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Tesis101 PDF
Tesis101 PDF
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el título de:
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia”.
ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
APROBADO
_______________________________
ANA KARINA CARRASCAL CAMACHO. MSc
Directora
_________________ __________________
NADENKA MELO ADRIANA PÁEZ
Jurado Jurado
ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
APROBADO
______________________ ____________________
ANGELA UMAÑA MUÑOZ JANETH ARIAS PALACIOS
BIOLOGA PhD MICROBIÓLOGA MSc.
Decana Acadêmica Director de Carrera
AGRADECIMIENTOS
Lina María.
A Dios, por darme la sabiduría, fuerza y paciencia en la
culminación de este trabajo y de esta etapa de mi vida.
A mi mamá y mi papá por esa confianza que depositaron en
mí, por ser mis amigos y por darme todo su apoyo y amor.
A mi hermano por desearme lo mejor.
A Luis Gabriel Rivera Mora por ese amor y compañía
incondicionales.
A mis familiares y amigos por su interés.
A Lina, por su amistad, por su comprensión y por hacer
posible la finalización de este trabajo.
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 3
2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 5
2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos ................................................ 5
2.1.1 Métodos de prevención de enfermedades transmitidas por alimentos . 8
2.2 Tratamiento térmico .................................................................................. 8
2.2.1 Esterilización comercial ......................................................................... 9
2.2.2 Pasteurización ..................................................................................... 10
2.2.3 Causas de la muerte térmica y mecanismo de termorresistencia ........ 11
2.2.4 Valores D y Z ....................................................................................... 12
2.2.5 Factores que influyen sobre la determinación de la termorresistencia. 13
2.2.6 Las conservas y el tratamiento térmico................................................ 13
2.2.7 Transmisión del calor en el alimento envasado ................................... 14
2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos ............................ 15
2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas ........... 16
2.3.2 Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales
...................................................................................................................... 18
2.3.2.1 Método de difusión en agar .............................................................. 19
2.3.2.2 Método de dilución ............................................................................ 19
2.4 Minthostachys mollis ............................................................................... 20
2.5 Listeria monocytogenes .......................................................................... 23
2.5.1 Generalidades ..................................................................................... 23
2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes .............................................. 24
2.6 Bacillus cereus ........................................................................................ 25
2.6.1 Generalidades ..................................................................................... 25
2.6.2 Termoresistencia de Bacillus cereus ................................................... 25
3. JUSTIFICACIÓN .......................................................................................... 28
4. OBJETIVOS ................................................................................................. 29
4.1 Objetivo general ...................................................................................... 29
4.2 Objetivos específicos .............................................................................. 29
5. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 30
1
5.1. Obtención de cepas ............................................................................... 30
5.2 Elaboración del banco de células primario (BCP) ................................... 30
5.3 Curvas de crecimiento ............................................................................ 30
5.4 Evaluación de la termorresistencia ......................................................... 32
5.4.1 Elaboración de curvas de inactivación térmica .................................... 32
5.4.2 Elaboración de la salsa y evaluación de termorresistencia en salsa. .. 32
5.5 Obtención de la planta ............................................................................ 33
5.5.1 Obtención del aceite esencial de Minthostachys mollis ....................... 33
5.6 Evaluación de la actividad antimicrobiana. ............................................. 33
5.6.1 Método difusión en agar con disco para bacterias ............................... 33
5.6.1.1. Preparación del inóculo ................................................................... 33
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................... 35
6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de células......................... 35
6.2 Cinética de crecimiento de Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. .. 37
6.3 Elaboración de la conserva..................................................................... 41
6.4 Evaluación de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus (en
caldo BHI y sobre alimento) .......................................................................... 43
6.4.1 Inactivación térmica de L. monocytogenes .......................................... 43
6.4.2 Inactivación térmica de Bacillus cereus ............................................... 46
6.5 Extracción del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluación de la
actividad antimicrobiana ...................................................................................
...................................................................................................................... 51
7. RECOMENDACIONES ................................................................................ 59
8. CONCLUSIONES ......................................................................................... 59
9. REFERENCIAS ............................................................................................ 60
Recursos electrónicos .................................................................................. 71
2
1. INTRODUCCIÓN
3
la tendencia actual a utilizar sustancias antimicrobianas debido a su conocido
efecto microbicida.
4
2. MARCO TEÓRICO
5
Las enfermedades causadas por el consumo de alimentos contaminados tienen
un amplio impacto en la salud pública y en la economía en todo el mundo
(Gandhi y Chikindas. 2007). Entre los factores asociados a estos cambios
globales se pueden señalar el crecimiento de la población, la pobreza, la
urbanización en los países subdesarrollados, el comercio internacional de
alimentos para humanos y animales así como también la aparición de nuevos
agentes productores de ETA o nuevas mutantes con una mayor patogenicidad.
Otros factores importantes en cuanto a la manipulación incorrecta de los
alimentos que contribuyen a los brotes producidos por estos se muestran a
continuación en la figura 1 (McCabe-Sellers y Beattie. 2004). La temperatura
inadecuada es el principal factor reportado que contribuye a la transmisión de
enfermedades producidas por alimentos (Olsen, et al, 2000).
Figura 1. Factores que contribuyen a los brotes producidos por los alimentos a
partir de 1993 - 1997
Fuente: McCabe-Sellers y Beattie. 2004
6
Por esta y otras razones en países latinoamericanos, donde estos problemas
se intensifican desde 1989, la Organización Panamericana de la Salud (OPS)
ha estado trabajando con sus Estados Miembros para formar la capacidad
nacional de vigilancia de ETA. Las debilidades todavía persisten en muchos
países en la vigilancia epidemiológica: notificación de enfermedades, detección
e investigación de los brotes y el análisis de datos para la toma de decisiones
en las políticas y programas. Es por consiguiente difícil evaluar
adecuadamente la situación de las ETA en la región latinoamericana
(www.aam.org.ar). En el caso particular de Colombia y de la capital del país,
las enfermedades transmitidas por alimentos constituyen un grave problema de
salud pública (www.comunidadandina.org), pues se ha demostrado un
incremento en los últimos años. Entre 1991 y 1998 se han reportado 21443
casos individuales de ETA. En cuanto al reporte de brotes de las ETA, ha
mostrado un leve incremento desde 1998 hasta el año 2000. Para 1998 fueron
reportados por el Sistema Alerta Acción un total de 28 brotes de ETA, y para
los siguientes dos años un total de 35 y 37 brotes, con rangos de variación de
dos a cuatrocientas personas afectadas (http://www.saludcapital.gov.co). Para
el 2007 se notificaron al sistema nacional de vigilancia 1594 casos de
enfermedades transmitidas por alimentos, lo que representa una disminución
del 22.65 % con respecto al mismo periodo del año anterior en el cual se
notificaron 2061 casos. Hasta el tercer periodo epidemiológico del 2007, se
presentó el mayor número de casos, debido a la ocurrencia de cuatro brotes,
uno en el Municipio de Soledad (Atlántico) que aportó 199 casos, otro en el
municipio de Tena (Cundinamarca) que aportó 69 casos, otro en Maicao (La
Guajira) que aportó 53 casos y otro en el municipio de Chinchiná (Caldas) que
aportó 48 casos de los 469 notificados en esa semana.
7
con el 4.27 %, Magdalena con el 4.20%, Boyacá con el 4.14 % y en menor
porcentaje: Santander, Quindío, Meta, Valle, Huila, Vichada, Arauca, Cesar,
Casanare, Nariño, Chocó, Cauca, Putumayo, Amazonas, Barranquilla,
Risaralda, Norte de Santander, Cartagena. No notificaron casos de ETA:
Caquetá, Guainía, Guaviare, San Andrés, Santa Marta, Tolima y Vaupés.
Por lo anterior es necesario que la comunidad en general tenga y maneje
algunos elementos mínimos que le permita prevenir estas enfermedades.
(ttp://www.ins.gov.co).
Se han utilizado diversos procesos que tienen como fin evitar la proliferación
microbiana en los alimentos, evitando así la aparición de ETA. Dentro de los
métodos de control más utilizados se encuentran el tratamiento térmico
(pasteurización, esterilización), irradiación (radiación UV), almacenamiento a
bajas temperaturas (congelación, refrigeración), conservantes químicos
(nitritos), conservación por medio de sustancias naturales que poseen actividad
antimicrobiana, tales como los aceites esenciales derivados de plantas, entre
otros (Adams, 1997).
8
solamente una parte del proceso de conservación, y suele aplicarse en
combinación con otros procesos. Actualmente, el tratamiento térmico es uno
de los tratamientos que hacen posible la existencia de productos sanos de
larga vida comercial. El tratamiento térmico permite que las conservas se
puedan almacenar a temperatura ambiente garantizando su seguridad (Rees,
1994).
Las formas vegetativas de bacterias, levaduras y hongos se destruyen casi
instantáneamente a 100°C y normalmente no constituyen ningún problema en
el tratamiento térmico de las conservas, pero las esporas de ciertas especies
bacterianas son extraordinariamente resistentes al calor y para su destrucción
se necesita exponerlas, durante periodos prolongados de tiempo a altas
temperaturas. La velocidad de destrucción es función del tiempo y la
temperatura y varia con las diferentes especies; permaneciendo constantes los
demás factores, la destrucción es tanto mas rápida cuanto más alta sea la
temperatura. Por ello, las condiciones letales para un microorganismo no
pueden expresarse diciendo que muere a tal temperatura, si no que es preciso
señalar un tiempo de exposición a una temperatura determinada. (Herson,
1980).
Los dos métodos mas utilizados hoy en día para la conservación de alimentos
son la esterilización y la pasteurización (Torres, 2007).
9
La esterilización, como método de conservación se aplica con el fin de evitar la
entrada de microorganismos y de oxígeno. El objetivo de la conserva, cuyo
punto principal es la esterilización comercial, es destruir todos los
microorganismos patógenos que puedan existir en el producto y prevenir el
desarrollo de aquellos que puedan causar deterioro (Paltrinieri y Figuerola,
1993).
2.2.2 Pasteurización
10
2.2.3 Causas de la muerte térmica y mecanismo de termorresistencia
11
Por otro lado Powell y Starng comprobaron que la sal cálcica del DPA
constituye hasta 15% del peso seco de la espora, pero no de las formas
vegetativas. Después de la germinación se libera esta sustancia con perdida
de termorresistencia. Otras teorías apoyan la explicación que se basa en la
deshidratación osmótica del protoplasma por la corteza que lo rodea, que es
expansible e impermeable a los cationes multivalentes. Las condiciones más
rigurosas exigidas para la destrucción de las esporas por calor seco son
probablemente necesarias para los efectos deshidratantes suplementarios y la
temperatura mayor que la necesaria puede lesionar el DNA de la espora.
(Herson y Hulland, 1980).
2.2.4 Valores D y Z
12
tiempo de reducción decimal, se puede calcular si la inactivación térmica de las
pruebas se realiza con diferentes temperaturas (James, 2006). Estos dos
valores ofrecen la base para calcular el tiempo en los procesos del sector
alimenticio. (Rahmana, 2004).
Por otra parte, la disponibilidad del agua tiene también un gran impacto en la
transferencia del calor a los microorganismos. La influencia de la actividad de
agua en los microorganismos es compleja, combinando los factores intrínsecos
(el potencial nutritivo, el pH, y los compuestos antimicrobianos como el SO2,
nitratos, y nitritos) y factores extrínsecos (temperatura, oxígeno, tratamientos
químicos, e irradiación), que varían en función de las clases de alimentos y de
microorganismos. Los estudios han demostrado que la resistencia térmica de
microorganismos aumenta mientras que su contenido en agua disminuye y ese
nivel óptimo de la resistencia ocurre entre aw = 0.20 y 0.50, dependiendo del
microorganismo estudiado (Larochea et al, 2005).
13
conservadas (Sielaff, 2000). Durante el proceso es necesario, conservar las
cualidades organolépticas y nutritivas (Hersom y Hulland, 1980).
14
2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos
Muchas hierbas y especias han sido usadas durante siglos para proporcionar
sabores diferentes a los alimentos y éstas pueden presentar también actividad
antimicrobiana (Ultee et al, 2002). Los compuestos responsables de esta
actividad son a menudo fracciones del aceite esencial, las cuales consisten
principalmente en compuestos fenólicos (Conner, 1993). Los aceites
esenciales de plantas y sus componentes que presentan actividad
antimicrobiana (Akgul y Kivanc, 1988), tienen gran aplicación para el control del
crecimiento de patógenos de alimentos por lo que se utilizan como método de
preservación (Hao et al, 1998). Se ha reportado que la actividad
antimicrobiana se deriva de terpenoides y compuestos fenólicos en los aceites
(Yamazaki et al, 2003).
15
Los aceites esenciales comúnmente se concentran en una región particular
como hojas, corteza o frutos; y cuando esto ocurre en diferentes órganos en la
misma planta, frecuentemente su composición es diferente (Oussalah et al,
2005). Aunque comúnmente se piensa que son derivados de hierbas y
especias, están presentes hasta cierto punto en muchas plantas con un papel
protector contra el ataque de bacterias, hongos o insectos. Éstos comprenden
principalmente monoterpenos, hidrocarburos cíclicos y su alcohol, aldehído o
derivados esteres.
Las plantas tienen una capacidad casi ilimitada para sintetizar sustancias
aromáticas, siendo la mayoría fenoles o sus derivados oxígeno – sustituídos.
En general son metabolitos secundarios (es decir, que no tienen un papel
esencial en el metabolismo de las plantas) (Walton et al, 1999), de los cuales
por lo menos el 10% se han aislado. En muchos casos, estas sustancias
sirven a la planta como mecanismos de defensa contra el ataque de
microorganismos, insectos y herbívoros. Algunos como los terpenoides,
proporcionan a la planta sus olores, otros (quinonas y taninos) son
responsables del pigmento de la planta (Murphy, 1999).
16
Dentro de los compuestos presentes en los extractos vegetales que poseen
actividad antimicrobiana, se pueden mencionar el timol, el carvacrol, o el
eugenol; algunos autores como Conner en 1993, reportaron la alta actividad
antimicrobiana de éstos compuestos en forma pura.
Por otra parte, el timol es un isómero del carvacrol que se ha visto implicado en
la desintegración de la membrana externa y en el incremento de la
permeabilidad de la membrana citoplasmática al ATP en células de Escherichia
coli y Salmonella thyphimurium. El timol y el cimol (precursor biosintético del
timol) son ejemplos de preservativos naturales que han sido reportados por
tener efectos inhibitorios sobre bacterias y hongos (Delgado et al, 2003).
17
Otros son los terpenoides y aceites esenciales, los alcaloides, lecitinas y
polipéptidos, entre otros (Murphy, 1999).
18
2.3.2.1 Método de difusión en agar
19
* La concentración mínima inhibitoria (MIC) o la máxima dilución inhibitoria
(MID). La restricción en el crecimiento de los microorganismos (análisis de la
actividad bacteriostática y fungistática) o la concentración mínima letal (MLC)
(análisis de la actividad bactericida y fungicida) (Kalemba, 2003).
20
Figura 2. Fotografía de Minthostachys mollis
Fuente: Autores
21
Diferentes estudios de la composición química del aceite esencial de
Minthostachys han reportado los compuestos carvacrol , pulegona, mentona,
isomentona, β-pineno y limoneno, mentol en cantidades relativas que varían
desde 9.3% hasta 65.8% (Figura 3)
22
2.5 Listeria monocytogenes
2.5.1 Generalidades
23
2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes
Se sabe que las células contienen varios blancos para la acción térmica, pero
ha sido propuesto por Miller, et al (2006) que la resistencia basal de calor de
estos microorganismos podría ser debida a la estabilidad intrínseca de
macromoléculas, o sea ribosomas, ácidos nucleicos, enzimas y proteínas
dentro de la célula y la membrana (Miller et al, 2006).
24
2.6 Bacillus cereus
2.6.1 Generalidades
25
su aislamiento de muchos alimentos crudos y procesados alrededor del mundo
(Claus y Berkeley, 1986).
26
mayor será el tiempo necesario para llevar a cabo su destrucción (Hersom y
Hulland 1980).
27
3. JUSTIFICACIÓN
28
4. OBJETIVOS
29
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Se trabajó con las cepas 146, 142, y 196 de Listeria monocytogenes aisladas
previamente de productos cárnicos y la cepa de Bacillus cereus que se obtuvo
de una colección del cepario de la Pontificia Universidad Javeriana (Correa,
2004).
Durante los 6 meses del estudio se realizaron pruebas de pureza a las cepas
utilizadas; esto se hizo mediante tinciones de Gram.
30
mismo caldo para iniciar la curva de crecimiento, en el transcurso de este
tiempo se tomaron muestras del inóculo, las dos primeras horas cada 15
minutos y después de estas dos horas cada 30 minutos, este procedimiento
seguido de la medición por duplicado de la absorbancia del inóculo a 620 nm,
utilizando caldo BHI estéril con glucosa al 0.5% como blanco, al finalizar las 12
horas, se observó que el cultivo alcanzó la fase estacionaria (Román, 2004.,
Rojas, 2007).
31
5.4 Evaluación de la termorresistencia
32
las mismas temperaturas usadas durante la elaboración de las curvas ya
mencionadas. Igualmente se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada
de cada tiempo y recuentos en agar TS para B. cereus y TSAYE para L.
monocytogenes. Para esto fue necesario pesar 10 g de salsa e inocularlos en
90 mL de agua peptonada para seguir haciendo las diluciones (Carrascal y col.
2003)
33
glucosa al 0.5% y se llevaron a incubación durante 12 horas a 37ºC, 130 rpm.
En el caso de B. cereus, se inoculó en 200 mL de caldo BHI adicionado con
almidón al 1% y se llevó a incubación durante 18 horas a 30ºC, 130rpm.
34
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
FECHA DE PRUEBA
14 de 20 de 17 de 10 de 22 de 8 de
Enero de Febrero Marzo de Abril de Mayo de Junio de
2007 de 2007 2007 2007 2007 2007
CEPA COLORACIÓN DE GRAM
L. Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
monocytogenes pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño
código 146 positivo positivo positivo positivo positivo positivo
L. Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
monocytogenes pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño
código 142 positivo positivo positivo positivo positivo positivo
L. Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
monocytogenes pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño pequeño
código 196 positivo positivo positivo positivo positivo positivo
Bacillus cereus Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
positivo positivo positivo positivo positivo positivo
esporula- esporula- esporula-
do do do
35
Figura 4. Fotografía de coloración de Gram de L. monocytogenes.
Fuente: Autores
36
utilizado en este caso, criopreservación con glicerol, fue favorable ya que es un
método que protege a las bacterias durante el almacenamiento en congelación
(Lynn, 2004). El glicerol actúa a nivel de membrana celular limitando el efecto
de la deshidratación celular, disminuyendo el punto de congelación de líquidos
biológicos intra y extracelulares y promoviendo la vitrificación en lugar de la
formación de cristales de hielo intracelulares (Rojas, 2007).
37
microorganismos adquieren mayor resistencia; además en esta fase se han
encontrado ciclos de división reductiva, incremento en la estabilidad del ARN y
en la resistencia a condiciones de estrés en bacterias patógenas (Arraíz et al,
2002). Según Robinson et al, 2001, las células en fase exponencial son
generalmente más frágiles y susceptibles a la injuria que en la fase
estacionaria.
38
C u rva crecim ien to Listeria mon ocytogenes
C ep a 142 curva 2
0,8
Abs a 620 nm
0,6
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tie m po (hora s)
C u rv a c re c im ie n to L is te ria m o n o cy to ge n e s
C epa 196
1
0,8
Abs 620 nm
0,6
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
T ie m p o (h o ra s)
0,6
Abs 620 nm
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tie m po (hora s)
39
Por otra parte, B. cereus alcanzó su fase estacionaria en un tiempo de 18 horas
como se puede observar en la figura 7. Al comparar los datos obtenidos en el
programa “Combase predictor”, donde B. cereus en condiciones ideales
alcanza la fase estacionaria en 12 horas, los resultados obtenidos en esta
investigación difieren por la siguiente razón: el medio utilizado en el programa
es caldo tripticasa de soya, mientras que en este estudio se utilizó caldo BHI
suplementado con almidón, lo que podría explicar el alargamiento de la fase
logarítmica; B. cereus posee amilasas que son activadas en presencia de
almidón, y como sucedió en este estudio, la cepa inició una segunda fase (fase
de diauxia), una vez terminado el consumo de glucosa en el medio, pues en
este caso tenía dos sustratos alternativos (Fernández, 1999). Es posible que si
en esta investigación no se hubiera adicionado almidón al medio, la fase
estacionaria se hubiera obtenido en 12 horas. La razón por la que se adicionó
almidón, fue simular las condiciones de las conservas donde se usan
almidones modificados que mantienen la estabilidad reológica del producto,
pues este microorganismo causa deterioro en las conservas (Hersom y
Hulland, 1980) el cual se evidencia por la aparición de vetas blancas y acidez
en el producto (Rees y Bettison, 1994).
40
Curva de crecimiento Bacillus cereus
0,6
0,5
Abs 620 nm
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (horas)
41
sabor deben ser propios del producto (Quintero, 2003). Con base en esto, se
seleccionó la salsa número 10 y se descartaron las otras 10 obtenidas (anexo
3).
Ingrediente Cantidad
Tomate 150 g
Azúcar 1g
Cebolla 5g
Ajo 0.5 g
Color 0.2 g
Agua 20 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 4g
Sal 0.1 g
42
6.4 Evaluación de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus
(en caldo BHI y sobre alimento)
43
Otros factores que probablemente pudieron afectar la termorresistencia en la
conserva, fueron las sustancias antimicrobianas presentes en algunos de los
componentes de la salsa como son la cebolla, el ajo y la sal, pues se ha
reportado que estas sustancias poseen un efecto antimicrobiano. Se sabe que
existen diversos productos de origen botánico los cuales poseen una actividad
antimicrobiana como el ajo, orégano, mostaza, canela, albahaca, tomillo,
pimienta, mejorana, chile, achiota, cebolla, cilantro, té, limón y naranja
(Barboza et al, 2004).
Otro factor que pudo verse implicado fue la tasa de calentamiento. Las tasas
de calentamiento rápidas o lentas, influyen en el grado de destrucción de L.
monocytogenes. En estudios realizados sobre muestras de cerdo molido
inoculado, se observó que un calentamiento lento (1.3ºC/min) permitió que una
44
mayor concentración de L. monocytogenes sobreviviera, que en un
calentamiento rápido (Doyle, 2001).
10
9
8
7
Log UFC/mL
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
11
10
9
8
Log UFC /mL
7
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Tiempo (minutos)
52°C 55°C 57°C
45
En cuanto a los valores D encontrados para L. monocytogenes en caldo BHI
(tabla 3) se observa que hubo una disminución de éstos a medida que la
temperatura aumentó, lo cual puede indicar que el proceso de inactivación tuvo
los resultados esperados ya que con una mayor temperatura de exposición
como lo es 57°C se observa un mayor efecto sobre la viabilidad de la cepa y
por lo tanto se verá inhibido su crecimiento en un menor tiempo, esto puede
compararse con el análisis estadístico que muestra una diferencia
estadísticamente significativa entre los valores de la temperaturas de 55 y 57
(tablas 4 y 5). De lo anterior, se podría concluir que el tratamiento con el que
más rápido se destruye un ciclo logarítmico en la población de L.
monocytogenes corresponde a 57°C durante 3.3 minutos.
46
Tablas 4 y 5. Comparación de medias por temperaturas en caldo BHI (L.
monocytogenes).
Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 7.543851
Valor critico de t 1.99085
Mínima diferencia significativa 1.4882
Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 7.632015
Valor critico de t 1.99085
Mínima diferencia significativa 1.4969
47
en el caldo BHI entre 55°C y las otras dos temperaturas (60 y 70°C), esta
diferencia se podría explicar porque los datos para los valores D son tomados
manualmente lo que podría tener un mayor porcentaje de error, por lo cual en
el presente estudio se tuvo en cuenta el resultado obtenido mediante el análisis
estadístico donde se confirma que es mejor un tratamiento a 60 o 70°C, para
una industria de alimentos es de mayor utilidad aplicar 60°C porque representa
menor costo. Otro punto clave para discutir estos resultados es que el
tratamiento térmico para B. cereus según reportes, tiene una mayor efectividad
durante el desarrollo de las esporas porque aumenta la termorresistencia de los
microorganismos. Se han avanzado una serie de teorías en torno a la
diferencia entre las células vegetativas y las esporas. Una de esas teorías es
la que implica el papel del ácido dipicolínico (DPA). Se ha descrito que la
termorresistencia de la espora se debe a que una gran porción de su contenido
acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulación
de la proteína celular. La termorresistencia aumenta de forma gradual a
medida que la concentración de agua del entorno disminuye (deshidratación
del protoplasto de la espora). La gran resistencia de ciertas esporas en medios
acuosos exige que la cubierta esporular tenga una permeabilidad acuosa muy
baja, lo que es difícil por la permeabilidad de los materiales orgánicos, se ha
demostrado que existen diferencias en termorresistencia asociados al tamaño
de la molécula que ejerce el pH ácido (Martínez, 2007). (Herson y Hulland,
1980). Además existen factores en el medio que afectan la resistencia térmica
de las esporas, como el pH, la naturaleza de los acidulantes, la temperatura y
la concentración de NaCI (Laurent et al, 1999).
48
etanol o ácido, lo que puede resultar en un incremento de la termotolerancia.
Igualmente, se ha reportado que en una gran variedad de bacterias, la
respuesta al choque térmico incluye el aumento de una serie de proteínas del
choque térmico (HSPs). Estudios realizados por Derré et al, 1999 con B.
subtilis, concluyeron que los genes inducidos por calor son divididos en cuatro
clases diferentes según sus mecanismos regulatorios; los genes de la clase II
son inducidos por estrés térmico y otras condiciones como sal o etanol.
También se ha visto que la repuesta al choque térmico de las células de B.
subtilis preexpuestas a calor suave, producen esporas más estables al calor
(Periago et al, 2002), esta preexposición al calor puede corresponder a la
temperatura de incubación utilizada en el presente estudio antes de la
exposición a las diferentes temperaturas de evaluación. Durante el desarrollo
de las esporas aumenta la termorresistencia de los microorganismos y por lo
tanto puede ser mas difícil su destrucción, por esta razón se puede decir que B.
cereus tuvo valores D constantes en las diferentes temperaturas evaluadas 55,
60 y 70 ºC, pues estas temperaturas no son suficientes para la destrucción de
las esporas, se ha reportado que la temperatura óptima para inactivar las
esporas es aproximadamente 90, 95 y 100 ºC, (Byrne et al, 2006) y que el
tratamiento térmico mínimo para productos procesados (90 -95 º C por 6 – 10
minutos) usualmente no es suficiente para inactivar a todas las esporas
(Fernández et al, 2002). En el caso de este estudio no se utilizaron estas
temperaturas tan altas, porque se pensaba combinar el efecto de la
temperatura con el agente antimicrobiano (aceite de M. mollis) y además las
temperaturas altas hacen que se pierdan más fácil los componentes por
volatilización. Asimismo se observa en la figura 7 que las concentraciones de
células iniciales vegetativas son altas, por lo cual se ve un decrecimiento más
rápido del minuto 1 al 5, lo que explica los bajos valores D en estos primeros
minutos. Por otra parte, después del minuto 5 se observa una tendencia más
constante lo que puede hacer pensar que la cepa empieza a esporular en este
momento. Además, debido a la naturaleza logarítmica de la curva de muerte
térmica, cuanto mayor sea el número de esporas mayor será el tiempo
necesario para llevar a cabo su destrucción (Hersom y Hulland, 1980) por esta
49
razón se evaluaron tiempos largos. Por todo lo anterior era recomendable la
evaluación de la termorresistencia de B. cereus directamente sobre las esporas
sin la presencia de células vegetativas para dar una aproximación mas cercana
a la temperatura óptima de inactivación.
10
9
8
7
Log UFC/mL
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
55 ° C 60 °C 70 °C Tiempo (minutos)
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
50
Tabla 8. Valores D para B. cereus en caldo BHI y conserva
Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 3.464374
Valor critico de t 1.99085
Mínima diferencia significativa 0.975
Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 3.464374
Valor critico de t 1.99085
Mínima diferencia significativa 1.0085
51
6.6 Extracción del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluación
de la actividad antimicrobiana.
52
Tabla 14. Actividad antimicrobiana del aceite esencial (zona inhibición en mm)
S: Cuando la CMI del antimicrobiano para una bacteria se puede conseguir in vivo a dosis terapéuticas.
R: Cuando el microorganismo no es inhibido por las concentraciones que normalmente se pueden obtener
en el sito de infección.
53
planta, el cual se mostró inactivo y no tuvo inhibición como se demuestra (tabla
14) pues no hubo presencia de halos en ninguna de las cepas analizadas,
mostrando la resistencia de estos microorganismos al aceite con la
concentración utilizada para L. monocytogenes y B. cereus (tabla 15).
54
actividad ATPasa en la membrana celular. También se ha encontrado que este
tipo de agentes pueden inhibir la generación de adenosina trifosfato de
dextrosa y afectar la membrana y que concentraciones de carvacrol de 5 a 10
mM tienen actividad bactericida frente a L. monocytogenes (Gill y Holley, 2006).
55
Erwinia amylovora en concentraciones más bajas (103 UFC/ml), otros
compuestos como la β-pinona en 107 UFC/ml. y para otros componentes no
se ha encontrado. (Kalemba y Kunicka, 2004).
Otra de las posibles razones por las que no se obtuvo un efecto antimicrobiano
del aceite esencial, fue porque el método utilizado para evaluar la actividad no
fue el mejor; pues se ha reportado que el método de difusión en agar es
inadecuado para aceites esenciales, sus componentes volátiles se pueden
evaporar con el solvente de dispersión durante el tiempo de incubación,
mientras que sus componentes mas solubles no se difunden bien en el agar.
No obstante, es la técnica más común para evaluar actividad antibacteriana y
antifúngica de aceites esenciales porque es mas fácil llevarla a cabo y requiere
solo pequeñas cantidades del aceite esencial (Kalemba and Kunicka 2003).
56
Adicionalmente, el uso de aceites esenciales en el sector alimenticio es a
menudo limitado debido a que las dosis antimicrobianas eficaces pueden
exceder niveles aceptables (Kalemba y Kunicka, 2004).
Por último, si bien los extractos obtenidos a partir de M. mollis han resultado
eficientes frente a fitopatógenos, en este caso no tienen una actividad
57
antimicrobiana que ameriten seguir con su investigación para uso en industria
de alimentos.
7. RECOMENDACIONES
58
8. CONCLUSIONES
59
9. REFERENCIAS
60
growth of Listeria monocytogenes at low temperatures. Appl. Environ.
Microbiol. 63 (10), pág 3887–3894.
61
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(2001). Isolation, structural assignment and insecticidal activity of (-)-
(1S,2R,3R,4S)-1,2-epoxy-1-methyl-4-(1-methylethyl)-cyclohex-3-yl
acetate, a natural product from Minthostachys tomentosa. Tetrahedron:
Asymmetr,y p 677–683
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• DELGADO., B., FERNÁNDEZ, A., PERIAGO, P. 2003. Effect of thymol
and cymene on Bacillus cereus vegetative cells evaluated through the
use of frequency distributions. Food Microbiology, p 327–334
63
• GILL, A., HOLLEY, R. 2006. Inhibition of membrane bound ATPases of
Escherichia coli and Listeria monocytogenes by plant oil aromatics.
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pathogens by thymol, eugenol, menthol and anethole. International
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solutes used to control water activity of the heating medium. International
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and death in the United States. Emerg. Infect. Dis. 5 (5), 607–625.
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CANNATELLI., M. PIZZIMENTI., F. CIONI.,P. PROCOPIO., F. AND
BLANCO, A. 2007. Effects of oregano, carvacrol and thymol on
Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms.
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67
• PLAZL. I., LAKNER., M. KOLOINI, T. 2006. Modeling of temperature
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Netherlands. Letters in Applied Microbiology, p 166-170
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70Ž2001.163–173
69
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M. 2004. Validación de PCR para detección de Listeria monocytogenes
en carnes crudas de carne, res y pollo. Bogotá, Colombia, p 414-427.
70
Recursos electrónicos
71
hortalizas a pequeña escala en Perú” <
http://www.fao.org/docrep/x5063S/x5063S03.htm> [Consulta 14 de junio
de 2007].
72
ANEXO 1
73
ANEXO 2
74
ANEXO 3
Salsa número 1
Ingrediente Cantidad
Tomate 50 g
Cebolla 6.3 g
Ajo 0.8 g
Color 0.3 g
Agua 100 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 3.5 g
Sal 0.3g
Salsa número 2
Ingrediente Cantidad
Tomate 100.9 g
Cebolla 5.3 g
Ajo 0.8 g
Color 0.3 g
Agua 50 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 6.7 g
Sal 0.3 g
Salsa número 3
Ingrediente Cantidad
Tomate 100.5 g
Cebolla 5.1 g
Ajo 0.5 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 5.1 g
Sal 0.3g
75
Salsa número 4
Ingrediente Cantidad
Tomate 112.3 g
Cebolla 5.1 g
Ajo 0.5 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Sal 0.3g
Salsa número 5
Ingrediente Cantidad
Tomate 100.8 g
Azúcar 3g
Cebolla 3g
Ajo 0.5 g
Color 0.1 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 6.9 g
Sal 0.3g
Salsa número 6
Ingrediente Cantidad
Tomate 100 g
Azúcar 4g
Cebolla 3.2 g
Ajo 0.5 g
Color 0.1 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 7.3 g
Sal 0.3g
Salsa número 7
Ingrediente Cantidad
Tomate 70 g
Azúcar 3g
Cebolla 2g
Ajo 0.2 g
Color 0.1 g
76
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 10 g
Sal 0.3g
Salsa número 8
Ingrediente Cantidad
Tomate 150 g
Azúcar 4g
Cebolla 2.5 g
Ajo 0.2 g
Color 0.1 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 7g
Sal 0.3g
Salsa número 9
Ingrediente Cantidad
Tomate 100 g
Azúcar 1g
Cebolla 3g
Ajo 0.4 g
Color 0.1 g
Agua 20 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 9g
Sal 0.3 g
Salsa número 11
Ingrediente Cantidad
Tomate 150 g
Cebolla 5g
Ajo 0.5 g
Agua 10 mL
Aceite 2 mL
Sal 0.3 g
77
ANEXO 10
14 55 10 2 5.00
15 55 15 2 4.00
16 55 20 2 4.00
17 55 30 2 3.47
18 55 60 2 2.00
19 55 0 3 8.87
20 55 1 3 7.30
21 55 2 3 7.00
22 55 5 3 6.47
23 55 10 3 6.17
24 55 15 3 5.69
25 55 20 3 5.36
26 55 30 3 3.60
27 55 60 3 2.00
28 60 0 1 6.95
29 60 1 1 7.00
30 60 2 1 4.47
31 60 5 1 2.00
32 60 10 1 2.47
33 60 15 1 2.30
34 60 20 1 2.76
35 60 30 1 2.00
36 60 60 1 2.30
37 60 0 2 6.95
38 60 1 2 5.20
39 60 2 2 4.00
40 60 5 2 3.66
41 60 10 2 3.27
42 60 15 2 2.90
43 60 20 2 2.47
44 60 30 2 2.72
45 60 60 2 2.17
46 60 0 3 6.95
47 60 1 3 6.49
48 60 2 3 4.60
49 60 5 3 3.23
50 60 10 3 2.84
51 60 15 3 2.17
52 60 20 3 2.00
----------------------------------------------------------------------------------------
78
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 127
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
53 60 30 3 2.95
54 60 60 3 2.00
55 70 0 1 6.23
56 70 1 1 5.90
57 70 2 1 4.30
58 70 5 1 3.69
59 70 10 1 3.39
60 70 15 1 2.30
61 70 20 1 2.07
62 70 30 1 1.90
63 70 60 1 1.47
64 70 0 2 6.23
65 70 1 2 5.00
66 70 2 2 4.60
67 70 5 2 3.77
68 70 10 2 3.14
69 70 15 2 3.00
70 70 20 2 2.83
71 70 30 2 2.82
72 70 60 2 2.00
73 70 0 3 6.23
74 70 1 3 5.30
75 70 2 3 4.30
76 70 5 3 3.00
77 70 10 3 3.30
78 70 15 3 3.00
79 70 20 3 3.00
80 70 30 3 1.00
81 70 60 3 1.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 128
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
Class Level Information
TEM 3 55 60 70
TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F
Model 2 59.4546889 29.7273444 9.18
0.0003
79
Error 78 252.5620667 3.2379752
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 130
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
80
ANEXO 11
81
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 132
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
53 60 30 3 1.60
54 60 60 3 0.00
55 70 0 1 6.23
56 70 1 1 6.07
57 70 2 1 5.30
58 70 5 1 4.69
59 70 10 1 4.39
60 70 15 1 3.78
61 70 20 1 3.60
62 70 30 1 2.07
63 70 60 1 2.00
64 70 0 2 6.23
65 70 1 2 5.00
66 70 2 2 4.60
67 70 5 2 3.77
68 70 10 2 3.47
69 70 15 2 3.00
70 70 20 2 2.83
71 70 30 2 1.30
72 70 60 2 1.00
73 70 0 3 6.23
74 70 1 3 5.30
75 70 2 3 4.30
76 70 5 3 3.95
77 70 10 3 3.85
78 70 15 3 3.60
79 70 20 3 2.77
80 70 30 3 2.34
81 70 60 3 1.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 133
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
TEM 3 55 60 70
TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 134
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F
82
R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean
---------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
83
ANEXO 12
84
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 07:11 Thursday, October
14, 2007 2
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
----------------------------------------------------------------------------------------
53 55 30 3 6.00
54 55 60 3 0.00
55 57 0 1 9.84
56 57 1 1 9.00
57 57 2 1 9.00
58 57 5 1 8.69
59 57 10 1 8.00
60 57 15 1 8.32
61 57 20 1 7.49
62 57 30 1 6.00
63 57 60 1 6.00
64 57 0 2 9.84
65 57 1 2 9.69
66 57 2 2 9.69
67 57 5 2 9.47
68 57 10 2 8.77
69 57 15 2 8.60
70 57 20 2 7.20
71 57 30 2 6.00
72 57 60 2 6.00
73 57 0 3 9.84
74 57 1 3 9.30
75 57 2 3 8.95
76 57 5 3 8.60
77 57 10 3 8.30
78 57 15 3 8.23
79 57 20 3 6.77
80 57 30 3 6.00
81 57 60 3 0.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 07:11 Thursday, October
14, 2007 3
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F
85
Corrected Total 80 650.0940469
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
86
ANEXO 13
87
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 132
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
----------------------------------------------------------------------------------------
53 60 30 3 1.60
54 60 60 3 0.00
55 70 0 1 6.23
56 70 1 1 6.07
57 70 2 1 5.30
58 70 5 1 4.69
59 70 10 1 4.39
60 70 15 1 3.78
61 70 20 1 3.60
62 70 30 1 2.07
63 70 60 1 2.00
64 70 0 2 6.23
65 70 1 2 5.00
66 70 2 2 4.60
67 70 5 2 3.77
68 70 10 2 3.47
69 70 15 2 3.00
70 70 20 2 2.83
71 70 30 2 1.30
72 70 60 2 1.00
73 70 0 3 6.23
74 70 1 3 5.30
75 70 2 3 4.30
76 70 5 3 3.95
77 70 10 3 3.85
78 70 15 3 3.60
79 70 20 3 2.77
80 70 30 3 2.34
81 70 60 3 1.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 133
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
TEM 3 55 60 70
TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F
88
----------------------------------------------------------------------------------------
R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
89
ANEXO 8
MEDIOS DE CULTIVO
Polipeptona 20.0
Extracto de levadura 3.0
Almidón 1.0
Cloruro sódico 5.0
Citrato férrico amoniacal 0.5
Esculina 1.0
Cloruro de litio 15
Agar bacteriológico 13
90