Universidad Técnica de Manabí

Extensión Bahía de Caráquez

Facultad de Ciencias Veterinarias

Escuela de:
Ingeniería en Acuicultura y Pesquerías

Catedra:
Alimentos Biacuáticos I

Catedrático:
Biol. Marjorie Idrovo Vishuete

Nivel IV
Tema:
Producción y mantenimiento de microalgas marinas
(Tetraselmis sp. y Thalassiosira sp.) en la sección de
microalgas y alimento vivo.

Autores:

Mayo – Septiembre de 2014

 INDICE GENERAL
CONTENIDO

Portada ............................................................................................................................................... 1
Índice ................................................................................................................................................ 2
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 7
II. OBJETIVOS ......................................................................................................... 8
2.1. Objetivo general ........................................................................................................... 8
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................. 8
III. MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 9
3.1. Microalgas .................................................................................................................... 9
3.1.1. Características ecológicas de las microalgas ........................................................... 9
3.1.2. Descripción de la microalgas .................................................................................... 9
3.1.3 Reproducción ............................................................................................................. 10
3.1.4. Importancia de las microalgas en acuicultura ........................................................ 10
3.2. Especies de microalgas ............................................................................................ 11
3.2.1. Tetraselmis sp. ………………………………………………………………..11
3.2.1.1. Clasificación científica …………………………………………………….11
3.2.2. Thalassiosira sp. …….………………………………………………………11
3.2.1.2. Clasificación científica. ……………………………………………………..12
3.3. Control de los requerimientos físicos y químicos en el laboratorio. …………...12
3.3.1. Parámetros físicos ………………………………………………………12
3.3.1.1. Luz ………………………………………………………………………..12
3.3.1.2. Aireación ………………………………………………………………...12
3.3.1.3. Temperatura ………………………………………………………………13
3.3.2. Parámetros químicos ………………………………………………………13
3.3.2.1. Nutrientes ………………………………………………………………..13
3.3.2.2. Bióxido de carbono ………………………………………………………13
3.3.2.3. Contaminación en los cultivo de microalgas. …………………………….14
3.3.2.3.1. Indicadores de contaminación química ………………………………14
3.3.2.3.2. Indicadores de contaminación biológica ………………………………14
IV. METODOLOGÍA ………………………………………………………………15

2
4.1. Ubicación ………………………………………………..…………………...15
4.2. Materiales, equipo y reactivos …...……………………………………………15
4.2.1. Materiales ………….…………………………………………………………15
4.2.1.1. Materiales de vidrio ………....……………………………………………16
4.2.1.2. Materiales de plástico …..…………………………………………………16
4.2.1.3. Otros …...………………………………………………………………...16
4.2.2. Equipos …...………………………………………………………………...17
4.2.3. Reactivos y sustancias …..………………………………………………....17
4.2.3.1. Reactivos …………………...……………………………………………17
4.2.3.2. Sustancias ….…...…………………………………………………………18
4.3. Métodos de desinfección y esterilización …...…………………………………18
4.3.1. Limpieza y desinfección ….…………………………….……………………18
4.3.1.1. Acondicionamiento del laboratorio ...………………………………………18
4.3.1.2. Lavado y desinfección de materiales. ………………………………………18
4.3.1.3. Agua dulce desionizada …...……………………………………………...…19
4.3.1.4. Agua salada para medios de cultivo. ………………………………..……19
4.3.2. Esterilización ……………………………………………………………..20
4.3.2.1. Por calor seco ……………………………………………………………..20
4.3.2.2. Por calos húmedo ………………….………………………………………20
4.4. Medios de cultivo para microalgas …………………………………………...…22
4.4.1. Preparación de soluciones ………………………………………...……22
4.4.1.1. Soluciones para clorofitas y diatomeas ………………………………...……22
4.4.1.1.1. Solución 1 (clorofitas) …………………………………………………22
4.4.1.1.2. Solución 1 (diatomeas) ……………………………………………...23
4.4.1.2. Solución de micronutrientes y metales traza ……………………………...24
4.4.1.2.1. Preparación de metales traza ……………………………………………...24
4.4.1.3. Solución de vitaminas ……………………………………………………...25
4.4.2. Agua de mar enriquecida ……………………………………………………...25
4.5. Escalación del cultivo en Tetraselmis y Thalassiosira ……………………………26
4.5.1. En tubos de ensayo de 20 ml. ………………………………………………26
4.5.2. En botellas de 500 ml ………………………………………………….…..27

3
 4.5.3. En botellas de 1 Lt. ………………………………………………….......28
4.5.4. En galones de 6 Lt. ………………………………………………….......28
4.5.5. Tiempo de escalación del cultivo …………………………………………...28
4.6. Cuantificación de microalgas …………………………………………………29
VII. Resultados …………………………………………………..........................30
7.1. Concentración inicial de microalgas. ……………………………………….30
Crecimiento celular en la escalación del cultivo de microalgas …………31
(Tetraselmis sp y Thalassiosira sp).
7.2. Tubos de ensayo de 20 ml. ………………………………………………33
7.3. Botellas de ½ litro. …………………………………………………........34
7.4. Botellas de 1 litro. ………………………………………………….......35
7.5. Galones de 6 litros. ………………………………………………….......36
7.2. Placas de agar TCBS con muestras de microalgas ……………………....37
VIII. CONCLUSIONES ………………………………………………….......38
IX. RECOMENDACIONES …………………………………………………...38
X. ANEXOS …………………………………………………..................39
XI. BIBLIOGRAFÍAS …………………………………………………......40

LISTA DE FOTOGRAFÍAS

Fotografía 1. Ubicación de la UTM-Bahía de Caráquez ……………………………….15

Fotografía 2, 3 y 4. Proceso diario del lavado de los materiales utilizado ………………19
en el laboratorio.
Fotografía 5 y 6. Tanque con agua salada filtrada y neutralizada. ………………………..20
Fotografía 7. Autoclave …………………………………………................................21
Fotografía 8, 9 y 10. Materiales autoclavalos (botellas de ½ Lt, tubos, ……………21
pipetas y micropipetas Pasteur) y agua salada autoclavada.
Fotografía 11. Disolución de Nitrato de sodio con agua dulce autoclavada ……………22
en el agitador magnético.
Fotografía 12 y 13. Peso del fosfato de sodio y aumento el volumen del agua ….….22-23
en el vaso de precipitación.

4
Fotografía 14 y 15. Peso del Nitrato de sodio y medición del agua dulce ………23
autoclavada junto con el agregado del compuesto.
Fotografía 16, 17 y 18. Agregado del Meta silicato de sodio en la solución con ………24
agua dulce autoclavada sometiendo al agitador magnético y enrase de la solución.
Fotografía 19 y 20. Preparación de la solución 2. ………………………………………25
Fotografía 21 y 22. Llenado de la solución de Diatomeas y refrigeración……………... 25
de las mismas.
Fotografía 23. Agua salada autoclavada enriquecida con nutrientes. ……………………26

Fotografía 24. Tubos de ensayos inoculados con Tetraselmis sp y …………….27

Thalassiosira sp.
Fotografía 25 y 26. Botellas de ½ Lt con aireación e iluminación ya inoculados. ……….27
Fotografía 27 y 28. Botellas de 1 Lt de Tetraselmis sp y Thalassiosira sp con……….. 28
aireación e iluminación.
Fotografía 29 y 30. Galones de 6 Lt con Tetraselmis sp y ……………………28
Thalassisira sp con aireación.
Fotografía 31 y 32. Cámara de Neubauer y Microscopio instrumentos…………………..29
que ayudan a determinar el crecimiento celular.
Fotografía 33. Réplicas de microalgas…………………………………………………………..37

Fotografía 34. Laboratorio de microalgas con Tetraselmis sp y Thalassiosira sp.

………39
Fotografía 35. Repisas donde se encuentran los químicos o reactivos y materiales que se
usan en la escalación del cultivo (botellas de ½ Lt, pipetas, micropipetas, tubos de ensayo,
etc.). ……………………………………………………………………………………. 39
LISTA DE TABLAS

Tabla N° 1. Concentración inicial del cultivo de microalgas. …………………………………30

Tabla N°2. Estadística descriptiva del crecimiento celular (cel/ml) de Tetraselmis sp y

Thalassiosira sp durante Junio a Agosto del 2014. ………………………………………31

5
Tabla N° 3. Estadística descriptiva de la concentración de cel/ml en tubos de ensayo de 20
ml en Thalassiosira durante Junio a Agosto del 2014. …………………………………….33
Tabla N° 4. Estadística descriptiva de la concentración de cel/ml en botellas de ½ Lt en
Thalassiosira sp y Tetraselmis sp durante Julio a Agosto del 2014. ………………………34
Tabla N° 5. Estadística descriptiva de la concentración de cel/ml en botellas de 1 Lt en
Thalassiosira sp y Tetraselmis sp durante Julio a Agosto del 2014. ………………………35
Tabla N° 6. Estadística descriptiva de la concentración de cel/ml en galones de 6 Lt en
Thalassiosira y Tetraselmis durante Julio a Agosto del 2014. ……………………………36

LISTA DE GRÁFICOS
Contenido Págs.
Gráfico N° 1. Concentración inicial del cultivo de microalgas ……………………………….30

Gráfico N° 2. Gráfica de barras del crecimiento celular (cel/ml) de Tetraselmis sp y

Thalassiosira sp durante Junio a Agosto del 2014. ………………………………………32
Gráfico N° 3. Gráfica de barras de concentración de cel/ml en tubos de ensayos de 20 ml en
Thalassiosira entre Junio a Agosto del 2014. ……………………………………………...33
Gráfico N° 4. Gráfica de barras de concentración de cel/ml en botellas de ½ Lt en
Thalassiosira sp y Tetraselmis sp entre Julio a Agosto del 2014. ………………………..34
Gráfico N° 5. Gráfica de barras de concentración de cel/ml en botellas de 1 Lt en
Thalassiosira y Tetraselmis entre Julio a Agosto del 2014. ………………………………35
Gráfico N° 6. Gráfica de barras de concentración de cel/ml en galones de 6 Lt en
Thalassiosira y Tetraselmis entre Julio a Agosto del 2014. ………………………………36

6
 I. INTRODUCCIÓN

Las microalgas marinas unicelulares se cultivan como alimento vivo, siendo estas de gran
importancia para la Acuicultura para las diferentes etapas larvarias de crustáceos e incluso
en estadios de crecimiento o engorde de diversas especies como moluscos y peces;
además se las utiliza en la producción de zooplancton.

Los géneros de microalgas más utilizadas en Acuicultura son: Isochrysis, Nannochloropsis,

Chlorella, Tetraselmis, Dunaliella, Rhodomonas, Pavlova, Chaetoceros, Nitzschia y
Thalassiosira. Dentro de las microalgas, las especies flageladas y diatomeas son
productoras primarias y se encuentran en la base de la cadena trófica marina, debido a que
fabrican componentes celulares orgánicos a partir del dióxido de carbono y otros nutrientes
que absorben del agua de mar utilizando la luz como fuente de energía en un proceso
denominado fotosíntesis.

Normalmente se cultivan en criaderos en agua de mar natural tratada y enriquecida con

adición de nutrientes como: nitratos, fosfatos, oligoelementos esenciales, vitaminas y
dióxido de carbono como fuente de carbono.

Estas microalgas aportan un alto contenido nutricional para las especies, además de ofrecer
facilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio como en producción a
gran escala con fines comerciales. Debido a esto es necesario cultivar los diversos tipos de
microalgas dándoles las condiciones y enriqueciéndolas con los nutrientes necesarios para
darle mayor calidad a los cultivos.

Cabe mencionar, que la medición de la biomasa es importante en el cultivo de las

microalgas para tener un recuento directo de la población celular y se puede hacer a través
de diferentes métodos como son: el conteo celular mediante el uso de una cámara de
Neubauer, siendo el método más común; la medición de la densidad óptica o absorbancia
con ayuda de un espectrofotómetro; el método de fluorometía midiendo la concentración de
clorofila a través de un fluorímetro. Otro método es la cuantificación de la biomasa a través
del peso seco (Romo, 2001).

7
 II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general:

Producir y mantener microalgas marinas (Tetraselmis sp. y Thalassiosira sp.) en

la sección de microalgas y alimento vivo.

2.2. Objetivos específicos

 Aplicar métodos de desinfección y esterilización en el laboratorio para la

producción de microalgas.
 Realizar la escalación del cultivo de microalgas.
 Determinar el crecimiento celular de las microalgas mediante el uso de la cámara
de Neubauer.

8
 III. MARCO TEÓRICO

3.1. MICROALGAS

Las algas son reconocidas como una de las más antiguas formas de vida. Son plantas
primitivas, es decir, que carecen de raíces, tallos y hojas. Por otro lado la microalgas
oleaginosas son microorganismos unicelulares fotosintéticos que se desarrollan en medios
acuáticos de agua dulce o agua de mar, con requerimientos simples de crecimiento tales
como luz, dióxido de carbono (CO2), nitrógeno (N), fósforo (P), potasio (K) y otros
oligoelementos de menor importancia como sodio (Na), azufre (S), boro (B), cobre (Cu),
manganeso (Mn), silicio (Si), zinc ( Zn), molibdeno (Mo), cobalto (Co), vanadio (V),
selenio ( Se), entre otros.

Las microalgas producen lípidos, proteínas y carbohidratos en grandes cantidades en

periodos de tiempos cortos, son capaces de fijar CO2 y liberar O2 a la atmósfera y
representan los microorganismos que tienen mayor velocidad de crecimiento (Bermeo,
2011).

3.1.1. CARACTERÍSTICAS ECOLÓGICAS DE LAS MICROALGAS

Normalmente, las algas habitan los ambientes húmedos, en la tierra, aire, mar, lagunas,
hielo y nieve. En el mar ocupan las capas más superficiales, hasta los niveles donde hay
penetración de luz solar. Su función dentro de la naturaleza destaca por su rol de formar
parte del primer eslabón dentro de la cadena trófica acuática.

Las divisiones de microalgas están definidas en bases a dos tipos de propiedades

bioquímicas: el tipo de pigmento y la reserva alimenticia. Cada división se caracteriza por
su propia distribución de pigmento, además de la presencia de clorofila a (Álvarez, 2003).

3.1.2. DESCRIPCIÓN GENERAL DE LAS CÉLULAS

Las microalgas generalmente varían mucho en su forma, van desde las más simples como
las del genero Chlorella, hasta las más complejas como Skeletonema; aunque internamente
en todos los géneros estudiados su estructura y fisiología es igualmente difícil.

9
Externamente las células poseen paredes ligeramente rígidas y pueden también presentar
láminas que recubren estas paredes. Los organelos del citoplasma que contienen pigmentos
verdes, son los que caracterizan a las clorofíceas y se llaman cloroplastos; estos pigmentos
también están presentes en las cianobacterias. Otros organelos pigmentados de las algas se
los conoce como cromatóforos y presentan colores diferentes del anterior. Estas células
algales poseen sistemas enzimáticos relacionados con la fotosíntesis (Álvarez, 2003).

3.1.3. REPRODUCCIÓN

La reproducción de las algas ocurre sin ningún cambio en su ploidia, es decir son asexuales.
Los mecanismos asexuales incluyen fisión, esporulación y liberación de fragmentos
nucleados en formas multicelulares.

La fisión es comúnmente binaria y ocurre dentro de la pared celular, si ésta se encuentra

presente. En otros tipos, la pared original es descartada y cada uno de los progenitores
construye una pared antes o después de liberarse de la pared de la célula madre.

Especialmente en ciertas diatomeas y ciertos dinoflagelados, la pared original es repartida

por el progenitor y cada nuevo individuo construye la porción faltante. Excepto para los
dinoflagelados causantes de mareas rojas, los procesos sexuales no han sido reportados para
algas procarióticas (Cianobacterias) contrariamente a lo ocurrido con las algas eucarióticas
(Euglenoficeas, Crysoficeas y Critoficeas) (Álvarez, 2003).

3.1.4. IMPORTANCIA DE LAS MICROALGAS EN ACUICULTURA

Para el crecimiento y desarrollo de la mayoría de las etapas larvales de diversos

organismos acuáticos, las microalgas se han considerado importantes; al igual que para
otras especies zooplanctónicas.

Se ha comprobado, además, que las microalgas verdes son ricas en carbohidratos y que las
diatomeas contienen más lípidos, los cuales son aprovechados por los organismos en
cultivo; reconociendo de este modo que el uso adecuado de las microalgas incrementa la

10
supervivencia, desarrollo y crecimiento de las larvas de moluscos, crustáceos, ranas y
principalmente de peces (Medina et al, 2012).

3.2. ESPECIES DE MICROALGAS

3.2.1. TETRASELMIS SP.

Tetraselmis sp es un género de fitoplancton de gran aplicación en acuicultivos, como

alimento de peces, camarones, especialmente en sus estados larvarios y de rotíferos y
crustáceos (Montoya, C y Acosta A).

Esta microalga tiene un nivel de lípidos muy alto, estimulando la alimentación de

organismos marinos usando aminoácidos naturales. Las Tetraselmis son verdes, móviles, y
miden usualmente 10 µm de largo x 14 µm de ancho.

3.2.1.1. CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA

Reino: Protista
División: Chlorophyta
Clase: Prasinophyceae
Orden: Volvocales
Familia: Chlamydomonadaceae
Género: Tetraselmis
Especies: Tetraselmis chui
Tetraselmis suecica

3.2.2. THALASSIOSIRA SP.

Thalassiosira sp es un género ampliamente distribuido en todos los océanos del mundo, es

por ello que son frecuentemente utilizadas como alimento en acuicultura por ser una
especie marina de diatomea con alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados (AGPs).
Sin embargo, las cantidades producidas por esta microalga, no satisfacen las necesidades

11
del sector acuícola, que evidencia un vertiginoso crecimiento a nivel mundial, haciéndose
necesario desarrollar sistemas de cultivos masivos con calidad bioquímica y/o valor
nutricional estable, además de mínimos riesgos de ser contaminados. Adicionalmente, se
han probado numerosos medios de cultivo alternativos, debido a los considerables costos
que implica la producción de alimento vivo (Vásquez et al, 2013).

3.2.1.2. CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA

Reino: Chromalveolata
División: Heterokontophyta
Clase: Coscinodiscophyceae
Orden: Thalassiosirales
Familia: Thalassiosiraceae
Género: Thalassiosira
Especies: T. pseudonana (Cleve, 1873)

3.3. CONTROL DE LOS REQUERIMIENTOS FÍSICOS Y QUÍMICOS EN EL

LABORATORIO.

3.3.1. PARÁMETROS FÍSICOS

3.3.1.1. LUZ

En la producción de microalgas se utiliza constantes períodos de luz artificial (24 horas) por
medio de lámparas del tipo cool white (2500 lux) en todos los niveles de cultivo desde el
cepario hasta las tolvas de 400 litros (Romo, 2011).

3.3.1.2. AIREACIÓN

Al cepario o cultivos estáticos no se le proporciona aireación y sólo se agitan manualmente

para homogenizar el cultivo; sin embargo a medida que se realiza la escalación del cultivo

12
se utiliza aireación constante con ayuda de un compresor blower de baja presión de 12 hp el
cual se encuentra conectado al área de cultivo a través de una tubería flotante de pvc
(Romo, 2011).

3.3.1.3. TEMPERATURA

Esta debe mantenerse constante por medio de un aire acondicionado, el área de cultivo se
mantiene a una temperatura de 18 a 22°C para tratar de evitar que al momento de utilizar
las microalgas como alimento esta disminuya de calidad, es decir que sus paredes celulares
comiencen a reventarse debido al brusco incremento en la temperatura.

3.3.2. PARÁMETROS QUÍMICOS

3.3.2.1. NUTRIENTES

El medio de cultivo utilizado a nivel mundial en laboratorios, se elabora con base en la

formulación sugerida por Guillard y Ryther 1962, para los cultivos de una variedad de
especies planctónicas de importancia en acuicultura.

Para especies marinas planctónicas y bentónicas. Se debe preparar un litro de H 2O dulce o

salada esterilizada, agregar 1 ml de la solución de nutrientes mayores, de la solución
secundaria y de la solución secundaria de vitaminas de 1 Lt de agua de mar filtrada y
esterilizada (Castrejón, 1994).

3.3.2.2. BIÓXIDO DE CARBONO

En el laboratorio no se suministra bióxido de carbono a los cultivos debido a que el

suministro de aire ha sido suficiente para estos hasta la fecha y además los equipos que
suministran CO2 al cultivo poseen un elevado costo; por lo que a nivel industrial se
implementan estos equipos (Romo, 2011).

13
3.3.2.3. CONTAMINACIÓN EN LOS CULTIVO DE MICROALGAS.

3.3.2.3.1. INDICADORES DE CONTAMINACIÓN QUÍMICA

Existen diversos patrones indicativos de este tipo de contaminación química, por ejemplo
cuando el cultivo se torna blanco dentro de las 24 h de sembrado probablemente se debe al
cloro residual y otros químicos disueltos en el agua. Si el cultivo conserva un color claro
después de 3 o 4 días observando poco crecimiento se puede deber a que la fuente de luz es
poca o existe un desbalance en los nutrientes (Romo, 2011).

Cultivos viejos de 15 o más días que inician una deficiencia en nutrientes generalmente se
tornan turbios y otros levemente claros, esfuerzos por recobrar estos cultivos ya carentes de
nutrientes son inútiles.

3.3.2.3.2. INDICADORES DE CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA

Los tipos más comunes de contaminación biológica con excesivos niveles de bacterias,
otras microalgas, protozoarios o macroalgas. Si un cultivo después de 3 o 7 días cambia de
color y eventualmente se aclara la causa mayormente puede ser provocada por
protozoarios. El excesivo crecimiento de bacterias se manifiesta como agua turbia bajo
crecimiento y colapso del cultivo (Romo, 2011).

14
 IV. METODOLOGÍA
4.1. UBICACIÓN

El presente trabajo se lo realizó durante el 4 de junio hasta el 30 de agosto del 2014, en la

sección de microalgas y alimento vivo de los laboratorios a pequeña escala cuyas
instalaciones pertenecen a la Escuela de Ingeniería en Acuicultura y Pesquerías de la
Universidad Técnica de Manabí – extensión Bahía de Caráquez, ubicada en la parroquia de
Leónidas Plaza del cantón Sucre.

Fotografía 1. Ubicación de la UTM-Bahía de Caráquez

4.2. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

4.2.1. MATERIALES

4.2.1.1. MATERIALES DE VIDRIO

1 Agitador o varilla de vidrio

1 Beackers de 250 ml
5 Beackers de 125 ml
2 Beackers de 50 ml
2 Beackers de 1000 ml
5 Botellas de vidrio café de 1 Lt
53 Botellas de vidrio de 1 Lt
154 Botellas de vidrio de 500 ml
8 Botellas de vidrio 250 ml
15 Cajas Petri

15
2 Lámparas de alcohol
156 Micropipetas Pasteur
23 Pipetas de 1 ml
2 Pipetas de 2 ml
1 Pipeta de 5 ml
3 Pipetas de 10 ml
52 Tubos de ensayo tapa rosca

4.2.1.2. MATERIALES DE PLÁSTICO

2 Atomizadores
1 Balde plástico blanco de 20 Lt
2 Baldes plásticos café de 15 Lt
1 Bandeja plástica azul cuadrada.
1 Bandeja plástica roja rectangular.
1 Bandeja plástica blanca rectangular.
2 Cepillos de cerdas duras
4 Gradillas para tubos.
1 Gradilla porta pipetas
12 Galones de 6 Lt
2 Lava botellas y lava tubos
1 Rollo de manguera transparente de 1 pulgada.
1 Tanque plástico blanco de 500 Lt
1 Tanque azul de 120 Lt
2 Tinas (café y blanca)
1 Tina plástica negra de 300 Lt
4.2.1.3. OTROS

2 Esponjas
3 Filtros de celulosa
6 Papel aluminio
Papel y lápiz

16
4 Papel toalla
4.2.2. EQUIPOS

1 Acondicionador de aire tipo Split, 24000 vtu de 200 voltios.

1 Agitador magnético
1 Autoclave All Americam.
1 Balanza eléctrica de precisión de 400gr.
1 Bomba sumergible
2 Cámaras de Neubauer
1 Destilador de agua.
1 Microscopio Olympus Modelo CH30RF100
1 kit para medir cloro.
1 Refrigerador tipo vitrina.

4.2.3. REACTIVOS YSUSTANCIAS

4.2.3.1. REACIVOS

Ácido muriático al 10%

Cloro granulado o hipoclorito de calcio (50 g/ton)
Cloruro de Cobalto
Cloruro de Manganeso
Cloruro Férrico
EDTA
Fosfato de Sodio
Meta silicato de Sodio
Molibdato de Sodio
Nitrato de Sodio
Sulfato Cúprico
Sulfato de Zinc

17
4.2.3.2. SUSTANCIAS
Agua dulce o salada filtrada y desinfectada
Alcohol antiséptico
Alcohol potable
Ampolla de complejo B (Tiamina cianocobalamina)
Solución de lugol
Detergente líquido o en polvo 9000 gr

4.3. MÉTODOS DE DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN.

4.3.1. LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN.

4.3.1.1. ACONDICIONAMIENTO DEL LABORATORIO.

En el laboratorio de microalgas la asepsia es un aspecto muy importante; por ende se

acondicionó desde el 4 de junio del presente año para evitar contaminación de toda índole
en el cultivo. Primero se comenzó con el inventario de los materiales que en éste se
encontraban, luego se eliminó el polvo dentro del laboratorio, realizando así la limpieza de
pisos y vidrios, también la de los mesones de trabajo, lavaderos y mesa en los cuales se
encuentra la cristalería.

4.3.1.2. LAVADO Y DESINFECCIÓN DE MATERIALES.

El material más utilizado en este cultivo es el vidrio debido a su resistencia al calor y su

reutilización; por lo cual el proceso de limpieza no debe producir daño a los recipientes.

Los materiales pertenecientes al laboratorio se los lavó primero con detergente, luego se los
enjuagó con abundante agua dulce.

En un tanque se colocó 80 litros de agua disolviendo en éste 4 gramos de cloro granulado;

sumergiendo los materiales (botellas, pipetas, micropipetas, tubos de ensayo, cajas Petri,
matraces, etc.) por 24 horas siempre y cuando sea la primera vez que se los vaya a utilizar.

18
Transcurrido el tiempo mencionado se procedió a enjuagar con abundante agua dulce;
luego se preparó la solución de ácido muriático al 10% en 1 Lt de agua dulce, la cual se le
aplicó a los materiales por 3 minutos, posteriormente se procedió a enjuagar y se los dejó
escurriendo para su secado. Este proceso se lo repitió durante el periodo que duró el
cultivo.

SOLUCIÓN DE
ÁCIDO
MIURÁTICO
80 Lt de H2O + 4 gr AL 10%

de Cl
H2O DULCE
Fotografía 2, 3 y 4. Proceso diario del lavado de los materiales utilizado en el laboratorio.

4.3.1.3. AGUA DULCE DESIONIZADA.

Este tipo de agua generalmente se utiliza para la preparación de soluciones, además para el
uso del autoclave; es por ello que se tomó agua potable de las tuberías conectándola a una
manguera con el desionizador obteniendo agua desionizada ubicándola en un bidón junto
con una tapa de papel aluminio.

4.3.1.4. AGUA SALADA PARA MEDIOS DE CULTIVO.

Se extrajo agua salada del estuario del rio Chone por medio de bombeo ubicándola en una
tina de 300 Lt, esta presentó un alto grado de turbidez, debido a esto se dejó sedimentar las
partículas de materia orgánica, esto duró entre 24 a 72 horas.

A continuación, se procedió a filtrar agua salada con un filtro de celulosa de 1.5 micras de
porosidad para atrapar las partículas que aún estaban en suspensión, colocándola en un
tanque de 500 Lt.

Seguidamente se clorinó 170 Lt de agua salada filtrada con 2.5 gr de cloro granulado,
dejándola recircular con una bomba sumergible durante 24 horas. Para neutralizar el cloro,
después del tiempo mencionado se utilizó 2 gr de Tiosulfato de Sodio; dejando reposar
media hora y se comprobó con un Kit de cloro si aún hay presencia del químico.

19
Con esta agua salada tratada se procedió a llenar botellas de vidrio de un 1 Lt para
someterlas al autoclave.

Fotografía 5 y 6. Tanque con agua salada filtrada y neutralizada.

4.3.2. ESTERILIZACIÓN

El método usado en este proceso es por calor seco y por calor húmedo.

4.3.2.1. MÉTODO DE CALOR SECO.

Una vez secos y desinfectados los materiales se procedió a flamear con una lámpara de
alcohol y envolverlos con papel aluminio como es el caso de pipetas, micropipetas y tubos
de ensayo. En botellas 1 y ½ litro se les flameó la boca junto con una tapa hecha de papel
de aluminio, sin embargo a las de 1 Lt se llenaban (+/- 800 ml) con agua salada tratada;
para luego someterlos al autoclave.

4.3.2.2. MÉTODO POR CALOR HÚMEDO

Se utilizó el autoclave para realizar una esterilización con vapor puro saturado de presión
eliminando todas las bacterias. El cual consiste en dos ollas a una se le agrega agua
desionizada a un nivel que coincida con la parrilla o tubo indicador que sostendrá a la otra,
en la cual se colocó los materiales antes mencionado; en los bordes del autoclave se puso
vaselina simple para que sea más fácil abrirla. Este se cerró en forma de cruz usando ambas
manos para que no haya un desnivel y se pierda el vapor generado retardando este proceso.

20
 Fotografía 7. Autoclave

Luego se conectó, se cerró la válvula de presión y se movió la perilla de control en

calentamiento máximo; encendiéndolo posteriormente. Cuando se llegó a las 15 libras a
una temperatura de 125° C de presión se debe mantener por 15 minutos y después se abrió
la válvula para disipar el vapor; apagándolo y desconectándolo seguidamente.

Se esperó 15 minutos para que la temperatura descendiera; procediendo a abrir de la misma

manera que se cerró para poder retirar los materiales ya esterilizados, los cuales se los
rotuló y ubicó en el área de repisas de materiales y químicos. Este proceso se lo realizó
diariamente.

Fotografía 8, 9 y 10. Materiales autoclavalos (botellas de ½ Lt, tubos, pipetas y

micropipetas Pasteur) y agua salada autoclavada.

21
4.4. MÉTODOS PARA MEDIOS DE CULTIVO DE LAS MICROALGAS

El medio de cultivo se enriquece de nutrientes, los cuales se elaboró con base en la

formulación sugerida por Guillard y Ryther 1962.

4.4.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

4.4.1.1. SOLUCIONES PARA CLOROFITAS Y DIATOMEAS

En esta solución se utilizó macronutrientes como Nitrato de Sodio, Fosfato de Sodio y Meta
silicato de Sodio en medio litro de agua dulce desionizada autoclavada.

4.4.1.1.1. SOLUCIÓN 1 DE CLOROFITAS

En un vaso de precipitación de 1000 ml; se midió 200 ml de agua dulce desionizada

autoclavada, luego se pesó en una balanza electrónica 37,5 gr de Nitrato de sodio, el cual se
vertió en el vaso de precipitación para ser sometidos al agitador magnético con 450
revoluciones.

Fotografía 11. Disolución de Nitrato de sodio con agua dulce autoclavada en el agitador
magnético.

Después se pesó 2,5 gr de Fosfato de Sodio, este se agregó en el vaso antes mencionado
con 200 ml de H2O agitando hasta disolver el compuesto; finalmente se enrazó con H2O
hasta llegar a los 500 ml.

Fotografía 12 y 13. Peso del Fosfato de Sodio y aumento el volumen del agua en el vaso de
precipitación.

22
4.4.1.1.2. SOLUCIÓN 1 DIATOMEAS

Al igual que las clorofitas, se midió 200 ml de agua dulce desionizada autoclavada, luego
se pesó en una balanza electrónica 37,5 gr de Nitrato de sodio, el cual se vertió en el vaso
de precipitación para ser sometidos al agitador magnético.

Fotografía 14 y 15. Peso del Nitrato de sodio y medición del agua dulce autoclavada junto
con el agregado del compuesto.

Se pesó 2,5 gr de Fosfato de Sodio, el cual se colocó en el vaso de precipitación con 100
ml de H2O posterior a esto se agitó con el equipo antes mencionado; luego se le agregó 15
gr de Meta silicato de Sodio (compuesto esencial para las paredes celulares de diatomeas)
en 100 ml de H2O, para su disolución se agitó y por último se agregó agua hasta enrasar a
los 500 ml.

Fotografía 16, 17 y 18. Agregado del Meta silicato de sodio en la solución con agua dulce
autoclavada sometiendo al agitador magnético y enrase de la solución.

23
4.4.1.2. SOLUCIÓN 2 DE MICRONUTRIENTES Y METALES TRAZA

En esta se utilizó un vaso de precipitación con 400 ml H2O dulce autoclavada para 1,6 gr
de Cloruro de Sodio y 1,2 gr de EDTA, es decir 200 ml por cada químico; sometiéndolos
al agitador magnético hasta disolver los compuestos.

4.4.1.2.1. PREPARACIÓN DE METALES TRAZA

Se utilizó una probeta de 100 ml y en ella se midió 50 ml de agua dulce desionizada

autoclavada, la cual se ubicó en una fiola; este proceso se lo realizó para cada uno de los
metales trazas que se utilizaron.

Luego se pesó 0.5 gr de Sulfato de Cobre, 9 gr de Cloruro de Magnesio, 0.3 gr de

Molibdato de Sodio, 1.1 de Sulfato de Zinc y 0.5 gr de Cloruro de Cobalto; los cuales se los
colocó en su fiola respectiva y se las agitó manualmente.

Después se flameó una pipeta de 1 ml y se dejó enfriar en el vaso de precipitación, tomando

0.5 ml de cada una de la soluciones de metales traza ubicándolos el vaso de precipitación
de 400 ml ya preparados anteriormente; finalmente se enrazó hasta los 500 ml. A esta
solución se le agregó de 5 a 6 gotas de Ácido sulfúrico para acidular la solución debido a
que las Tetraselmis son muy sensibles al pH.

Fotografía 19 y 20. Preparación de la solución 2.

4.4.1.3. SOLUCIÓN DE VITAMINAS

En un vaso de precipitación de agregó una ampolla de complejo B en 500 ml de agua dulce

autoclavada, se agitó para homogenizar la solución.

24
Una vez preparada las soluciones se procedió a encender la lámpara de alcohol para vaciar
el contenido en una botella café oscuro cerca de esta para evitar contaminación de
bacterias a dicha solución; además a la botella se le hizo una tapa de aluminio que fue
flameada junto con el pico; finalmente rotulándolas y guardándolas en la nevera.

Fotografía 21 y 22. Llenado de la solución de Diatomeas y refrigeración de las mismas.

4.4.2. AGUA DE MAR ENRRIQUECIDA

El medio en el cual se reprodujeron las microalgas, se preparó en 1Lt de H2O salada

autoclavada; agregándole desde 1 ml de las soluciones de macronutrientes, secundaria y
vitaminas con una pipeta previamente esterilizada para cada solución y con la lámpara de
alcohol encendida en la cabina de cristal. Rotulando cada botella.

En caso de la solución de macronutrientes para la especie de Tetraselmis se le agregó la

Solución 1 de Clorofitas y en Thalassiosira de Solución 1 de Diatomeas.

Fotografía 23. Agua salada autoclavada enriquecida con nutrientes.

25
4.5. ESCALACIÓN DEL CULTIVO EN TETRASELMIS Y THALASSIOSIRA

Se obtuvo muestra de Thalassiosira sp y Tetraselmis sp del sector El Matal del laboratorio

NESLARVA; cuando ya estaba acondicionado el área donde se trabajó; pasándolas de
fundas plástica a botellas de ½ litro con aireación e iluminación; para la inoculación y
comienzo del cultivo. Además la mitad del contenido de estas botellas se los vertió en otra;
agregando a los recipientes agua enriquecida con nutrientes dejándolas de igual modo que
las anteriores, se tomó una botella de cada microalga envolviéndolas con papel aluminio
para guardarlas en la nevera; en caso de presentarse un inconveniente en el cultivo.

4.5.1. EN TUBOS DE ENSAYO DE 20 ML.

Para inoculación la asepsia es importante debido a que se realizó la desinfección de manos

con alcohol antiséptico durante el proceso.

Este se lo realizó en una cabina de cristal donde el mechero cumplía una parte esencial
eliminando toda fuente de contaminación en esa área, cerca de este se utilizó un tubo de
ensayo de 20 ml agregándole ¾ partes de agua salada autoclavada enriquecida con
nutrientes, luego se flameó ambos recipientes con sus respectivas tapas.

A una pipeta de 1 ml esterilizada se la flameó, tomando con ella 1 ml de las muestras de

microalgas que se mantuvo al principio del cultivo (botella de ½ litro) o de aquel tubo de
mayor concentración; esto se lo ubicó en el medio de cultivo del recipiente (tubo de
ensayo) donde se inoculó. Proporcionándoles iluminación con lámparas del tipo cool white
de igual manera en las siguientes escalaciones del cultivo y agitación manual diariamente
para su homogenización y oxigenación.

Fotografía 24. Tubos de ensayos inoculados con Tetraselmis sp y Thalassiosira sp.

26
4.5.2. EN BOTELLAS DE 500 ML

Al igual que los tubos se llenó con ¾ partes con H2O salada autoclavada enriquecida,
vertiendo la concentración celular de los tubos de ensayo en el recipiente.

En este nivel de cultivo se le aplica aireación con mangueras de 1 pulgada previamente

desinfectadas con alcohol por medio de un blower para que haya una distribución
homogénea de nutrientes y el cultivo no se sedimente.

Fotografía 25 y 26. Botellas de ½ Lt con aireación e iluminación ya inoculados.

4.5.3. EN BOTELLAS DE 1 LT.

Este tipo de recipiente debió contener la mitad de H2O salada enriquecida para inocular en
este la concentración de las botellas antes mencionadas cerca de la lámpara de alcohol
flameando tapa y boca de la botella. También se aplica aireación.

Fotografía 27 y 28. Botellas de 1 Lt de Tetraselmis sp y Thalassiosira sp con aireación e

iluminación.

27
4.5.4. EN GALONES DE 6 LT.

El H2O utilizada en este cultivo fue solo filtrada y neutralizada, agregándole 1 ml de

soluciones por cada litro de agua que se llenó el galón y el contenido de la botella de 1 Lt
de mayor concentración, conjuntamente con aireación.

Fotografía 29 y 30. Galones de 6 Lt con Tetraselmis sp y Thalassiosira sp con aireación.

4.5.5. TIEMPO DE ESCALACIÓN DEL CULTIVO

Los recipientes inoculados ya sea tubos de ensayo de 20 ml, botellas de ½ y 1 Lt y galones

de 6 L son mantenidos por un tiempo de 3 días contando desde la inoculación hasta ser
transferidos a los otros recipientes.

4.6. CUANTIFICACIÓN DE LAS MICROALGAS.

Para determinar la concentración celular en los recipientes de la escalación transcurrido el

tiempo antes mencionado y así con una micropipeta Pasteur esterilizada y flameada se
tomó una muestra.

En el caso de Tetraselmis sp se requirió ubicar la muestra en cajas Petri agregándoles de 4

a 5 gotas de lugol fijándolas debido a que poseen flagelos para movilizarse impidiendo el
conteo; mientras que en Thalassiosira no.

Con la micropipeta al depositar una pequeña parte de la muestra en el espacio entre la

cámara de Neubauer y el cubre objeto esta se absorbe por capilaridad formando un ángulo
de 45°.

28
El conteo se lo realizó en los cuadrantes externos de la cámara debido a que las células eran
mayor a 8 micras; excluyendo aquellas que toquen las líneas del lado derecho e inferior;
sumando, multiplicando y dividiendo por el número de cuadrantes contados. La
concentración celular se expresa en células por mililitro (cel/ml).

Fotografía 31 y 32. Cámara de Neubauer y Microscopio instrumentos que ayudan a

determinar el crecimiento celular.

 Análisis estadístico

Los datos obtenidos de las concentraciones celulares (cel/ml) en la escalación del cultivo
de microalgas es decir de tubos de ensayo hasta galones de 6 Lt; fueron presentados con sus
medias muestrales, desviación típica, máximo y mínimo en relación al tiempo estipulado en
la investigación.

29
 VII. RESULTADOS

7.1. DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN.

Para el cultivo de las especies de microalgas es importante tener una excelente calidad del
agua, por ello se realizó un análisis microbiológico en Agar TCBS (Tiosulfato Citrato Bilis
Sacarosa), trabajando con cuatro repicas de agua salada autoclavada, con lo cual se
comprobó que no existía ningún tipo de vida bacteriana ni formación de UFC, debido a que
esta H2O fue sometida a varios procesos como: sedimentación, filtración, clorinación,
neutralización y esterilización.

Fotografía 33. Placas de agar TCBS con muestras de microalgas

30
7.2. CRECIMIENTO CELULAR

7.2.1. CONCENTRACIÓN INCIAL DE MICROALGAS.

En el laboratorio de microalgas la concentración inicial del cultivo fue 762500 cel/ml en

Thalassiosira sp teniendo mayor número de células y el color más fuerte y concentrado; mientras
que 345000 cel/ml en Tetraselmis sp. (Tabla 1).

Tabla N° 1. Concentración inicial del cultivo de microalgas.

Concentración inicial del cultivo de microalgas

ESPECIES THALASSIOSIRA TETRASELMIS

CEL/ML 762500 345000

Concentración inicial en cel/ml del

cultivo de microalgas.
762500
800000
700000
600000
500000 345000
cel/ml

400000
300000
200000
100000
0
THALASSIOSIRA TETRASELMIS

Gráfico N° 1. Concentración inicial del cultivo de microalgas en cel/ml

31
7.2.2. CRECIMIENTO CELULAR EN LA ESCALACIÓN DEL CULTIVO DE MICROALGAS (TETRASELMIS SP Y
THALASSIOSIRA SP).

En la escalación del cultivo de microalgas durante Junio a Agosto del presente año presentó variabilidad; donde la concentración
promedio de Thalassiosira sp en tubos de ensayo fue de 182075,40 cel/ml y en botellas de ½ Lt de 253104,56 cel/ ml, siendo estos
mayor en esta microalga; mientras que en Tetraselmis sp predominaban en botellas de 1 Lt con 404215,88 cel/ml y en galones de 6 Lt
con 747895,73 cel/ml (Tabla 2)

Tabla N°2. Estadística descriptiva del crecimiento celular (cel/ml) de Tetraselmis sp y Thalassiosira sp durante Junio a Agosto del
2014.

Concentración en cel/ml en la escalación de cultivo de

Especie THALASSIOSIRA TETRASELMIS
Tubos de Botellas de ½ Botellas de Tubos de Botellas de Botellas de Galones de
Recipientes Galones de 6 Lt
ensayo Lt 1 Lt ensayo ½ Lt 1 Lt 6 Lt
Media
182075,40 253104,56 337792,17 552891,03 234908,60 237531,11 404215,88 747895,73
aritmética
Mínimo 23333,33 11500 37500 62500 11500 5000 63958,33 175000
Máximo 1041666,67 511666,67 712500 3375000 1182916,67 1105000 4475833,33 2250000

32
En el grafico 2 se presenta la escalación del cultivo de Tetraselmis sp y Thalassiosira sp donde el crecimiento celular fue ascendente,
debido al número de células en división con un volumen diferente de H2O salada enriquecida cada vez mayor por los recipientes
durante el periodo de junio a agosto del 2014.

800000 747895.73

700000

600000 552891.03

500000
404215.88
Cel/ml

400000 337792.17

300000 253104.56 237531.11

182075.4
200000 134908.6

100000

0
Tubos de Botellas de ½ Botellas de 1 Galones de 6 Tubos de Botellas de ½ Botellas de 1 Galones de 6
ensayo Lt Lt Lt ensayo Lt Lt Lt
THALASSIOSIRA TETRASELMIS

Gráfico N°2. Gráfica de barras del crecimiento celular (cel/ml) de Tetraselmis sp y Thalassiosira sp durante Junio a Agosto del 2014.

33
7. 2.2.1. TUBOS DE ENSAYO DE 20 ML.

En tubos de ensayo la concentración presentó gran variabilidad de promedios mensuales

durante el tiempo que duró el cultivo; mostrando en Tetraselmis el mes de Junio 109488,10
± 84199,15 cel/ml; disminuyendo en Julio 91772,44 ± 78683,40 cel/ml y en Agosto
incrementó a 181043,10 ± 242806,43 cel/ml, siendo el valor mínimo con 9166,67 cel/ml y
el máximo 1182916,67 cel/ml; mientras que en Thalassiosira en Junio con 248750 ±
210337,55 cel/ml; declinando en Julio a 164063,89 ± 92837,15 cel/ml y en Agosto aumentó
con 180420,14 ± 205198,06 cel/ml, por lo cual el mínimo fue de 23333,33 y un máximo de
1041666,67 (Tabla 3).

Tabla N° 3. Estadística descriptiva de la concentración de cel/ml en tubos de ensayo de 20

ml en Thalassiosira durante Junio a Agosto del 2014.

Concentración en cel/ml de tubos de ensayo de 20 ml

Especie THALASSIOSIRA TETRASELMIS
Meses Junio Julio Agosto Junio Julio Agosto

Promedio 248750 ± 164063,89 180420,14 109488,10 91772,44 181043,10

(X ± S) 210337,55 ±92837,15 ±205198,06 ±84199,15 ±78683,40 ±242806,43

Mínimo 23333,33 30000 23333,33 22500 11500 9166,67

Máximo 780000 450000 1041666,67 260000 311666,67 1182916,67

El grafico 3 muestra la concentración celular promedio que se obtuvo en tubos de ensayo

de Thalassiosira sp y Tetraselmis sp entre Junio a Agosto del 2014.

34
 248750
250000
181043.10
200000 180420.14
164063.89

150000

Cel/ml
109488.10 THALASSIOSIRA
91772.44
100000 TETRASELMIS

50000

0
JUNIO JULIO AGOSTO

Gráfico N° 3. Gráfica de barras de concentración de cel/ml en tubos de ensayos de 20 ml

de Thalassiosira sp y Tetraselmis sp entre Junio a Agosto del 2014.

7.2.2.2. BOTELLAS DE ½ LITRO.

El cultivo en estos recipientes presentó una notoria variabilidad en cuanto al promedio del
crecimiento celular mensual; siendo este en Thalassiosira durante Julio de 263547,84 ±
124629,42 cel/ml; disminuyendo considerablemente en Agosto de 242259,62 ± 131199,97
cel/ml, además en este se presentó la concentración mínima con 11250 cel/ml y máxima
con 511666,67 cel/ml; sin embargo en Tetraselmis sucedió lo inverso, es decir en Julio fue
de 184692,46 ± 226915,82 cel/ml con un mínimo de 5000 cel/ml y un máximo de 1105000
cel/ml y elevándose en Agosto con 275793,59 ± 237027,99 cel/ml (Tabla 4).

Tabla N° 4. Estadística descriptiva de la concentración de cel/ml en botellas de ½ Lt en

Thalassiosira sp y Tetraselmis sp durante Julio a Agosto del 2014.

Concentración en cel/ml de botellas de ½ Lt

Especie THALASSIOSIRA TETRASELMIS
Meses Julio Agosto Julio Agosto
Promedio 263547,84 ± 242259,62 ± 184692,46 ± 275793,59 ±
(X ± S) 124629,42 131199,97 226915,82 237027,99
Mínimo 70000 11250 5000 10000
Máximo 500833,33 511666,67 1105000 785000

35
El grafico 4 muestra la concentración celular promedio que se obtuvo en botellas de ½ Lt
de Thalassiosira sp y Tetraselmis sp entre Julio a Agosto del 2014.

263547.84 275793.59
300000.00
242259.62
250000.00
184692.46
200000.00
JULIO
Cel/ml

150000.00
AGOSTO
100000.00

50000.00

0.00
THALASSIOSIRA TETRASELMIS

Gráfico N° 4. Gráfica de barras de concentración de cel/ml en botellas de ½ Lt en

Thalassiosira sp y Tetraselmis sp entre Julio a Agosto del 2014.

7.2.2.3. BOTELLAS DE 1 LITRO.

En ambas especies de microalgas hubo inestabilidad en el promedio mensual durante el

cultivo, por lo que en Thalassiosira el mes de Julio fue de 336535,76 ± 121406,96 cel/ml
disminuyendo en Agosto de 292206,90 ± 210492,06 cel/ml por la presencia de
protozoarios; mientas que en Tetraselmis en Julio de 425386,90 ± 947105,52 cel/ml y
disminuyendo en Agosto 341123,13 ± 207383,97 cel/ml. (Tabla 5)

Tabla N° 5. Estadística descriptiva de la concentración de cel/ml en botellas de 1 Lt en

Thalassiosira sp y Tetraselmis sp durante Julio a Agosto del 2014.

Concentración en cel/ml de botellas de 1 Lt

Especie THALASSIOSIRA TETRASELMIS
Meses Julio Agosto Julio Agosto
Promedio 349608,68 ± 326884,62 ± 498453,95 ± 342473,70 ±
(X ± S) 127854,87 193887,83 982112,87 205732,41
Mínimo 124166,67 37500 63958,33 98333,33
Máximo 615000 712500 4475833,33 840000

36
El grafico 5 muestra la concentración celular promedio en botellas de 1 Lt en los dos tipos
de microalgas entre Julio a Agosto del 2014.

498453.95
500000.00

349608.68
400000.00 326884.62 342473.70

300000.00 JULIO
Cel/ml

AGOSTO
200000.00

100000.00

0.00
THALASSIOSIRA TETRASELMIS

Gráfico N° 5. Gráfica de barras de concentración de cel/ml en botellas de 1 Lt en

Thalassiosira y Tetraselmis entre Julio a Agosto del 2014.

7.2.2.4. GALONES DE 6 LITROS.

El crecimiento celular en galones de 6 Lt de Thalassiosira sp fue en Julio de 298777,78 ±

208530,49 cel/ml elevándose en Agosto con 513958,33 ± 673658,86 cel/ml; mientras que
en Tetraselmis en Julio fue de 337083,33 ±325312,99 cel/ml y en Agosto se incrementó
725950 ± 466620,77 cel/ml (Tabla 6).

Tabla N° 6. Estadística descriptiva de la concentración de cel/ml en galones de 6 Lt en

Thalassiosira y Tetraselmis durante Julio a Agosto del 2014.

Concentración en cel/ml de galones de 6 Lt

Especie THALASSIOSIRA TETRASELMIS
Meses Julio Agosto Julio Agosto
Promedio 298777,78 ± 616750 ± 404500 ± 725950 ±
(X ± S) 208530,49 694710,80 313365,80 466620,77
Mínimo 62500 82500 187500 175000
Máximo 645000 3375000 950000 2250000

37
El grafico 6 muestra la concentración celular promedio que se obtuvo en galones de 6 Lt
Thalassiosira y Tetraselmis entre Julio a Agosto del 2014.

725950
800000
700000
513958.3333
600000
500000 JULIO
337083.3333
Cel/ml

400000 298777.7778
AGOSTO
300000
200000
100000
0
THALASSIOSIRA TETRASELMIS

Gráfico N° 6. Gráfica de barras de concentración de cel/ml en galones de 6 Lt en

Thalassiosira y Tetraselmis entre Julio a Agosto del 2014.

38
 VIII. CONCLUSIONES

El agua salada filtrada, neutralizada y autoclavada estuvo libre de contaminación debido a

que a los resultados del análisis microbiológico que se realizó con el Agar TCBS por lo
cual en estas no creció ningún tipo de bacterias por los diversos procesos de desinfección y
esterilización a los que fue sometida, sin embargo en algunos casos los materiales a utilizar
en el laboratorio no cumplían con los requerimientos de desinfección deseados para el
cultivo porque en ellos se encontraban residuos de microalgas, soluciones por ende este
proceso debía realizarse de nuevo hasta estar bien limpios.

La escalación de ambas especies de microalgas se la realizó diariamente con diversos

volúmenes de agua salada enriquecida debido a la capacidad de los recipientes (tubos de
ensayo de 20 ml, botellas de ½ y 1 Lt y galones de 6 Lt) donde se sembraron, por lo cual a
mayor concentración de células a inocular los requerimientos del medio del cultivo serán
mayores y el crecimiento de las microalgas aumentará siempre que estos no se contaminen.

El crecimiento celular en Tetraselmis sp durante el primer mes del cultivo fue bajo en
relación con los otros meses, debido a que la solución 2 no se la aciduló, debido a que estas
son muy sensibles al pH provocando su poco crecimiento y perdida de cultivo después de
colocar de 5 a 6 gotas de ácido sulfúrico a dicha solución en los recipientes hubo mayor
crecimiento; mientras que en Thalassiosira sp la concentración celular disminuyó en las
últimas semanas por la presencia de protozoarios, además se notó incluso mezcla de
células Tetraselmis en la escalación de este cultivo, debido a la inadecuada desinfección de
los materiales utilizados en el laboratorio.

39
 IX. RECOMENDACIONES

La desinfección de las manos con alcohol antiséptico y el uso de la lámpara de alcohol debe
ser muy frecuente a la hora de realizar la escalación del cultivo, preparación de soluciones y
para materiales a esterilizar.

Se debe reportar todo incidente o accidente que ocurra en el laboratorio sobre todo si
trabajan varios grupos debido a la confusión de alguna eventualidad y no se sabrá el por
qué; además se debe trabajar todos los días, porque al no hacerlo se puede fracasar en
cultivo y en el campo laboral esto ocasiona perdida de dinero y tiempo.

Al momento de la preparación de las soluciones para los medios del cultivo donde se
inocularán, no se debe olvidar de acidular la solución 2 para que el crecimiento de las
microalgas como las Tetraselmis no sea afectado y haya una mayor productividad.

Cuando se realice el conteo celular debe usarse una micropipeta Pasteur por cada recipiente
para evitar contaminación biológica (protozoarios y otra microalga).

40
 X. ANEXOS

Fotografía 34. Laboratorio de microalgas con Tetraselmis sp. y Thalassisira sp.

Fotografía 35. Repisas donde se encuentran los químicos o reactivos y materiales que se
usan en la escalación del cultivo (botellas de ½ Lt, pipetas, micropipetas, tubos de ensayo,
etc.)

41
 XI. BIBLIOGRAFÍAS

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