Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata

Bioquímica II – 2007
Seminario 4: Cadena transportadora de electrones y fosforilación oxidativa

Temario
Clase 1
Cadena transportadora de electrones: Transportadores electrónicos, localización, estructura química. Determinación de la
secuencia de transportadores mediante potenciales redox, análisis espectral e inhibidores. Transferencia de electrones de un
complejo a otro. Ciclo Q.
Gradiente de protones, energía libre y potencial electroquímico transmembrana. Teoría quimiosmótica.
Clase 2
Fosforilación oxidativa: Utilización del gradiente electroquímico. Síntesis de ATP. Complejo de la ATPasa. Relación P/O. Eficiencia
de acoplamiento. Inhibidores, desacoplantes e ionóforos.
Rol del ADP/AMP. Regulación respiratoria.
Adenina dinucleótido translocasa. Transporte de Pi.

Preguntas guía
Clase 1
1. Cadena de Transportre de electrones mitocondrial
a. Identifique los cuatro complejos que forman la cadena respiratoria.
b. Nombre los componentes que aceptan y donan electrones en cada complejo.
c. Enumere los inhibidores que conozca de cada complejo y sus mecanismos de acción.
d. Identifique los complejos que producen suficiente energía para bombear protones.
e. Explique como se forma el gradiente de pH y de carga e indique como contribuyen a formar la fuerza protomotriz.
f. Detalle mecanismos alternativos en plantas y microorganismos. Aceptores finales distintos de O2
2. Explique en que consiste el modelo quimiosmótico de la fosforilación oxidativa. Explique las evidencias experimentales que lo
apoyan.
3. Indique si las siguientes proposiciones son verdaderas o falsas. Explique.
a. La respiración sólo ocurre en presencia de O2.
b. El aparato molecular para la respiración sólo se encuentra en células eucariotes.
c. En presencia de un agente desacoplante, la energía producida por el transporte de electrones es disipada como calor.
d. El barbitúrico amital bloquea la formación de ATP a partir de la oxidación de isocitrato, pero no a partir de la oxidación de
succinato.
e. La relación P/O para FADH2 es 3.
f. En el ciclo de los ácidos tricarboxílicos el O2 no participa en forma directa, sin embargo solo puede funcionar en presencia
de O2.
4. Los grupos hemo de citocromos mitocondriales son esencialmente idénticos en su estructura. ¿Cómo explica que sus
potenciales redox difieran en más de 0,2 V?.
5. Explique a qué se llama Ciclo Q.

Clase 2
6. Identifique los elementos claves del complejo de la ATP sintasa y explique el rol de la oligomicina. Describa el mecanismo de
catálisis rotacional.
7. Cómo es la estequiometría del consumo de O2 y la síntesis de ATP.
8. Explique en que consisten los sistemas de transporte de nucleótidos y fosfato a través de la membrana mitocondrial interna.
Cuál es el rol de la fuerza proton-motriz.
9. Describa el rol del ADP en el control respiratorio.
10. Describa los mecanismos de desacoplamiento y sus consecuencias.
11. Explique el modelo de funcionamiento de la reacción catalizada por la ATP sintasa de mitocondria e indique que evidencia
experimental lo apoya.
12. Teniendo en cuenta: a) la teoría quimiosmótica, b) que las vesículas formadas por la membrana mitocondrial interna invertida
(con F0F1 ATPasa hacia afuera) son capaces de realizar fosforilación oxidativa:
i. Dibuje un diagrama mostrando la dirección del flujo de H + durante el transporte de electrones en las vesículas
submitocondriales.
ii. En el diagrama indique la dirección del flujo de H+ a través de F0F1 ATPasa durante la síntesis de ATP.
iii. Prediga el efecto de oligomicina y atractilósido en el transporte de electrones y la síntesis de ATP.
13. El tejido adiposo marrón, presente en cuello y espalda de recién nacidos, pero ausente en adultos, contiene numerosas
mitocondrias. Dichas mitocondrias producen menos de un ATP por átomo de oxígeno consumido, durante la oxidación de NADH.
i. Sugiera una función fisiológica para la baja relación P/O en este tejido.
ii.Sugiera posibles mecanismos para mantener esta baja relación.
1
 Problemas
Clase 1
1 . a- Las deshidrogenasas láctica y málica catalizan respectivamente las siguientes reacciones:
L-lactato + NAD+  piruvato + NADH + H+ Eo'= -0,180V
L-malato + NAD+ oxalacetato + NADH + H+ Eo'= -0,102V
En presencia de ambas enzimas y de NAD+ agregado en cantidades catalíticas, a pH 7 y 30 °C, se coloca:
L-lactato 0,01M - piruvato 0,01M
L-malato 0,004M - oxalacetato 0,004M
¿En qué sentido transcurre espontáneamente la reacción global?. Indique dicha reacción.

b.¿Cuál será el mínimo valor de E' de una reacción redox (2e -) para que mediante la fosforilación acoplada, se pueda sintetizar
una molécula de ATP a partir de ADP y Pi?.
Suponga que G' para ATP  ADP es -10 kcal/mol, en condiciones intracelulares.

c . Durante la fosforilación oxidativa (suspensión de mitocondrias en un medio de pH = 7,4) se ha encontrado que el pH interno de
la matriz es 7,7.
a) Calcule la concentración molar de H+ en el medio exterior y en la matriz en estas condiciones.
b) ¿Cuál es el incremento de energía inherente a esta concentración?.
c) Calcule el número de iones H+ de una mitocondria hepática que respira, suponiendo que el compartimiento de la matriz
interna es una esfera cuyo diámetro es 1,5 m.
d) A partir de estos datos ¿se puede suponer que el gradiente de pH, por sí solo, es lo suficientemente grande para producir el
ATP?.
e) Si no es así, ¿puede sugerir de donde procede la energía necesaria para la síntesis de ATP?.

2. a. En un sistema transportador de electrones bacteriano se requiere, para su funcionamiento, 4 transportadores (a, b, c y d),
cuyas formas oxidadas y reducidas pueden distinguirse espectrofotométricamente. Tres inhibidores diferentes bloquean la
respiración en presencia de sustrato y oxígeno, dando los estados de oxidación que se muestran en la siguiente tabla:

inhibidor a b c d
1 + + - +
2 - - - +
3 + - - +

+ y - indican totalmente oxidado y totalmente reducido, respectivamente.

Indique el orden de los transportadores a, b, c y d en la cadena respiratoria bacteriana.

b. Se determinó los potenciales redox (de reducción) de los cinco transportadores electrónicos de membrana de un
microorganismo:

PAR REDOX N 0 electrones E o’ (V)

Dox/Ered 2 -0.32
Fox/Gred 2 -0.62
Hox/Ired 1 +0.18
Jox/Kred 2 +0.75
Lox/Mred 2 +0.88

Por otro lado, en experimentos utilizando un inhibidor de la cadena de transporte electrónico, se encontró que en presencia del
inhibidor el estado redox de los transportadores es el siguiente:
D, F, H y J reducidos y L oxidado
Puede predecir la secuencia de los transportadores en la cadena? Justifique su respuesta.

3. a. Para estudiar el ciclo de Krebs por respirometría, en un homogenado de levadura, se realizó una serie de incubaciones,
según el siguiente esquema:

Tubo 1 2 3 4
Mezcla básica sí sí sí sí
Piruvato no sí no sí
Malato no no sí no
Malonato no no no sí

Mezcla básica: buffer + ADP + Mg++ + levadura.

Todas las incubaciones se realizaron en presencia de O2
a1) Otórguele al consumo de O2 y a la obtención de energía un valor relativo respecto al control, y explique detalladamente los
resultados propuestos.
a2) ¿Qué variaciones observaría en el tubo 2 si realiza las siguientes modificaciones?:
2
 i) con 2,4 - dinitrofenol
ii) sin ADP
iii) sin ADP, con 2,4-DNP
iv) con oligomicina
v) con CN-
Explique su respuesta.

a3) Explique como calcularía la relación P/O del tubo 2. ¿Qué datos necesita y cómo los obtiene?:

b. Una compañía farmacéutica ha enviado dos nuevos inhibidores metabólicos para caracterizar como posibles antibióticos. Se
hizo un experimento en el que se incubó una preparación de mitocondrias de hígado aisladas con piruvato, O2, ADP y Pi, y se
encontró que la adición del inhibidor A bloquea tanto el transporte de electrones como la fosforilación oxidativa. Cuando se agrega
el inhibidor B, además del A, se encontró que se reestablece el transporte electrónico pero no la fosforilación oxidativa.
b1¿Cómo clasificaría a estos inhibidores, con respecto a su modo de acción sobre el transporte electrónico y la fosforilación
oxidativa?.
b2. Nombre un par de inhibidores conocidos con los cuales obtenga los mismos resultados.

3
 Clase 2
1 . Durante mucho tiempo se creyó que B. subtilis era un aerobio estricto sin embargo luego se comprobó que puede crecer
anaeróbicamente en presencia de NO3- como aceptor terminal de electrones. En estudios previos se empleó glucosa como fuente
de carbono, para examinar el crecimiento anaerobio de B. subtilis en medio mínimo, en presencia de nitrato. Con la finalidad de
determinar si la utilización de NO3- es verdaderamente respiratoria y está asociada a la producción de energía, se examinó el
crecimiento anaeróbico empleando una fuente de carbono no fermentable. Las células se crecieron en anaerobiosis en un medio
mínimo suplementado con diferentes sustratos como se indica en la leyenda de la
figura.

Crecimiento anaerobio de B. subtilis cultivado en medio mínimo Spizizen con

DO600
0.2% glutamato, y 50 mg triptofano y fenilalanina por ml. Cada medio fue
suplementado con:
1% glucosa (○),
1% glycerol (□),
1% glucose and 0.2% KNO3 (),
1% glicerol y 0.2% KNO3 (●),
1% glucosa y 1% piruvato (■),
o 1% glicerol y 0.2% fumarato (▲).
a.- Que conclusión extrae de la comparación entre las curvas con glicerol vs.
glicerol + NO3- ? tiempo (h)
b. Y cuando compara estas dos con glicerol + fumarato?
c. Puede la bacteria crecer anaerobicamente por fermentación?
d. Cuál es el efecto del piruvato?
e. Cuál es el producto final del transporte de electrones? Cuál sería el producto final si empleara NO2- como último aceptor?
f. Qué ocurriría en cada uno de los casos anteriores al agregar los siguientes compuestos: rotenona, antimicina A, cianuro,
dinitrofenol, valinomicina?
g. Cómo se modificaría el gráfico si la bacteria empleara fumarato como último aceptor?

2. Acetobacter diazotrophicus es una bacteria aeróbica capaz de fijar nitrógeno atmosférico (N2). En un medio de cultivo con bajo
contenido de nitrógeno (por ej.: NH4+ 1 mM), esta bacteria comienza su desarrollo consumiendo este compuesto hasta agotarlo,
momento a partir del cual comienza a utilizar nitrógeno atmosférico para continuar su
Figura 1
crecimiento. Esto es posible mediante la inducción de una enzima, la nitrogenasa, que cataliza
+
la transformación de N2 a NH4 reacción que requiere una elevada cantidad de energía (ATP) y 1
de poder reductor. A
Una característica particular de la nitrogenasa es que es inhibida por el O2 y sólo es activa en B
2,0
un medio carente de él o con concentraciones muy bajas de este elemento. Por otra parte, A.
DO560

diazotrophicus por ser un aerobio estricto requiere la presencia de O2 en el medio y por lo tanto
1,0
debe desarrollar algún mecanismo de protección de la enzima nitrogenasa. Con el objeto de
explorar los posibles mecanismos de protección se estudió el sistema respiratorio de esta
bacteria mediante las experiencias que se describen a continuación:
nmol O2/ min. ml

A 2
Demanda de O2

600 B
I. Se siguió el crecimiento bacteriano y el consumo de oxígeno de dos cultivos de A.
400
diazotrophicus: con NH4+ 40 mM (cultivo A), y con NH4+ 1 mM (cultivo B). Los resultados
correspondientes a las curvas de crecimiento en cada una de las condiciones anteriores se 200
presentan en la Figura 1 (la flecha indica el momento en que en el cultivo B se agota el amonio
y se induce la enzima nitrogenasa). 10 30 50
Horas de cultivo
a-¿Qué puede decir en cuanto al consumo de oxígeno / bacteria en ambos cultivos?
b-¿Qué le sugieren estos resultados acerca del problema en estudio?
II. Se analizó el sistema respiratorio de bacterias de los cultivos A y B. Se determinó que en preparaciones de membranas de
bacterias de ambos cultivos había varios tipos de citocromos, pero que en las membranas de (A) estaba presente en mayor
proporción una citocromo oxidasa a1 mientras que en las membranas (B) se encontraba mayoritariamente una citocromo oxidasa
a2. Cuando a membranas de bacterias crecidas en esta última condición se las trataba con el detergente Tritón X100 ya no se
detectaba la presencia de un citocromo de tipo c.

c- ¿Qué tipo de análisis se realizó? ¿En base a qué propiedades de las moléculas se pudieron hacer las determinaciones?
d-¿Cómo explica que el tratamiento con Tritón X100 extraiga el citocromo c y no los otros citocromos?
e- ¿Qué otros componentes integran la cadena respiratoria? ¿Cómo podría determinar su presencia? Describa los
ensayos/medidas que haría.
f-¿Qué conclusión extrae de este experimento?

4
III. Se determinó el efecto de KCN sobre la actividad respiratoria de partículas de membranas de bacterias de los cultivos (A), (B),
y membranas tratadas con Tritón X100 (A’ y B’). Los resultados están en la tabla 1 y se indican en valores relativos a la respiración
sin KCN.
Los valores de las distintas preparaciones de membranas están referidas a la preparación A sin tratar (100 %, valor sombreado).
Tabla 1
KCN actividad respiratoria relativa

(mM) A A’ B B’
- 100 97 98 75
0,1 51 48 32 25
1,0 6 6 7 5

Estos y otros resultados sugirieron que la cadena respiratoria de A. diazotrophicus podría tener más de una rama. En base a esta
posibilidad y haciendo uso de sus conocimientos sobre el funcionamiento de las cadenas transportadoras de electrones conteste
las siguientes preguntas:
g- ¿Sobre qué moléculas ejerce la inhibición el KCN?
h-) ¿Qué otra conclusión extrae de estos resultados?
i- ¿Qué conclusiones extrae entonces de los datos de la Tabla 1 en relación al efecto del CN-?
j- ¿Considera posible que una de las dos ramas de la cadena respiratoria en los cultivos B tenga una menor relación P/O? Si cree
que es posible, explique de que modo puede ocurrir. ¿Ud. cree que eso representaría una ventaja para la bacteria? Justifique su
respuesta.
k- Alguien propuso explorar esta posibilidad utilizando un desacoplante que actuara sólo sobre una de las dos ramas. ¿Es posible
que un desacoplante actúe sobre una sola rama de la cadena respiratoria? Fundamente su respuesta considerando el mecanismo
de acción de los desacoplantes conocidos. ¿De qué manera estudiaría el funcionamiento de cada una de las ramas de la cadena
respiratoria en A. diazotrophicus?
l- Haga un esquema de la que podría ser la cadena respiratoria de esta bacteria creciendo en presencia y en ausencia de amonio
de acuerdo a los resultados anteriores.

3 . Beggiatoa spp es un género de bacterias, cuyo hábitat es agua fresca y que son capaces de crecer con acetato en presencia
de oxígeno. A diferencia de otras bacterias heterótrofas son sensibles a elevadas concentraciones de oxígeno y toleran
concentraciones de sulfhídrico que resultan tóxicas para otras bacterias, siendo su velocidad de crecimiento más rápido en
presencia de sulfhídrico que en su
ausencia. A fin de tratar de
entender los mecanismos que han
desarrollado para adaptarse a este
tipo de habitats, se hicieron los
siguientes experimentos.
A- Aislamiento de membranas y
estudios espectrocópicos: contiene
citocromos de tipo a, b, c y
unidores de CO y ubiquinonas
B- Una suspensión concentrada
de bacterias en medio BH (4mM
acetato de sodio, sales, pH 7.3)
fue crecida durante 12hs hasta obtener un cultivo saturado. Una alícuota de ese cultivo fue diluido en 2mL de BH adicionado con
400 L de acetato de sodio marcado radioactivamente ([2- 14C] acetato, 5mM; 0.4Ci/mol) y Na235S. A distintos tiempos se
midió:
i) El consumo de O 2 (tabla 1 columna 3) empleando un electrodo sensible al O2.
ii) La cantidad de 14CO 2 producido, colectando el 14CO2 desprendido con filtros saturados en KOH. La radioactividad del papel
se determinó empleando un contador de centelleo (tabla 1 columna 4).
Iii) La cantidad de 35S 0 que precipita en el tubo de reacción (tabla 1 columna 5).
Estos estudios se hicieron en ausencia (tubos control) y en presencia de distintos inhibidores (tabla 1).
a. Indique cuántas cpm 14CO 2 se obtuvieron a los 10 min en la muestra control. Considere que tiene 2mg de bacterias por mL
y que la eficiencia del contador es 10%.
b. Escriba las fórmulas, las reacciones balanceadas y los nombres de las enzimas intervinientes para la ruta metabólica que
da origen a CO2.
c. ¿Cuál es el rendimiento energético de la oxidación completa de acetato en la bacteria? Compárelo con el rendimiento
teórico obtenido a partir de los datos termodinámicos ¿Cuál es la relación P/O teórica al crecer empleando acetato en un medio
sin H2S?.
d. Indique cómo hace Beggiatoa para sintetizar glucosa a partir de acetato. Sólo esquematice la ruta indicando los nombres
de los metabolitos intermediarios, no incluya fórmulas químicas. Cuál es la ecuación global de conversión de acetato en glucosa.
5
e. Indique cuáles serían los puntos regulación más importantes de la vía de síntesis de glucosa a partir de acetato.
f. Escriba la ecuación balanceada para la formación de S0 .
g. Compare las estequiometrías que Ud obtuvo en los incisos anteriores (b y f) con la determinada experimentalmente para los
tubos control. ¿Qué conclusiones saca de esta comparación?.
h. Analice el efecto de los distintos inhibidores sobre la respiración. Teniendo en cuenta los sitios de acción de lo inhibidores,
i. Analice el efecto de los distintos inhibidores sobre la producción de S0. Cuáles serían los transportadores de electrones
involucrados en la producción de S0 y en la producción de O2 a partir de acetato
j. ¿Qué funciones puede tener el H2S en el metabolismo de esta bacteria? ¿Puede ser empleado como fuente de energía? Cuál
sería el rendimiento teórico en moles de ATP producidos por moles de H2S consumidos?

Otros datos: E0 O2 /H2O= 0.82V; E0 NAD+ /NADH= -0.32 V, E0 S0/HS-1 =-0.278 V, E0 SO4-2/HS-1 =-0.218V,
E0 HCO3-1/acetato =-0.350V. F= 95.5KJ/V.mol
G0 ATP->ADP=-32 KJ/mol, G0 AcetilCoA->Acetato+CoA=-31.4 KJ/mol; 1Ci= 2.22x 1012 dpm.