enjuagar
Fresh fresco Supply sum inistro
Flask frasco Surface superficie
Growth crecer Shoot vástago
Glass vidrio, cristal Stem tallo
Gr eenhouse invernadero Set conjunto
Hood campana Sh ipm ent enviar
Harden dureza Seedlin g plántula
Leaf hoja de la planta Seed sem illa
Leaflet folíolo Size tam año
Labware m aterial de laboratorio Shaker agitador
Tissue culture cultivo de tejidos
W ash lavar

Papa Crisantemos
Papa
GUIA DE INFORMES
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

GUÍA DE INFORME
PRÁCTICA Nº2
Inducción de embriogénesis somática

1. Realice observacion es de lo s cultivos en el micro scopio estereoscópico cada 2 sem anas
y lleve a cabo un registro, de acuer do a las indicaciones que encontrará a contin uación:
a. Evalúe la magnitud del cr ecimiento mediante una escala cualitativa y rellen e
el cuadro siguiente:
S EM ANA MEDIO 1 MEDIO 2

2
4
6
MEDIO 1 MEDIO 2
(sin hormonas) (sin hormonas)
8
10
12
14
Escala a utilizar: 0 = no crecim iento

+ = muy poco crecim iento
++ = crecim iento intermedio
+++ = m ucho crecim iento
b. Cada dos sem anas, tome nota de las siguientes características de lo s cultivos:
b1. Color ación
b2. Presencia de tran sformaciones hiperhídricas
b3. Presencia de p seudotalos
b4. Consistencia del callo (fr iable o com pacto)
b5. Presencia de embrion es somáticos:
b5.1. Describir m orfológicamente lo s embr iones
b5.2. Contar el n úmero de embrion es por explante

NOTA: Preste atención al tiem po de cultivo en el cual se comenzaron a
observar los embrion es somáticos.
3. Elabore un esquem a del proceso de embrio génesis som ática in directa observada,
indicando y describien do brevem ente cada fase del mismo. Indique tam bién la
secuencia temporal de lo s eventos descritos.
4. Explique la inf luencia de las horm onas vegetales en el proceso de em brio gén esis
somática in directa.

GUÍA DE INFORME
PRÁCTICA Nº 3
Organogénesis
1. Realice observacion es de los cultivo s de callo de tabaco en el microscopio
estereo scópico cada 2 sem anas y lleve a cabo un registro, de acuer do a las
indicaciones que encontrará a continuación :
a. Evalúe la magnit ud del crecimiento del callo mediante una escala cualitativa.
b. Cam bio s m orfológicos en el callo: Consistencia (friable o com pacta),
coloración, presencia de pseudotalo s, presen cia de transform aciones
hiperhídricas.
c. Presencia y cantidad de brotes y/o raíces. En este caso anote aparte sus
características morfológicas.
Para facilitar el registro de las o bservaciones en la tabla, utilice las abr eviat uras
siguientes:
Cuantifique el crecim iento desde 0 h asta +++
TH = presencia de transform ación hiperhídrica
CF = callo friable, CC = callo compacto (no friable)
V = color ver de, M = color crem a
PT = presencia de p seudotalo s
B = presencia de brotes, ( ) indicar entre par éntesis la cantidad
R = presencia de r aíces, ( ) in dicar entre paréntesis la cantidad
Ta bla 1. Cultivo de callo de tabaco
S EMANA M EDIO 1 MEDIO 3 MEDIO 4 MEDIO 5
(control)
2
4
6
8
10
12
14

2. Relacione la com posición de los medios de cultivo con las r espuestas observadas en
los tejido s. Compare los resultados con los reportados por Skoog y Miller ( ).
3. Realice o bservaciones de los cultivos de secciones de hoja de Begonia en el
microscopio estereoscópico cada 2 sem anas, y lleve a cabo un registro en la tabla
que se suministra a continuación. Destaque el tiempo de aparición de los brotes, el
número de brotes por explante y sus características morfoló gicas.
Ta bla 2. Cultivo de secciones de hoja de Begonia
SEMANA OBSERVACIO NES

2
4
6
8
10
12
14
4. So bre la base de lo s resultados observado s en la tabla 2, describa la secuencia de

fases en el proceso de or gano gén esis directa.
5. Complete la siguiente tabla con los valores de peso fresco y p eso seco determinados
durante la práctica:
Ta bla 3. Peso fresco (PF) y peso seco (PS) de los callos de tabaco crecidos en
diferentes medios de cultivo.
SEMANA 1 Medio 1 Medio 3 Medio 4 Medio 5
1
2
3
4
5
6

6. Con lo s datos de la Tabla 3 elabore un gráf ico par a cada parám etro (PF, P S) y en
cada uno dibuje las curvas de cr ecim iento para cada medio de cultivo.
7. Interprete el gr áfico elabor ado en el p unto 6 y com pare el efecto de la com posición
de los medios de cultivo sobr e el crecim iento de los cultivos.
8. ¿Cuál de los p arám etros m edidos considera usted m ás aprop iado para evaluar el
crecim iento de lo s tejido s?. ¿Considera usted que lo s m étodo s utilizados son
igualm ente apropiado s para estim ar el crecimiento en otros sistem as de cultivo in
vitro (cultivo s en susp ensión, em br iones cigóticos, microesquejes, raíces, etc.)?

GUIA DE INFORME
PRÁCTICA Nº 6.
Extracción de proteínas en tejidos vegetales

cultivados in vitro .
1. Durante la realización de la práctica, com plete el siguiente cuadro con sus dato s.
Muestra D.O . g de Proteína Volumen de Proteínas Volumen de

en 100 l sobrenadante Totales en la acetona para
(ml) muestra precipitar
(g) (ml)
2. Co loque lo s v alores calculados en la pr áctica, proteína total por m uestra, volumen de

resuspensión de las proteínas, y el vo lum en de car ga en el gel:
Muestra g de proteína total Volumen de Volumen de
en la muestra Resuspensión C arga
(l) (l)
NO TA: recuerde tomar nota del or den en el cual cargó los estándares de peso m olecular
y las m uestras en el gel.
3. Anexe a este inform e una fotocopia de la foto del gel obtenido en la práctica, y
señale en dicho gel lo siguiente:
a. Al lado de cada ban da correspon diente a los estándares de peso molecular, indique
su peso.

b. En la parte superior de cada carril del gel, in dique el nom br e de la muestra
correspon diente, puede asignarle un n úmero o letra a cada m uestra, y h acer una
leyen da en la cual se defina que significa cada n úm ero o letra.
4. Una vez r ealizada la electroforesis y teñido el gel, mida la m ovilidad relativa de las
ban das de estándares de peso m olecular y elabore un gráf ico en papel semilo g, en el
cual el eje Y (en escala no lo gar ítmica) sea la m ovilidad r elativa en centímetros
(distancia desde el or igen del gel hasta el centro de la ban da), y el eje X (escala
logarítmica) sea el peso molecular cono cido de la proteín a. Este gráfico sirve p ara
estimar el peso m olecular de un a proteína de acuer do a su m ovilidad relativa en un
gel.
5. Observe las ban das en el gel y compare los patrones obtenido s con los dif erentes
tejido s, o bserv e dif erencias respecto a presen cia y ausen cia de ban das y tam bién
dif erencias en intensidad de las ban das.
6. Calcule el peso m olecular de las bandas predominantes utilizan do par a ello la
ecuación de la gráfica elaborada en la sección 4 de esta guía.
7. Responda las siguientes preguntas:
a. Tomando en cuenta las condiciones de extracción y sep aración electroforética de
proteínas utilizadas en esta práctica, ¿Qué propiedades inf luyen en la movilidad
de las proteínas durante la electroforesis en geles de poliacrilam ida?
b. Explique algunas aplicaciones de los método s de proteínas en estudios de cultivos
de tejidos v egetales.
c. ¿Qué ventajas y desventajas tiene la utilización de patrones de proteínas e
isoenzimas en estudio s de clasificación de v ariedades de plantas?

GUIA DE INFORME
PRÁCTICA Nº 7
Extracción de A DN vegetal
EXPERIMENTO 3.2.
1) Anexe una fotocopia de la fotograf ía del gel de agarosa luego de la corrida
electroforética, y señ ale los siguientes aspectos:
a- Identifique cada carril del gel.
b- El peso m olecular (p b) de las ban das del marcador de peso molecular utilizado
c- El peso molecular (p b) aprox imado del ADN extraído.
2) Discuta so br e la cantidad de ADN genómico en plantas superior es.
3) Discuta acerca de la integridad y p ureza del ADN extraído y relacion e lo o bservado
con el paso o) del protocolo, exper imento 3.1.
4) ¿Cóm o podría Ud. calcular la concentración aproximada de ADN en el extracto
utilizando sólo la corrida electroforética?
5) ¿Qué propiedades influyen en la movilidad de los ácidos n ucleico s en la
electroforesis en geles de agarosa?
1) Complete la siguiente tabla.
Muestra DO 260 DO 280 C oncentración
(g/m l)
2) Calcule la concentración de ADN en la muestra con las m edidas o btenidas en el

espectrofotómetro.
3) Discuta so br e la p ur eza de la pr eparación.
4) Explique brev em ente alguno s de los m étodos que Ud. conoce para analizar el ADN
vegetal una vez que se ha r ealizado la extracción y purificación del m ism o.

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Guia de Cul tivo de Tejid os Vegetales Page 0

Indice General……………… ………… ………………… ………………………… ……………….. 1

Práctica N2 Inducción de Embriogénesis Somática................................ 14

Práctica N3 Organogénesis............................................ ...................... 16

Práctica N4 Cultivo de Yemas y Microesquejes......................... .......... 18

Práctica N5 Cultivo de Embriones Cigóticos...................................... . 20

Práctica N6 Extracción de Proteínas.................................... .... 22

Práctica Nº 7 Ext racción de ADN 31

Anexo 1. Formulaciones de Medi os de Cultivo.............................. 38

Anexo 2. Términos utilizados en Cultivo de Tejidos Ve getales...... 42

Anexo 3 Traducción de Términos............................ .................... 51

Guia de Informes……………………… ………………………… ………………… ………… …. .52

Guía de informe para la práctica Nº2 .......................... ......................... 53

Guía de informe para la práctica Nº3................ .................................. . 55

Guía de informe para la práctica Nº6................ .................................. .. 58

Guía de informe para la práctica Nº7................ .................................. . 60

Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales Page 1

Cultivos de Tejidos Vegetales.

a. Term inología. b. Historia. c. Conceptos de Determinación, Competencia,

Tema 2: Factores que influyen en el crecim iento y desarrollo de los cultivos

2.1. Factores extrínsecos

c. Condiciones físicas del cultivo y de los medios: m edios de soporte, pH,

Tema 3: Procesos de rediferenciación.

c. Micropropagación: concepto, ventajas y desventajas. Fases y aplicaciones.

Tema 5: Suspensiones celulares.

Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales Page 2

b. Método s de transform ación en p lantas.

d. Aplicaciones de la In geniería Gen ética en el fitomejoramiento.

Tema 10: Marco legal de la Biotecnología. Bioética y Bioseguridad.

TEO RÍA (65 %) PRÁC TIC A (35 %)

Cada parcial= 17% Inform es= 15%

Seminario teórico= 14% Proyecto= 20%

Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales Page 3

AIA (I AA) Acido Indol Acético

ABA Acido Abscísico

ANA (NAA) Acido Naftalenacético

2,4-D Acido 2,4-diclorofenoxiacético

GA3 Acido giberélico

IBA Acido Indolbutírico

MS Sales minerales según formulación de Murashige y Skoog

Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales Page 4

Preparación de medios de cultivo.

del sistem a radical. El dióxido de carbono atm osférico es utilizado en el proceso de la

crecim iento esenciales para su crecim iento y desarrollo normal.

propios carbohidratos, la m ayoría de las vitaminas, y las sustancias de crecimiento

naturaleza deben ser sum inistradas artificialmente a los tejidos cultivados.

El establecim iento y crecimiento exitoso de un tejido vegetal in vitro, generalm ente

varios factores am bientales (luz, tem peratura, etc.).

Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales Page 5

PRO CEDIM IENTO PARA LA PREPARAC IO N DE LO S MEDIO S DE CULTIVO .

1- Añada una porción de agua destilada a un m atraz aforado

2- Las sales (m acro y micronutrientes están preparadas en form a concentrada y se

almacenan en la nevera (4oC).

Añada las soluciones de sales en el orden y volum en indicado s, haciendo los

cálculos de acuer do al volum en de m edio que se va a preparar.

4- Pesar el mio-Inositol, disolverlo en una pequeña cantidad de agua destilada y

5- Pese la sacarosa, disuélvala en agua destilada y añádala al medio.

Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales Page 6

agréguelo al medio correspondiente.

hasta el volum en deseado.

8- Ajuste el pH a 5,8 con NaOH ó HCl.

respectivamente y añádalo al medio.

reparta el m edio en envases adecuado s previamente rotulados: tipo de m edio,