Ingeniería

genética
 4. INGENIERÍA GENÉTICA
4.1 Electroforesis en gel
-Southern blot
-Northern blot
-Western blot
 
4.2. Tecnología del ADN recombinante
-Enzimas de restricción y vectores de clonación
-Genotecas de ADN
-PCR
-Técnicas moleculares para análisis de ADN
-Secuenciación del ADN
 
4.3. Microarreglos
 Clonación molecular

Objetivo ! Aislar un gen o una secuencia de DNA y amplificarlo para su

estudio. Se pueden producir grandes cantidades de copias idénticas de
esa molécula específica de ADN.

Enzimas de
restricción
Vectores

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.
(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
 Enzimas de
Restricción

Endonucleasas

(Klug, 2013. Conceptos de genética.)

 Sitios de corte localizados en
zonas desfasadas por algunas
bases en cualquier dirección !
cadenas de DNA con extremos
cohesivos
Sitios de corte localizados de
manera inmediatamente
opuesta entre si ! a cadenas
de DNA con extremos romos
 Reconoce la
secuencia especifica
de seis bases 5’-
GAATTC-3

Las secuencias reconocidas

son generalmente
palíndromos

NOTA: Una Ez de restricción

puede tener varios sitos de
corte en un genoma.

EcoRI corta el DNA en este EcoRI ! 1 millón de

sitio de restricción entre la G y la A ! fragmentos de longitudes
dos fragmentos, cada uno con un
variables
segmento de cadena simple 5’-AATT-3’
de cuatro
bases en su extremo.
(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
 Existen diversas enzimas de restricción

Bacillus amyloliquefaciens

Echerichia coli

Haemophilus influenzae

Haemophilus aegyptius

Providencia stuartii

Serratia marcescens
 ¿Qué se requiere
ADN recombinante = ADN 1 + ADN 2 para crear ADN
recombinante?
 Vectores

Hay disponibles varios

vectores, que difieren en
las células huésped en
las que pueden
introducirse y en el
tamaño de los insertos
que pueden transportar,
pero la mayor parte de
los vectores de ADN
exhiben varias
p r o p i e d a d e s
fundamentales comunes:

(Klug, 2013. Conceptos de genética.)

 Vectores

▪Molecula de DNA que puede replicarse de manera

autónoma en una célula anfitriona (levadura / bacterias)
▪Puede ser aislado en forma pura para ser analizado
▪Tras la inserción de un fragmento de DNA humano en un
vector por acción de la DNA
▪ligasa, el ADN Recombinante puede ser introducido en el
huésped ! Propagación ADN de interés + Vector
▪¿Por qué se usan levaduras y bacterias?

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 Vectores utilizados para clonar

Plásmidos (25kb)
Fagos (25kb, 1000X eficientes)
Cósmidos (45kb)
YAC (2 Mb, baja eficiencia de transformación)
BAC
Plásmidos
Moléculas de DNA circular de doble cadena presentes en bacterias y
levaduras
Se mantienen separados y se replican de forma independiente de los
cromosomas del propio microorganismo
Los plásmidos bacterianos contienen genes que confieren resistencia a los
antibióticos y pueden transmitirse con facilidad de una bacteria a otra

1. Origen de replicación
2. Uno o más marcadores (genes que
aportan caract. específicas)
3. Sitios de restricción (Ez. de
restricción y ligasas)

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
 Vector de clonación BAC (cromosoma bacteriano
artificial)
• Plásmido útil para la clonación
molecular de fragmentos grandes
estables y que se replicaran
efectivamente en el anfitrión
bacteriano
• Los BAC desempeñaron un papel
clave en el Proyecto Genoma
Humano al permitir la partición
del genoma humano completo en
fragmentos de tamaño adecuado
para la secuenciación. Genoteca

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 Cromosomas de levaduras (YAC)

Cromosomas artificiales de
levadura. Un YAC tiene:
•Telómeros en sus extremos
•Origen de replicación
•Centrómero
•Genes marcadores de selección
•Sitios de acción para Enzimas de
restricción para insertar
ADN exógeno.
Fagos
Parte de su cromosoma puede ser
reemplazado por ADN externo, sin
afectar a la capacidad para infectar y
de replicación
Para usarlos como vectores, se purifica
el ADN del fago y se corta con una
enzima de restricción, con la misma
enzima de restricción cortamos el
fragmento de ADN de interés y los
unimos con una ADN ligasa
Los vectores recombinantes se
empaquetan in vitro ! introducen en
células huésped (bacterianas) !
Replicación del fragmento de ADN de
interés en la clonación
Cósmidos
Vectores hibridos (partes del cromosoma de fagos y de plásmidos)
Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento
del ADN del fago dentro de su cubierta proteica
Contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de
resistencia a antibióticos
Acepta insertos de 45 kb
 Electroforesis

Dirección de la
electroforesis

pb

ADN
 Los geles de poliacrilamida o
agarosa, pueden prepararse con
distinto tamaño de poro
Separación por tamaño

(Klug, 2013. Conceptos de genética.)

 Electroforesis en gel

Método de separación de biomoléculas en un campo eléctrico

Southern blot ADN
Northern blot ARN
Western blot Proteínas

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 Southern blot ADN
Detección y análisis de un (s) fragmento(s) de DNA de interés presente(s) en un
mezcla de ADN tratada con enzimas de restricción.

La capacidad de esta técnica para identificar la presencia

de mutaciones es limitada, debido a que una sonda sólo
detecta mutaciones que dan lugar a un efecto apreciable
sobre el tamaño de un fragmento (deleción o una
inserción de tamaño grande)

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.
(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
 Northern blot ARN

➢ Método estándar para determinar el tamaño y [mRNA] derivado de un

determinado gen en una muestra de RNA
➢ A diferencia del ADN, el RNA no puede ser cortado con enzimas de restricción
➢ Los diferentes transcritos de RNA son de distinta longitud (exones + intrones)
➢ Por tanto, el mRNA total se separa según su tamaño mediante electroforesis en
gel de agarosa.
➢ Aunque el RNA es una sola cadena, puede ser necesaria su desnaturalización
antes de la electroforesis en gel para prevenir el emparejamiento de bases entre
segmentos cortos de bases complementarias ! migración aberrante en el gel

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 Northern blot ARN
➢ Tras la electroforesis, el RNA se transfiere a un filtro. Igual que en la
transferencia Southern, el filtro se incuba con una sonda desnaturalizada y
marcada que se hibrida a uno o mas de los transcritos de RNA

➢ Tras la exposición del filtro lavado a una película de rayos X, pueden aparecer
una o mas bandas que revelan la posición y la conc. del transcrito de interés

➢ La transferencia Northern desempeña todavía una función en el análisis de los

transcritos de mRNA, ha sido sustituida en algunas de sus aplicaciones por
técnicas fundamentadas en la PCR.

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

Transferencia Northern o de RNA
(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
 Transferencia Western o de Proteínas
Técnica más utilizada para la evaluación de una o mas proteínas en una muestra
de células o tejidos

El análisis de la función normal y patológica de los genes requiere a menudo el

estudio de la proteínas codificadas por un gen normal o mutante de interés

En la mayor parte de los casos se pretende conocer no solamente el defecto

molecular existente en el ADN sino también la manera con la que dicho defecto
altera la proteína codificada y da lugar a un fenotipo clínico concreto

Para la transferencia Western, las proteínas aisladas en un determinado tipo de

células son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida, y después son
transferidas a una membrana

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 Transferencia Western o de Proteínas
La membrana que contiene las proteínas separadas se incuba después con
anticuerpos que reconocen específicamente la proteína que va a ser analizada

Un segundo anticuerpo dirigido contra el primero, y marcado con una sustancia

que se puede detectar por medios fluorescentes o radioactivos ! interacción
especifica entre el primer anticuerpo y la proteína objetivo

Por ejemplo, se puede utilizar la transferencia Western para detectar la

presencia y el tamaño de la proteína muscular distrofina en pacientes con los
cuadros de distrofia muscular de Duchenne o Becker ligados al cromosoma X

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 La ausencia o deficiencia de distrofina es
responsable de dos trastornos que causan
la destrucción progresiva del músculo.
Distrofina de <PM
y cantidad El  gen  responsable se encuentra en el
insuficiente. brazo corto del  cromosoma X  en el locus
Cubre la función Xp21.
de forma parcial

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 Transferencia Western o de Proteínas

http://www.sapd.es/revista/article.php?file=vol33_n3/03
 GENOTECAS
Colección de clones, cada uno de los cuales contiene un vector al que se ha
insertado un fragmento diferente del DNA derivado del DNA o el RNA totales de
una célula o tejido.
GENOTECAS
Cribado de genotecas a través de hibridación con sondas de ácidos
nucleicos
 Clonación bacteriana
Transformación: lac Z y antibióticos

No todas las
células son
transformadas
Plásmido pequeño 2.7 kb, posee dos genes marcadores

Colonias de E. coli
recombinante
¿Cómo identificar cuáles células se
transformaron?
http://books.google.com.mx/books?
id=4tYIcMOdsBwC&pg=PA47&lpg=PA47&dq=clonaci%C3%B3n+lacZ%C2%B4+Ampicilina&source=bl&ots=Yeu_n95
sFk&sig=c4Yx1TQojobbc3qnBIIQtCiZVkw&hl=es&sa=X&ei=cqhtU_HMLs31oAT-6IDoDQ&ved=0CCsQ6AEwAA#v=o
nepage&q=clonaci%C3%B3n%20lacZ%C2%B4%20Ampicilina&f=false
 ¿Cómo identificar cuáles
células se transformaron?

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

Sistema de selección Lac

Presencia de β-galactosidasa
Descomposición del Xgal ! Producto color azul
Se añade X-gal + IPTG (inductor de la enzima)

Colonias no recombinante (presencia de la Ez)

Colonias recombinates (alteración del gen lacZ ! ausencia de la Ez)

(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
 La electroforesis en gel permite la
separación del DNA del vector de los
Uso de las mismas Ez de
restricción que se usaron fragmentos clonados
para recombinar el ADN

Fragmentos de ADN
del vector

Fragmentos de ADN
de interés
 Insulina recombinante

Pero en el año de 1978 se consigue la

síntesis de la insulina, utilizando las
bacterias Escherichiacoli para producir de
forma separada las cadenas A y B de la
insulina humana, para esto introdujeron
genes que las codifican en las bacterias
mediante un vector pBR322, luego tiene
que pasar por un procedimiento de
purificación, plegamiento y unión in vitro
de las cadenas.

1922 1979-2014
http://fredychandi.blogspot.mx/
 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Alternativa a la clonación ! Produce cantidades “ilimitadas” de una

secuencia de interés
Amplifica selectivamente una región de DNA o RNA varios miles de millones de
veces en pocas horas
Avance en el diagnóstico y el análisis molecular de las enfermedades génicas
Consiste en una amplificación enzimática de un fragmento de DNA localizado
entre dos oligonucleótidos (cebadores o primers)
Estos cebadores están diseñados de forma sean complementario a las cadenas
de DNA

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Los cebadores flanquean la secuencia diana y sus extremos 3’ están dirigidos

hacia la secuencia diana a amplificar
La DNA polimerasa ! sintetiza dos nuevas cadenas de DNA usando como
plantilla la secuencia que se localiza entre los cebadores
Las cadenas recién sintetizadas de DNA son en si mismas complementarias y
pueden formar una segunda copia de la secuencia diana original

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 El calor (generalmente > 90°C) separa la
doble hebra de ADN en dos cadenas..

≈ 72°C, la Ez Taq polimerasa replica las

cadenas de ADN, mediante la adición de
dNTPs (A,G, C, T)

5´ 3´

3´ 5´
Amplificacion
exponencial
Entre 40°C y 65°C (depende de la (hasta que desaparecen los
longitud y la secuencia de bases de los cebadores y/o los dNTPs)
cebadores.
Unión de los cebadores a la secuencia
diana con alta especificidad.

Ver video
http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=vpAyYYArB0Y
(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
 PCR-Transcriptasa reversa
(PCR-TR o PCR-TI)

Análisis de muestras RNA,

Primero se sintetiza un cDNA de cadena única a partir del mRNA de interés con
una transcriptasa inversa
Después se añaden cebadores de PCR y DNA polimerasa, como en el caso de la
PCR para DNA
Uno de los oligonucleótidos ceba la síntesis de la segunda cadena de cDNA que,
en su forma de doble cadena, sirve como diana para la amplificacion con PCR.

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 PCR-cuantitativa o PCR en tiempo real
(qPCR / PCR-TR)

La PCR se puede utilizar como una tecnica cuantitativa ! determina [ADN]

En las fases iniciales de una reacción PCR, el numero de moléculas de la región
de ADN que esta siendo amplificada se duplica con cada ciclo
(desnaturalización ! hibridación ! extensión)
La cantidad de material sintetizado en las fases iniciales de la PCR ! línea
recta en una gráfica cuando la cantidad del producto se duplica en cada ciclo
El numero de ciclos necesarios para alcanzar un umbral arbitrario es una
medida de la cantidad inicial que existía inicialmente al comienzo de la
reacción PCR: (< ciclos necesarios para alcanzar un umbral dado, > [ADN]
inicial

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 (qPCR / PCR-TR)
Se utiliza con mayor frecuencia para cuantificar cantidades pequeñas de un DNA o un
RNA en una muestra (muestra A), en relación con la cantidad de un RNA o un DNA control
existentes en otra muestra (muestra B)
Es importante que sea comparable la eficiencia de la amplificación de las muestras A y B;
es decir, los dos segmentos lineales rectos deben ser paralelos.

AND sintetizado en
las fases iniciales

#ciclos !umbral !
[ADN]i
<ciclos , > [ADN]i
 Las enzimas de restricción
Deleción cortan en tres secciones el
del gen fragmento de ADNg
correspondiente al gen

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 Secuenciación de ADN
La tecnica mas utilizada para el análisis de secuencias de ADN es la
secuenciación Sanger (Fred Sanger, premio Nobel en 1980)
Se puede determinar la secuencia de cualquier segmento de ADN puro (producto
de clonación o de PCR) de ≈ 500 nucleótidos de longitud
El método de la secuenciación Sanger aprovecha ciertos análogos químicos de
los cuatro nucleótidos conocidos como dideoxinucleotidos (ddA, ddC, ddG y
ddT) debido a que carecen de un grupo hidroxilo 3’ terminal en su desoxirribosa
(además del 2’-hidroxilo que normalmente no existe en el DNA)
Si se incorporan en una cadena creciente de ADN, los nucleótidos dideoxi no
permiten que la enzima DNA polimerasa se una a la siguiente base
complementaria al ADN molde original que esta siendo secuenciada,
interrumpiendo así la cadena de ADN en formación

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

 Secuenciación de ADN
Una vez incorporados los
Dideoxirribonucleótidos trifosfatos no
pueden formar un enlace fosfodiéster con
el siguiente nucleótido trifosfato
entrante.

Por lo tanto, la incorporación de un

ddNTP termina con la síntesis de la
cadena y produce una hebra hija
truncada.

Nussbaum, Mclnnes y Willard. 2008. Genética en medicina.

(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
 Obtención de la secuencia
completa de un DNA molde

•Se llevan a cabo cuatro Rxns

separadas (con cada ddNTP)
diferente

•El ddNTP que termina cada

fragmento truncado puede
identificarse mediante el uso
de ddNTP marcados con cuatro
colorantes fluorescentes
distintos (indicados por los
colores que se resaltan).
 Impresión de muestra de un secuenciador automático a
partir del cual se puede leer directamente la secuencia del
DNA molde original.

En un aparato de secuenciación automática, las cuatro mezclas de Rxn se someten a

electroforesis en gel y se registra el orden de aparición de cada uno de los cuatro
colorantes fluorescentes en el extremo del gel
 Secuenciación de ADN
En la secuenciación Sanger, un fragmento de ADN que va a ser secuenciado se
usa como plantilla para la síntesis de ADN cebado por un oligonucleótido corto,
y la DNA polimerasa sigue la secuencia de la plantilla, ampliando el cebador e
incorporando nucleótidos
Para obtener información de la secuencia, en primer lugar, se añaden a las
reacciones de secuenciación análogos dideoxi junto con los cuatro nucleótidos
normales
Cada análogo se marca con un colorante fluorescente diferente que presenta su
propia emisión lumínica distintiva
La polimerasa incorpora un nucleótido normal, de manera que sigue
extendiendo la cadena, o bien una base dideoxi, lo que interrumpe la síntesis
Las cadenas finalizadas son separadas mediante electroforesis y el nucleótido
dideoxi concreto que fue responsable de la terminación es identificado a través
de la molécula concreta del colorante fluorescente que es incorporada
http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm
 Cromatograma de Sanger

http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201529/Exe_201529/Protocolo_y_modulo/
leccin_20_secuenciacin_del_adn.html
¿Cuál sería la secuencia de
este fragmento de ADN?
Fred Sanger (1918-2013)
Padre de la genómica
Premio Nobel 1995
Secuencia problema…

AGCAGGTCTGTTCCAAGGGCCTTTGCGTCAGGTGGGCTCAGGGTTCCAGGGTGGCTGGACCCCAGGCCCCAGCTGT
GCAGCAGGGAGGACGTGGCTGGGCTCGTGAAGCATGTGGGGGTGAGCCCAGGGGCCCCAAGGCAGGGCACCTGGC
CTTCAGCCTGCCTCAGCCCTGCCTGTCTCCCAGATCACTGTCCTTCTGCCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCC
TGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCT
GGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGAC
CTGCAGGGTGAGCCAACCGCCCATTGCTGCCCCTGGCCGCCCCCAGCCACCCCCTGCTCCTGGCGCTCCCACCCAGC
ATGGGCAGAAGGGGGCAGGAGGCTGCCACCCAGCAGGGGGTCAGGTGCACTTTTTTAAAAAGAAGTTCTCTTGGTC
ACGTCCTAAAAGTGACCAGCTCCCTGTGGCCCAGTCAGAATCTCAGCCTGAGGACGGTGTTGGCTTCGGCAGCCCCG
AGATACATCAGAGGGTGGGCACGCTCCTCCCTCCACTCGCCCCTCAAACAAATGCCCCGCAGCCCATTTCTCCACCCT
CATTTGATGACCGCAGATTCAAGTGTTTTGTTAAGTAAAGTCCTGGGTGACCTGGGGTCACAGGGTGCCCCACGCTG
CCTGCCTCTGGGCGAACACCCCATCACGCCCGGAGGAGGGCGTGGCTGCCTGCCTGAGTGGGCCAGACCCCTGTCG
CCAGCCTCACGGCAGCTCCATAGTCAGGAGATGGGGAAGATGCTGGGGACAGGCCCTGGGGAGAAGTACTGGGATC
ACCTGTTCAGGCTCCCACTGTGACGCTGCCCCGGGGCGGGGGAAGGAGGTGGGACATGTGGGCGTTGGGGCCTGT
AGGTCCACACCCAGTGTGGGTGACCCTCCCTCTAACCTGGGTCCAGCCCGGCTGGAGATGGGTGGGAGTGCGACCT
AGGGCTGGCGGGCAGGCGGGCACTGTGTCTCCCTGACTGTGTCCTCCTGTGTCCCTCTGCCTCGCCGCTGTTCCGG
AACCTGCTCTGCGCGGCACGTCCTGGCAGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCA
GCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACC
AGCTGGAGAACTACTGCAACTAGACGCAGCCTGCAGGCAGCCCCACACCCGCCGCCTCCTGCACCGAGAGAGATGGA
ATAAAGCCCTTGAACCAGC
 Se copia la
secuencia

Click
 Microarreglos
Un microarreglo es una distribución ordenada de genes
en una pequeña superficie, y mediante hibridación con el
ADN problema se puede obtener respuesta instantánea
de la actividad o expresión de múltiples genes en un solo
análisis.
(Klug, 2013. Conceptos de genética.)
 Los microarreglos permiten realizar perfiles comparativos entre
células normales y cancerosas mediante expresión génica

Mx de ARNm de 2
tipos de células
con diferentes
transcritos

Marcaje de los La intensidad de

ADNC con
fluorocromos fluorescencia es
directamente proporcional
al nivel de expresión del
Miles de copias de gen.
un solo tipo de
sonda

Diferente nivel de
expresión génica
en cada tipo de
ARNm

(Klug, 2013. Conceptos de genética.)

 Las micromatrices de expresión (transcriptoma) permiten
identificar factores de virulencia y posibles inmunógenos

Identificación de los genes que se expresan de forma activa cuando los patógenos
infectan al huésped y se replica
Revela cuáles son los genes críticos para la infección
Selección de proteínas diana como candidatas de posibles vacunas y tratamientos
farmacológicos para tratar o impedir las infecciones (Klug, 2013. Conceptos de genética.)
Análisis de expresión permiten identificar los perfiles
moleculares específicos para distintos patógenos

Los chips de exp. génica revela

patrones de respuesta del huésped
para identificar los patógenos

(Klug, 2013. Conceptos de genética.)