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Evaluación de cepas industriales de

Saccharomyces cerevisiae para


la obtención de etanol a partir de fuentes que
no afectan la producción de alimentos

Teresa Fernández,1,2 Carlos Martín1 y Mohammad Taherzadeh2

Resumen Introducción

Se evaluaron una cepa de laboratorio Durante los últimos años aumentó el interés
(No.1) y dos cepas industriales (No.2 por el etanol combustible debido al aumento de
y No.3) de Saccharomyces cerevisiae los precios del petróleo crudo, la inminencia del
para la producción de etanol a partir agotamiento de ese hidrocarburo y la necesidad
de hidrolizados ácidos de bagazo. Las de mitigar el efecto invernadero. El etanol se ha
cepas No.2 y No.3, aisladas de plantas convertido en un importante producto en el mer-
procesadoras de sustratos lignocelulósi- cado mundial de combustibles. Su comercializa-
cos, presentaron una alta velocidad de ción creció de menos de un millardo de litros en
consumo de furfural y de HMF. Aunque 1975 a más de 39  millardos en 2006 y se espera
las tres cepas pudieron fermentar un que alcance los 100 millardos en 2015 (Licht,
hidrolizado detoxificado, para dos de 2006). Los altos costos de las materias primas azu-
ellas se observó una fuerte inhibición en caradas y amiláceas, así como el debate alimentos
la fermentación. La cepa No.3, aislada versus combustibles, han motivado el interés por
de una planta de producción de etanol los materiales lignocelulósicos (MLC) como posi-
a partir de licores al sulfito, presentó bles materias primas para la producción de etanol
una mayor tolerancia a inhibidores que (Hahn-Hägerdal et al., 2006). Se ha afirmado que
las otras dos. La inhibición del rendi- la producción de etanol combustible podrá per-
miento de etanol en la fermentación del manecer como una industria importante y como
hidrolizado no detoxificado fue de sólo un sistema agrícola auto-sostenible en el siglo xxi
2,3 % con esa cepa, mientras que en las solamente si la utilización de los MLC se convierte
cepas No.1 y No.2 fue de 73,9 y 86,4 %, en una realidad comercial.
respectivamente. La alta productividad El bagazo de caña de azúcar (Saccharum offici-
volumétrica y específica de etanol, mayor narum) es un MLC de gran interés para la produc-
velocidad de consumo de glucosa y más ción de etanol en Cuba sin afectar la producción
rápida conversión del furfural, eviden- de alimentos. Aunque el bagazo se utiliza como
cian la superioridad de la cepa No.3, combustible en los ingenios azucareros (Valdés
así como su factibilidad para fermentar y col., 2000), puede ser considerado una materia
hidrolizados sin necesidad de que medie prima potencial para la producción de etanol,
una etapa de detoxificación. especialmente si se tiene en cuenta su contenido

Palabras Clave: etanol celulósico, hidrolizado de bagazo, detoxificación, S. cerevisiae.


1
Departamento de Química e Ingeniería Química, Universidad de Matanzas, Matanzas 44740, Cuba.
2
School of Engineering, Borås University Collage, 50190 Borås, Sweden.

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de carbohidratos y su disponibilidad en forma H2SO4 fue 0,5 % y la carga de sólidos fue 12 g
concentrada en los ingenios azucareros. por 100 g de mezcla. Finalmente, el hidrolizado
Los MLC contienen carbohidratos en forma de celulósico fue separado por filtración al vacío y se
celulosa y hemicelulosas, los que mediante pro- conservó congelado hasta usos posteriores.
cesos de hidrólisis generan monosacáridos como,
glucosa, xilosa y otros. A continuación, estos azú- Detoxificación de los hidrolizados
cares pueden ser convertidos en etanol por fer- Los hidrolizados fueron detoxificados por trata-
mentación utilizando diferentes microorganismos. miento con Ca(OH)2 al 20 % (w/w) hasta pH 10 y
La hidrólisis de la celulosa puede ser catalizada se mantuvieron bajo esas condiciones durante una
por ácidos o por enzimas. Tanto en la hidrólisis hora. Luego resultaron filtrados, neutralizados a
ácida como en el pretratamiento para la hidrólisis pH 5,5 y filtrados nuevamente.
enzimática ocurre la degradación de los azúcares
con formación de subproductos inhibitorios de la Cepas
fermentación alcohólica, tales como ácidos alifá- Se utilizaron tres cepas de S. cerevisiae. La cepa
ticos, aldehídos furánicos y compuestos fenólicos No. 1 (CBS 8066) es una cepa de laboratorio que
(Taherzadeh y Karimi, 2007). se utilizó como referencia porque ha sido utili-
Los microorganismos para ser empleados en zada previamente en estudios similares (Talebnia
la fermentación de hidrolizados lignocelulósicos y Taherzadeh, 2006). Las cepas No. 2 y No. 3 son
deben producir etanol con un alto rendimiento y cepas industriales. La No. 2 fue aislada de hidroliza-
productividad y hacer resistencia a los inhibido- dos fermentados de astillas de pino en una planta
res presentes en los hidrolizados (Martín y col., demostrativa de producción de etanol (Domsjö
2002). fabriker AB, Örnsköldsvik, Suecia), mientras que
La búsqueda de organismos resistentes a los la No. 3 fue aislada de una planta productora de
inhibidores se ha convertido en una tarea de etanol a partir de licores de pulpeo de madera por
máxima prioridad. En este trabajo se investigó la el proceso al sulfito (Mo Do, Suecia).
fermentación de hidrolizados ácidos de bagazo
con la utilización de dos cepas industriales y una Preparación del inóculo
de laboratorio de S. cerevisiae. Las cepas indus- Las tres cepas fueron conservadas en cuñas de
triales fueron aisladas de una planta de fermenta- YPD-agar (10 g L-1 de extracto de levadura, 20 g
ción de licores al sulfito y de una planta demostra- L-1 de peptona, 20 g L-1 de glucosa y 20 g L-1 de
tiva de producción de etanol a partir de residuos agar). Una asada de la cepa a estudiar fue trans-
lignocelulósicos. ferida a 100 mL de medio sintético (20 gL-1 de
glucosa, 7,5 gL-1 de (NH4)2SO4, 3,5 gL-1 de K2HPO4,
0,75 gL-1 de MgSO4.7H2O, 1 mL de solución de
Materiales y Métodos vitaminas, y 1 mL de solución de trazas de meta-
les. Esta última solución contiene en gL-1: EDTA,
3; CaCl2.2H2O, 0,9; ZnSO4.7H2O, 0,9; FeSO4.7H2O,
Obtención de los hidrolizados 0,6; H3BO3, 0,2; MnCl2.H2O, 0,16; Na2Mo4.2H2O,
El bagazo de caña de azúcar, donado por el 0,08; CoCl2.2H2O, 0,06; CuSO4.5H2O, 0,06; KI,
ingenio azucarero Mario Muñoz, de Matanzas, 0,02. La solución de vitaminas se preparó en
Cuba, fue secado al aire, molido y conservado gL-1 con: ácido p-aminobenzoico, 0,2; ácido
en bolsas plásticas a temperatura ambiente. Los nicotínico, 1; pantotenato de calcio, 1; pirido-
hidrolizados fueron obtenidos por hidrólisis ácida xina, 1; tiamina, 1; biotina, 0,05; m-inositol, 25
en dos etapas. En la primera etapa, muestras de (Karimi et al., 2005). El volumen resultante fue
bagazo fueron impregnadas con ácido sulfúrico a incubado en un Erlenmeyer de 300 mL a 300C,
una concentración final de 0,5 % y una relación de 120 rpm hasta alcanzar valores de densidad óptica
10 g de sólidos por 100 g de mezcla. El material (DO620) entre 8 y 11.
fue colocado en un reactor presurizado, donde se
calentó a 180oC durante 7 minutos para hidrolizar Fermentación de los hidrolizados
las hemicelulosas. A continuación, el hidrolizado La fermentación anaeróbica se realizó en
hemicelulósico fue separado del material fibroso Erlenmeyers de 300 mL equipados con tapas de
por filtración a vacío. En la segunda etapa, la celu- goma, dos tubos capilares de cristal y una trampa
losa contenida en el material fibroso fue hidro- de CO2. Los capilares fueron usados para la toma
lizada por calentamiento con ácido sulfúrico a de muestras después de 0, 2, 4, 8, 12 y 24 horas
230 oC durante 7 minutos. La concentración de y para la inyección de N2 (con menos de 5 ppm

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de O2). El volumen de trabajo fue 100 mL de (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.) y un detector RI
hidrolizado, los cuales fueron enriquecidos con (Jasco International Co., Tokyo, Japón). El furfu-
los mismos componentes del medio sintético ral y el HMF fueron detectados con un detector
usado en la preparación del inóculo y en iguales UV/VIS a 210 nm. La composición de los hidroliza-
concentraciones. Se adicionó además 0,1 mL de dos se muestra en la tabla 1.
ergosterol. La fuente de carbono fue la misma que
poseían los hidrolizados. Los frascos se inocula- Resultados y discusión
ron con 4 mL de inóculo de una concentración
de células igual a 4 gL-1 y se incubaron a 30 0C y Durante la hidrólisis se formaron inhibidores
120 rpm durante 24 horas. La referencia se pre- de la fermentación, tales como ácido acético, fur-
paró con glucosa añadida, en igual concentración fural, hidroximetilfurfural y ácido fórmico. La alta
que los hidrolizados, como fuente de carbono. Se concentración de aldehídos furánicos es compara-
enriqueció también con las mismas sales y demás ble con la encontrada en hidrolizados de bagazo
componentes utilizados en las muestras de estu- obtenidos por explosión con vapor, asistida con
dio. Se realizaron dos réplicas en todos los casos. impregnación con ácido sulfúrico (Martín y col.,
Como criterio de la fermentabilidad se tomaron: 2002). Los hidrolizados fueron detoxificados con
el rendimiento (YE/G), la productividad volumétrica el objetivo de disminuir su toxicidad hacia las
(Q), y la productividad específica (q) de etanol, la levaduras.
velocidad de consumo de glucosa (VCG) y la inhi- El proceso de detoxificación permitió reducir la
bición del rendimiento (IY) y de la productividad concentración de los principales inhibidores entre
volumétrica (IQ). Para calcular el rendimiento en 11,1 y 15,0 % (Tabla 1). No obstante, el contenido
etanol se dividió la concentración de etanol pro- de aldehídos furánicos (2,5 g/L) aún se mantuvo a
ducido a las 24 h por la concentración de glucosa un nivel inhibitorio para las levaduras.
inicial. La productividad volumétrica (Q) se basó
en los gramos de etanol producidos por litro de Tabla No. 1
medio de cultivo por hora durante las primeras 8 h Concentración de los principales componentes
de fermentación y la productividad específica es la detectados en los hidrolizados, g/L.
relación entre Q y la concentración inicial de célu-
Ácido
las (masa seca). La biomasa seca se determinó cen- Medio Glucosa Furfural HMF
acético
trifugando (2 minutos a 4000 rpm) 5 mL de cultivo
Hidrolizado
en un tubo de ensayos previamente pesado. Las 11,2 1,7 0,7 1,8
detoxificado
células fueron lavadas con agua destilada y centri-
Hidrolizado
fugadas nuevamente. Luego de expulsar el sobre- 12,1 2,0 0,8 2,0
no detoxificado
nadante se secaron a 105 0C durante 48 horas. La
velocidad de consumo de glucosa se calculó como Producción de etanol y consumo de glucosa
la diferencia entre las concentraciones, inicial y durante la fermentación.
luego de 8 h, dividida por 8 h. Por último, la inhi- La alta concentración de aldehídos furánicos
bición del rendimiento de etanol (IY) se calculó exige una alta tolerancia a inhibidores por parte
mediante la siguiente expresión: de la cepa de levadura a utilizar en la fermenta-
ción. El objetivo del trabajo fue evaluar dos cepas
Yref - Ypreh industriales que, por haber sido aisladas de plan-
IY = x 100 tas procesadoras de sustratos lignocelulósicos,
Yref han experimentado una adaptación a los inhibido-
res presentes en los hidrolizados. Además, la cepa
Donde Yref y Ypreh son los rendimientos en etanol No. 2 es floculante, lo que facilita su separación
de la referencia y el prehidrolizado, respectiva- por sedimentación y permite ahorrar recursos, ya
mente. De modo similar fue calculada la inhibición que se evita el uso de centrífugas (Purwadi et al.,
de la productividad de etanol. 2007).
Para evaluar la capacidad de las cepas de leva-
Análisis dura se hicieron fermentaciones del hidrolizado
Los hidrolizados y medios de fermentación sin detoxificar, el hidrolizado detoxificado y una
fueron analizados por HPLC. El efluente fue H2SO4 solución de referencia en paralelo para cada cepa.
5 mM a una velocidad de flujo de 0,6 mL/min. Para La solución de referencia contenía glucosa en la
la separación de glucosa, ácido acético, etanol y misma concentración que los hidrolizados, pero
glicerol se utilizó una columna Aminex HPX-87H no contenía inhibidores.

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Como era lógico esperar, la fermentación de los específica de etanol también reportaron valores simi-
hidrolizados estuvo inhibida en comparación con lares para ambos hidrolizados (Tabla 2). La mayor
la de la referencia. La inhibición del rendimiento de productividad específica en la fermentación del
etanol fue menor que la de la productividad volu- hidrolizado sin detoxificar fue obtenida con la cepa
métrica (Fig. 1), lo que se debió a que los inhibi- No. 3. Este resultado evidencia la superioridad de
dores impidieron una producción rápida de etanol esa cepa con respecto a las demás, así como su
durante las primeras horas, pero luego ocurrió un factibilidad para fermentar hidrolizados sin nece-
Figura No. 1 sidad de que medie una etapa de detoxificación.
Inhibición del rendimiento (barras grises) y la
productividad volumétrica de etanol (barras blancas) Figura No. 2
durante la fermentación de los hidrolizados detoxificados y Consumo de glucosa (rombos) y formación de etanol
sin detoxificar. (cuadrados) durante la fermentación del hidrolizado
100 detoxificado (símbolos vacíos) y del hidrolizado sin
detoxificar (símbolos rellenos) con la cepa No. 1.
80
Inhibición, %

60 20.0

40
15.0

Concentración, g/L
20

0
Cepa -1 Cepa 1-No Cepa 2 - Cepa 2-No Cepa 3- Cepa 3-No 10.0
Detoxificado Detoxificado Detoxificado Detoxificado Detoxificado Detoxificado

proceso de adaptación de las cepas, lo que, relativa- 5.0


mente, llevó a altos rendimientos de etanol al final
de la fermentación. Para ilustrar este fenómeno en
la figura 2 se muestra la dinámica de formación 0.0
0 4 8 12 16 20 24
de etanol y consumo de glucosa en la fermenta- Tiempo, h
ción de los hidrolizados con la cepa No. 1, la cual
fue la más sensible a la inhibición. A pesar Tabla No. 2
de que la remoción de inhibidores durante Parámetros de la fermentación
la detoxificación fue relativamente baja
(Tabla 1), el efecto en la fermentabilidad YE/G2 VCG2 Q2 q2
Cepa Medio
g g-1 g L-1 h-1 g L-1 h-1 g g-1 h-1
de los hidrolizados detoxificados fue muy
marcado. La inhibición de la fermentación Hidrolizado
0,45 0,94 0,50 1,66
fue mucho menor en el hidrolizado detoxi- detoxificado
ficado que en el hidrolizado sin detoxificar No.1 Hidrolizado
0,12 0,06 0,19 0,63
(Fig. 2). El rendimiento de etanol en la fer- no detoxificado
mentación del hidrolizado detoxificado fue Referencia 0,46 1,78 1,02 2,92
comparable al rendimiento en la referencia Hidrolizado
(Tabla 2), por lo que la inhibición de ese 0,43 0,86 0,43 1,43
detoxificado
parámetro fue inferior a 2 % para las tres No.2 Hidrolizado
cepas, e incluso fue nula para la cepa No. 3 0,06 0,07 0,06 0,30
no detoxificado
(Fig. 1). La velocidad de consumo de glucosa, Referencia 0,44 1,61 0,73 2,43
así como las productividades volumétrica y
Hidrolizado
específica de etanol se incrementaron con la 0,44 0,93 0,46 1,53
detoxificado
detoxificación, aunque sin llegar a los valores
No.3 Hidrolizado
de la referencia. 0,43 0,94 0,46 1,53
no detoxificado
En lo referente al comportamiento de las
Referencia 0,44 1,78 0,74 2,47
distintas cepas, se debe resaltar la alta tole-
rancia a inhibidores de la cepa No. 3. Con YQ, productividad
, rendimiento de etanol por g de glucosa; VCG, velocidad de consumo de glucosa,
E/G
volumétrica de etanol; q, productividad específica de etanol.
esa cepa no se observó inhibición del rendi-
miento de etanol en la fermentación del hidroli-
zado detoxificado, mientras que la inhibición en Consumo de aldehídos furánicos
el hidrolizado sin detoxificar fue mínima y la inhi- Los parámetros del consumo de furfural y de
bición de la productividad volumétrica fue com- HMF se muestran en la Tabla 3, mientras que la
parable para ambos hidrolizados (Fig. 1). La velo- dinámica de la conversión de esos compuestos
cidad de consumo de glucosa y la productividad durante la fermentación con la cepa No. 3, la más

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Tabla No. 3 demás, mientras que la No. 1
Consumo de aldehídos furánicos durante la fermentación,
fue inferior. Evidentemente, la
% del contenido inicial
alta conversión de los aldehi-
Furfural-4 Furfural-24 HMF-4h, HMF-4h, dos furánicos por la cepa No. 3
Cepa Detoxificación
h, % h, % % % es la causa de la alta capacidad
No. 1 Sí 18,2 52,3 5,9 29,0 de esa cepa para fermentar los
No 10,4 16,7 2,7 6,7
hidrolizados sin detoxificar.
El consumo del furfural se
No. 2 Sí 23,7 85,5 0,0 58,3
debe a su reducción a alco-
No 0,0 22,7 0,0 7,3 hol furfurílico, lo que ha sido
No. 3 Sí 73,5 85,3 8,5 56,5 demostrado previamente. La
No 46,8 85,0 5,5 39,0 capacidad de S. cerevisiae de
reducir el furfural fue obser-
resistente, se ilustran en la Figura 3. En la fermen- vada por primera vez por científicos del ICIDCA
tación con las cepas No. 2 y No. 3 se logró una alta (Díaz de Villegas y col., 1992). Igualmente, se
conversión de los inhibidores furánicos, la cual conoce que el HMF es reducido a alcohol hidroxi-
fue mayor en los hidrolizados detoxificados que metilfurfurílico. La reducción del furfural y del
en los no detoxificados. HMF en fermentaciones de hidrolizados de bagazo
Con ambas cepas, en la fermentación de los ha sido reportada previamente por este colectivo
hidrolizados detoxificados 85 % del furfural fue de investigadores (Martín et al., 2002).
consumido en 24 h, mientras que con la cepa La dinámica de la conversión del furfural explica
No. 1 sólo se consumió 52,3 % (Tabla 2). El con- el comportamiento fermentativo de las cepas.
sumo de furfural fue más rápido con la cepa No. 3, Durante las primeras horas, cuando las concen-
la cual logró altas conversiones de furfural incluso traciones de furfural eran altas, las fermentaciones
Figura No. 3 fueron lentas y la productividad de etanol fue
Dinámica del consumo de furfural (rombos) e HMF baja, pero cuando el furfural fue convertido en el
(círculos) durante la fermentación del hidrolizado poco tóxico alcohol furfurílico las fermentaciones
detoxificado (símbolos vacíos) y del hidrolizado sin
detoxificar (símbolos rellenos) con la cepa No. 3. se activaron, conduciendo a altos rendimientos
de etanol (Tabla 2). Por otra parte, las menores
1.8
inhibiciones se observaron en las fermentaciones
Concentración, g/L

1.5
en las que se alcanzaron las mayores conversiones
1.2
del furfural.
0.9
0.6
Formación de glicerol
0.3
El glicerol fue el principal subproducto formado
0.0
0 4 8 12 16 20 24 durante la fermentación. La producción de glicerol
Tiempo, h fue mayor en los hidrolizados detoxificados que
en el hidrolizado sin detoxificar. A las 4 h de fer- en los hidrolizados sin detoxificar (Fig. 4), y fue
mentación, esa cepa ya había consumido tres cuar- inferior en los hidrolizados que en las referencias
tas partes del furfural contenido en el hidrolizado (datos no mostrados). Se observó una estrecha
detoxificado y casi la mitad Figura No. 4
del contenido en el hidro- Producción de glicerol durante la fermentación del hidrolizado detoxificado (símbolos
vacíos) y del hidrolizado sin detoxificar (símbolos rellenos) con las cepas No. 1 (A) y
lizado no detoxificado, No. 3 (B).
mientras que el porcentaje
de furfural consumido al 1.6 1.6
final de la fermentación B A
Concentración, g/L

fue semejante para ambos


Concentración, g/L

1.2 1.2
hidrolizados.
Aunque el consumo 0.8
0.8
de HMF fue inferior, con
todas las cepas se observó
0.4 0.4
la misma tendencia que
con el consumo de furfural
(Tabla 2). La cepa No. 3 fue 0.0 0.0
0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24
claramente superior a las Tiempo, h Tiempo, h

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correlación entre el consumo de furfural y la for- enzymatic hydrolysates of sugarcane bagasse
mación de glicerol. Un rápido consumo de furfu- pretreated by steam explosion using different
ral, como en la cepa No. 3, conllevó a una mayor impregnating agents”, Applied Biochemistry
formación de glicerol, mientras que un retraso en and Biotechnology 98/100:699-716, 2002.
el consumo de furfural, como en la fermentación
Purwadi, R.; T. Brandberg; M. J. Taherzadeh: “A possible
del hidrolizado sin detoxificar con la cepa No. 1,
industrial solution to ferment lignocellulosic
condujo a una baja formación de glicerol. Este
hydrolyzate to ethanol: continuous cultivation
fenómeno ha sido observado previamente en fer-
with flocculating yeast”, International Journal
mentación de hidrolizados de bagazo obtenidos
of Molecular Sciences 8:920-932, 2007.
por explosión con vapor seguida de hidrólisis
enzimática. Taherzadeh, M. J. and K. Karimi: “Acid-based hydroly-
sis processes for etanol from lignocelulosic
Conclusiones materials: a review”, BioResources 2:472-499,
2007.
El empleo de una cepa de Saccharomyces cerevi-
Talebnia, F. and M. J. Taherzadeh: “In situ detoxifica-
siae aislada de una planta de fermentación de licores
tion and continuous cultivation of dilute-acid
de pulpeo al sulfito permitió fermentar hidrolizados
hydrolyzate to ethanol by encapsulated S. cere-
ácidos de bagazo con una inhibición mínima, debido
visiae”, Journal of Biotechnology 125:377-
a la alta capacidad de la cepa para convertir los inhi-
384, 2006.
bidores furánicos en formas menos tóxicas. La cepa
aislada puede fermentar hidrolizados sin necesidad Valdés, A.; O. Almazán y H. Fiandor: “Contribución
de detoxificación, lo que permite disminuir los costos de la biomasa cañera al incremento del valor
del proceso. La fermentación de hidrolizados de agregado de la producción azucarera”, Inter-
bagazo de caña de azúcar permitiría obtener etanol national Sugar Journal 102:551-555, 2000.
combustible sin afectar la producción de alimentos.
Wahlbom, C. F.; B. Hahn-Hägerdal: “Furfural,
5-hydroxymethyl furfural and acetoin act as
Agradecimientos
external electron acceptors during anaerobic
fermentation of xilose by recombinant Sac-
Este trabajo fue posible gracias al apoyo de pro-
charomyces cerevisiae”, Biotechnology and
yectos del Ministerio de Educación Superior de Cuba
Bioengineering 78:172-178, 2002.
(contrato No. 6.115) y de la International Founda-
tion for Science (contrato No. F/3563-1).

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