Imprimir Bio

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA - ING.
AGROINDUSTRIAL
INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES DE

SACCHAROMYCES CEREVISIAE ATCC 4126
I. OBJETIVOS
1.1. Objetivo general:

 Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por
lotes en matraces, empleando una cepa de
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126, evaluándose el
efecto de la fuente de carbono (maltosa) y la velocidad de
agitación en la cinética de crecimiento y la producción de
etanol.
1.2. Objetivos específicos:

 Diseñar y preparar el medio líquido de cultivo para el
desarrollo de la cepa.
 Activación celular y desarrollo del inóculo.
 Determinar la cinética de crecimiento de biomasa.
 Determinar la cinética de consumo de la fuente de
carbono.
 Determinar la cinética de generación de etanol.
 Determinar µM, qS y los rendimientos del nutriente limitante
en células y en etanol, además de las respectivas
productividades en células y en etanol.
 Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cinética.
 Determinación del contenido de azúcares reductores
mediante el método del DNS.
 Determinación de la concentración celular por densidad
óptica.
2
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA - ING. AGROINDUSTRIAL
II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
2.1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO
La finalidad del diseño de un medio de fermentación es elegir los

componentes necesarios para el desarrollo de los productos
correspondientes, por ello se debe tener en cuenta todos los
aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los
sustratos a ser empleados, por ejemplo se debe saber sobre los
requerimientos nutricionales, pues los componentes de los medios
constituyen los factores externos de naturaleza química que
desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir
con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y
además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el
mantenimiento celular.
a) DISEÑO DEL MEDIO DE MANTENCIÓN:
Para la formulación del diseño de medio de mantención para el

cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 se trabajará en
base a 50ml, y se tendrá en cuenta los siguientes requerimientos
nutricionales presentados en la tabla.
Tabla 1:
Concentración de nutrientes para el medio de mantención (50ml) para
el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 para la producción
de etanol.
Medio Nutrientes Concentración (g/l) Pesos (gr)
Extracto de levadura 3 0.15

Sólido de Peptona 5 0.25
mantención (YM
Extracto de malta 3 0.15
sólido)
Agar 20 1
Glucosa 10 0.5
Fuente: Elaboración propia a partir de las referencias de composición para medios de mantención de
la guía de laboratorio de ingeniería de bioprocesos.
3
b) DISEÑO DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN:
Se trabajará los datos teniendo en cuenta que el volumen del

medio de activación representa el 10% del volumen del medio de
fermentación (200ml). Así tenemos:
200 ml →100%
x →10%
x=20 ml
En el cual está presente los siguientes requerimientos

nutricionales presentados en la tabla.
Tabla 2:
Concentración de nutrientes para el medio de activación (20ml) para
el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 para la producción
de etanol.
Medio Nutrientes Concentración Pesos (gr)

(g/l)
Maltosa 20 0.4
Activación Extracto de levadura 3 0.06
Extracto de malta 5 0.1
Solución de sales 5 ml/L 0.1 ml
N: 220 rpm
Fuente: Elaboración propia a partir de las referencias de composición para medios de

activación de la guía de práctica de laboratorio de ingeniería de bioprocesos.
c) DISEÑO DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN:
Se trabajará con el 40% del volumen de un matraz de 500ml es

decir los pesos serán en base a 200ml con una concentración
final no superior de 2 g/L.
Como primer paso se debe calcular la concentración de nutrientes

para el medio de fermentación, para ello se debe tener en cuenta
conocer la composición elemental del M.O (ver anexos)
4
Tabla 3:
Composición del medio mínimo de cultivo de Saccharomyces cerevisiae
ATCC 4126 para el crecimiento en biomasa de 2 g/L.
Y º X S  g  S º  g 
% en % en Sº '
Nutriente Fuente célula compuesto  g  l 
C12H22O11 C 48.5 42.1 0.43 4.65 4.65
Maltosa
(NH4)2SO4 N 8.9 21.2 1.2 1.7 3.4
Sulfato de amonio
(NH4)2SO4 S 0.125 24.2 96.8 0.02 0.04
Sulfato de amonio
KH2PO4 P 1.7 22.8 6.7 0.3 0.6
Fosfato diácido de
potasio
KH2PO4 K 2.5 28.7 5.7 0.4 0.8
Fosfato diácido de
potasio
MgSO4.7H2O Mg 0.3 9.8 16.3 0.12 0.24
Sulfato de magnesio
MgSO4.7H2O S 0.125 13 52 0.04 0.08
Sulfato de magnesio
Fuente: Fuente: Elaboración propia a partir de las referencias de la guía de práctica de

laboratorio de ingeniería de bioprocesos.
Segundo paso, determinación de los pesos necesarios de los

nutrientes para 50ml según las concentraciones.
Tabla 4:
Composición del medio de fermentación para el cultivo de
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 en 50ml.
Medio Nutrientes Concentración (g/l) Pesos (gr)
Maltosa 5 1
Extracto de levadura 1.8 0.36
Fermentación (NH4)2SO4 3.4 0.68
KKH2PO4 0.8 0.16
MgSO4.7H2O 0.24 0.48
Solución de sales 10 ml/L 2ml
Fuente: Elaboración propia a partir de las referencias de la guía de práctica de

5
Tabla 5:
Composición de solución de sales para el medio de fermentación.
Elemento Fuente S0 (g/l)
Ca CaCl2.2H2O 1.12
Zn ZnSO4. 7H2O 0.11
Fe FeSO4.7H2O 0.06
Cu CuSO4.5H2O 0.05
Co CoCl2.6H2O 0.01
Mo MoO3 0.0005
Mn MnCl2. 6H2O 0.027
Na NaCl 0.28
Fuente: Elaboración propia a partir de las referencias de la guía de práctica de

2.2. PREPARACIÓN DE MEDIOS
La preparación de medios es una etapa fundamental para el

desarrollo de procesos de fermentación, asegurando de este modo
la productividad de los mismos.
No obstante, se debe tener en cuenta que los microorganismos
varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden
necesitar por lo cual se les distingue en las siguientes categorías de
componentes:
 Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro
que están representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.
 Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales

de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en
cantidades de miligramos o microgramos por litro.
 Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente

por componentes orgánicos suministrados en baja concentración
y que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino
6
incorporados a estructuras celulares y de función metabólica

específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos
no saturados, etc.
2.2.1. Condiciones de asepsia: Cuando se trabaja con cultivos

microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la
introducción de organismos adicionales al cultivo. (Ver
Anexos: Diagrama 1)
a) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MANTENCIÓN

 Pesar las cantidades requeridas de cada compuesto.
 Colocar los nutrientes en un matraz Erlenmeyer.
 Agregar 50 ml de agua destilada, utilizando la probeta
graduada.
 Llevar a calentar la mezcla de 1-2 minutos en ebullición
con agitación constante.
 Extraer en caliente, con la ayuda de una pipeta, 7 ml de
solución en 6 tubos de ensayo con tapa y cerrarlos
inmediatamente.
 Colocar los tubos en un vaso de precipitado dentro de
la olla a presión, previamente aflojar las tapas para
permitir el intercambio de gases y esterilizar hasta
121°C durante 20 minutos (controlar los 15 min a partir
de la primera burbuja en la olla a presión).
 Finalizada la esterilización, ajustar las tapas de los
tubos y retirarlos de la olla.
 Colocar los tubos en posición inclinada a temperatura
ambiente hasta el día siguiente. (Ver Anexos: Diagrama
2)
7
b) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN
 Pesar cada compuesto manteniendo los cuidados

respectivos.
 En un matraz adicionar la maltosa 50 ml de agua
destilada.
 En un tubo de ensayo adicionar los demás nutrientes y
adicionar agua destilada.
 Esterilizar el medio de activación en la autoclave por un
tiempo de 15 minutos.
 Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Preparar el microorganismo antes de sembrarlo en el
medio de activación (incubar por 1 hora a una
temperatura de 30-35ºC). En condiciones asépticas los
medios líquidos y hacer el sembrado de la levadura de
medio sólido a líquido. (Ver Anexos: Diagrama 3)
c) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN
 Pesar los componentes para el medio de Fermentación

de 200 mL según la Tabla 2 en la balanza analítica
tomando como tara papel metálico.
 Preparar en un matraz el extracto de Levadura. Añadir
0.06 gr extracto de levadura y disolver con 20 ml de
Tampón citrato. Tapar el matraz con papel metálico.
 Preparar en un tubo de ensayo 1ml de sales conc. y
mezclar con 14ml de agua destilada. Tapar el tubo de
ensayo con tampón de gaza.
 Preparar en un matraz de 500 ml: 1 gr maltosa y mezclar
con 130 ml de agua destilada. Tapar el matraz con papel
metálico.
8
 En un tubo de ensayo grande mezclar el sulfato de

amonio, fosfato diácido de potasio y el sulfato de
magnesio con 15 ml de agua destilada.
 Esterilizar las preparaciones en una autoclave por
15min, el tiempo se contará desde que empieza la
ebullición.
 Dejar enfriar a temperatura ambiente. No mezclar las
cuatro preparaciones hasta el momento de la
fermentación.
 En el momento de la fermentación se mezclarán las
preparaciones con el caldo del inóculo (20 ml).
2.3. MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL Y CULTIVOS DEL

MICROORGANISMO
a) CULTIVO DEL MICROORGANISMO:

 Esterilizar la zona de trabajo y los instrumentos.
 Extraer la cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC
4126 con un asa bacteriológica.
 Sembrar la cepa en forma de estrías en el medio de
mantención, siempre cerca del mechero para evitar la
contaminación de los microorganismos del ambiente.
 Dejar en la incubadora a 30°C por 48 horas
 Refrigerar para su posterior uso.
b) DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO

DE LA BIOMASA POR DENSIDAD ÓPTICA.
El método se basa en el aumento de la turbidez del

medio, al incrementarse la concentración de
microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente
por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta determinación
es necesario que previamente se elabore una curva de
9
calibrado, para lo cual las concentraciones de

microorganismos en el medio son determinadas por peso
seco.
MÉTODO:
Después de haber sembrado la célula en el medio de
activación y colocarlo en el Shaker:
 En condiciones asépticas mezclar los medios

líquidos de fermentación en el matraz de 1 litro.
 Adicionar al matraz de 1litro el matraz que se
encuentra en el Shaker, mezclar y tomar una
muestra de 5 ml con una pipeta esterilizada (punto
0).
 Colocar el matraz de 1 litro en el Shaker y proceder
a tomar muestras de 5 ml cada hora para determinar
la curva de crecimiento en biomasa.
 Cada muestra de 5 ml es usada para leer en el
espectrofotómetro su absorbancia a 640nm. Y luego
es centrifugado a 5000 rpm por 20 minutos en la
centrifuga para guardar el sobrenadante en viales
rotulados y poder usar estas muestras en la
determinación de etanol en el cromatógrafo de
gases y la determinación de azucares reductores.
 Se eliminará el sobrenadante y se re suspende el
centrifugado con agua destilada.
 Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a
fin de eliminar restos de sustrato que pudiera alterar
la determinación.
 Se elimina el sobrenadante, se re disuelve el
precipitado y se seca en la estufa a 80ºC hasta peso
constante.
10
 Con la curva de calibrado de la biomasa (D.O) para

Saccharomyces cerevisiae se determinará la
concentración final de la célula en cada punto.
 Utilizando la ecuación ln(X/ X0) = μt, determinamos
distintos valores de μ.
 Al término de la fermentación se determinará la
productividad, definida como :
X  X0
QX / S 
t  t0
c) DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CONSUMO

(FUENTE DE CARBONO MALTOSA) POR EL MÉTODO
DE AZUCARES REDUCTORES (DNS)
MÉTODO:
Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis
de la muestra:
1. Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen

de muestra a analizar.
2. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a
ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar.
3. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada.
4. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como
blanco.
5. La concentración se obtiene interceptando la medida
de absorbancia en la curva de calibrado.
La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir

de muestras de concentración conocida y analizadas
según este procedimiento.
11
PREPARACIÓN DEL REACTIVO DNS
El consumo de azúcares se determinará mediante el

método de azúcares reductores del ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS; Chaplin y Kennedy, 1987)
La preparación del reactivo DNS se requiere de lo

siguiente:
 10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)

 200 mL /L de NaOH 2N
 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Para la preparación de este reactivo, se disuelve el

tartrato en aproximadamente 500 ó 600 mI de agua,
paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas
soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y
se agita hasta la completa disolución de todos los
componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.
PREPARACIÓN TAMPÓN CITRATO PH: 4.5 A 0.2M

Preparar las soluciones A y B en un matraz:
Solución:
A: 4.202 g Ac. Cítrico, diluido con 100 ml
de agua destilada.
B: 5.882 g Citrato de Sodio, diluido con
100 ml de aguadestilada.
80.25ml (A) 80.25ml (B)
MEZCLAR
AGREGAR 150ml de H2O destilada

Cantidades calculadas
para 300ml de solución Si la mezcla se
tampón encuentra por debajo
NaOH al 0.1M de 4.5 agregar NaOH y
AJUSTAR A 4.5pH si se encuentra por
HCl al 0.1M encima agregar HCl
12
CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

PLAN DE MUESTREO Y REGISTRO DE DATOS
Grupo…………………………………………………………………
Día del experimento ………………………………………………….
Microorganismo ………………………….........Fuente de carbono……………………
pH………………….. T ºC…………….
Nº Hora Tiempo Absorbancia Nombre del Observaciones

(horas) (640nm) alumno (pH)
13
d) DETERMINACIÓN DE ETANOL POR

CROMATOGRAFÍA DE GASES
REACTIVOS Y SOLUCIONES
 Etanol
 Propanol
MÉTODO:
Preparación de 50 ml de solución patrón de Etanol a 6

g/L.
 Concentración de solución patrón etanol = 6 g/l
 Volumen solución patrón etanol a 6 g/L = 50 ml
 Volumen solución etanol 99.7 % = 0.3809 ml
Preparación de 50 ml de solución patrón de Propanol

a 4 g/L.
 Concentración de solución patrón propanol = 4 g/l
 Volumen solución patrón etanol a 4 g/L = 50 ml
 Volumen solución etanol 99.5 % = 0.2487 ml
Estándar interno
ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO
 Instalar una columna capilar RTX-20 utilizando férulas

de grafito para asegurar conexiones herméticas.
 Encender el cromatógrafo de gases, abrir la válvula del

gas portador (helio) y regular cuidadosamente su flujo.
 Ajustar las condiciones cromatográficas.
 Abrir las válvulas de los otros gases, primero el aire y

luego el hidrógeno.
14
 Con una solución de jabón o detergente, verificar fugas

de gases en todas las conexiones.
 Encender el detector y obtener una línea de base

estable
Tabla 6:
Determinación de las condiciones cromatográficas.
T° inicial del horno 55°C

T° final del horno 120°C
Tiempo inicial 3min
Tiempo final 2min
Velocidad de calentamiento 10°C/min. (RATE=rampa)
T° inyector 200°C
Modo de inyección 1μl.
Radio Split 300
Velocidad lineal 32.9 cm/seg
Fuente: guía de practica laboratorio de ingeniería de bioprocesos.
Después de establecer las condiciones cromatográficas se

procede a la determinación de los parámetros de estudio.
Tabla 7:
Determinación de los parámetros de estudio.
Concentración Vol. Etanol Vol. Propanol Vol. Agua

(g/L) (ml) (ml) (ml)
3 5 5 0
2.1 3.5 5 1.5
1.2 2 5 3
0.6 1 5 4
0 0 5 5
Fuente: elaboración propia a partir de las referencias de la guía de practica

15
III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

3.1. Medio de Mantención:
3.1.1 Materiales e instrumentos:
 Guantes.
 Capachos de papel.
 Vasos precipitados 250ml.
 Espátula.
 Probeta graduada. Tubo de ensayo
 Matraz Erlenmeyer.
 Tubos de ensayo
 Pipetas.
 Mechero bunsen
 Varilla de vidrio.
3.1.2 Equipos:
 Balanza analítica.
 Olla a presión. Matraz Erlenmeyer:.
Mechero Bunsen Varilla de vidrio:
Balanza analítica. Vaso de precipitado
16
3.1.3. Reactivos:
 Muestra de Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126.
 Agar.
 Extracto de levadura.
ALGODÓN GASA
3.2. Medio de Activación:
3.2.1. Materiales e instrumentos:

 Algodón.
 Gaza.
 Guantes.
 Matraz de 125ml
 2 tubos de ensayo con tapa
AGITADOR
 Pinzas.
ORBITAL- SHAKER
 Mechero bunsen. Trípode.
 Rejilla
3.2.2. Equipos:
 Olla a presión.
 Shaker.
 pHmetro.
3.2.3. Reactivos: OLLA A PRESIÓN

 Alcohol.
 Sacarosa.
 MgSO4.7H2O.
pH - METRO
17
3.3. Medio de fermentación:

 Gaza.
 Laminillas porta y cubre objeto.
 Probeta graduada.
 Varilla de vidrio.
 Matraz 1L.
 Matraces de 125 ml.
3.3.2. Equipos:
 Espectrofotómetro.
 pH-metro.
 Incubadora.
 Microscopio.
 Micropipeta.
3.3.3. Reactivos:
 Extracto de levadura.
 MgSO4.7H20.
 (NH4)2SO4
 KH2PO4.
SOLUCIÓN DE CENTRIFUGA
SALES
18
3.4. Método del DNS:

 Espectrofotómetro
 Agitador magnético
 Mechero bunsen
 Balanza analítica
 Espátula
 Papel aluminio (capachos)
 2 vasos de precipitado de 1L
 Matraz de aforo de 1L
 Pipeta
 Gradilla
3.4.2. Reactivos:
 10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)
 200 mL / L de NaOH 2N
 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
 Sacarosa Estándar
3.5. Concentración celular por D.O:
3.5.1. Materiales y equipos:

 Espectrofotómetro
 Centrífuga
 Estufa
3.5.2. Reactivos:
 Muestra del medio
 Agua destilada
19
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS
DESARROLLO DEL INÓCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES

SACCHAROMYCES CEREVISIAE ATCC 4126
FECHA
ACTIVIDADES ABRIL 2018 MAYO 2018
SEMANA 1 SEMANA 2 SEMANA3
23 24 25 26 27 30 01 02 03 04 07 08 09 10 11
Recolección de
información
Presentación del
Pre informe
Acopio de
materiales
Esterilización de
materiales de
vidrio
Preparación del
medio de
mantención y
esterilización
Colocación de la
cepa 1 hora
antes en la estufa
Resembrado de
células en el
medio de
mantención
Preparación de la
solución tampón
Preparación de
solución de sales
Preparación del
DNS
Preparación del
DNS y obtención
de la curva de
calibrado
20
FECHA
ACTIVIDADES MAYO 2018
SEMANA4 SEMANA5 S.6
14 15 16 17 18 21 22 23 24 25 28 29
Esterilización y
acopio de
materiales
Preparación del
medio de activación
Inoculación con asa
bacteriológica a
medio rico de cultivo
Tiempo para
Imprevistos
Preparación de los
medios de
fermentación
Inoculación de los
medios y
seguimiento de la
cinética de
crecimiento
microbiano
Determinación de la
curva de calibración
para la
determinación de
biomasa celular
Evaluación y
supervisión del
medio
Determinación de la
producción de
etanol por
cromatografía de
gases
Tiempo para
imprevistos
Presentación del
informe final y
sustentación
21
PROGRAMACIÓN DE CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES
HORARIO
ACTIVIDAD
INICIO FINAL
Jueves 03 de MAYO
 Esterilización de materiales de vidrio 9:00 a.m 9:30 a.m
 Preparación del medio de mantención y
9:40 am 9:50 am
esterilización
 1 hora antes en la estufa, colocar la cepa
 Resembrado de células en el medio de
11:00 am 11:15 am
mantención
 Preparación de la solución tampón 11:20 am 1:00 pm
 Imprevistos: serán recuperados en
horarios extraoficiales al curso.
Viernes 04 de MAYO
 Preparación de la solución de sales
Lunes 07 de MAYO
 Preparación de DNS.
Martes 08 de MAYO
 Preparación del DNS y obtención de la
8:00 a.m. 10:30 a.m
curva de calibrado:
Lunes 14 de MAYO
 Esterilización del medio líquido para la cinética de crecimiento
microbiano.
 Preparación del medio de activación e inoculación con asa
bacteriológica a medio rico de cultivo
Jueves 17 de MAYO
 Preparación de los medios de fermentación, inoculación de los
medios y seguimiento de la cinética de crecimiento microbiano.
 Determinación de la curva de calibración para la determinación de
biomasa celular.
 Evaluación y supervisión del medio. (Constantemente).
22
 Determinación de la producción de etanol por cromatografía de

gases.
Martes 29 de MAYO
 Presentación del informe final y
12 m
sustentación
23
V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. “Determinación de parámetros de co-cultivo de scheffersomyces

stipitis y saccharomyces cerevisiae para la fermentación de residuos
lignocelulosicos para la obtención de bioethanol” Ana Karina Castillo
Plata
2. Biotecnología de la fermentación,Principios, Procesos y Productos .

Owen P.Ward.1989 . Editorial Acribia S.A.Zaragoza-España
3. Principios de la Ingeniería de los bioprocesos, Pauline M.Doran

1998,Editorial Acribia S.A. Zaragoza-España
24
VI. ANEXOS
6.1. Cálculos presentados en la Tabla N 1
MEDIO DE MANTENCIÓN
Hallamos el peso de cada nutriente mediante la regla de tres

simple
 Extracto de levadura:
3g ------- 1000 ml
X -------- 50 ml
X = 0.15 g
 Peptona:
5g ------- 1000 ml
X -------- 50 ml
X = 0.25 g
 Extracto de Malta:
3g ------- 1000 ml
X -------- 50 ml
X = 0.15 g
 Agar:
20g ------- 1000 ml

X -------- 50 ml
X=1g
 Glucosa:
10g ------- 1000 ml

X -------- 10 ml
X = 0.5 g
25
MEDIO DE ACTIVACIÓN
Cálculo del peso en gramos de cada nutriente utilizado para la

preparación de 20 ml de un medio de activación.
 Maltosa:
20g ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.4 g
 Extracto de levadura:
3g ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.06 g
 Extracto de Malta:
5g ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.1g
 Solución de sales:
5ml ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.1 ml
26
MEDIO DE FERMENTACIÓN
Cálculo de la composición elemental del microorganismo

Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126
 Fórmula química de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

CH1.613O0.557N0.158
 Peso molecular del compuesto: 24.737 g/mol.
 Cálculo del % composición elemental para el

microorganismo Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126
Tomando en cuenta solo los elementos según los aportes de
nutrientes: Carbono, Nitrógeno, Azufre, Potasio, Fósforo,
Magnesio.
Fórmula:
(𝐏𝐞𝐬𝐨 𝐦𝐨𝐥𝐚𝐫 𝐝𝐞𝐥 𝐧𝐮𝐭𝐫𝐢𝐞𝐧𝐭𝐞)(𝐧ú𝐦𝐞𝐫𝐨 𝐝𝐞 𝐞𝐥𝐞𝐦𝐞𝐧𝐭𝐨)
%= (𝟏𝟎𝟎%)
𝐏𝐞𝐬𝐨 𝐦𝐨𝐥𝐞𝐜𝐮𝐥𝐚𝐫 𝐝𝐞 𝐥𝐚 𝐜𝐞𝐩𝐚
 Carbono
(12)(1)
%= (100) = 48.5%
24.737
 Nitrógeno
(14)(0.158)
%= (100) = 8.9%
24.737
 Fósforo: Se toma en cuenta el promedio de los intervalos

del componente elemental para las levaduras (0.8 - 2.6),
según la tabla 8 que se presenta en la siguiente página
.
0.8 + 2.6
%promedio = = 1.7%
2
27
 Azufre: Se toma en cuenta el promedio de los intervalos

del componente elemental para las levaduras (0.01 – 0.24),
según la tabla 8
0.01 + 0.24
%promedio = = 0.125%
2
 Magnesio: Se toma en cuenta el promedio de los intervalos

del componente elemental para las levaduras (0.1 – 0.5),
según la tabla 8
0.1 + 0.5
%promedio = = 0.3%
2
 Potasio: Se toma en cuenta el promedio de los intervalos

del componente elemental para las levaduras (1.0 –4.0),
según la tabla 8
1+4
%promedio = = 2.5%
2
Tabla 8:
Componentes elementales en bacterias, levaduras y hongos
Elemento Bacterias Levaduras Hongos

Carbono 50-55 45-50 40-63
Hidrógeno 7 7
Nitrógeno 12-15 7.5-11 7-10
Fósforo 2.0-3.0 0.8-2.6 0.1-1.5
Azufre 0.2-1.0 0.01-0.24 0.1-0.5
Potasio 1.0-4.5 1.0-4.0 0.2-2.5
Sodio 0.5-1.0 0.01-0.1 0.02-0.5
Calcio 0.01-1.1 0.1-0.3 0.1-1.4
Magnesio 0.1-0.5 0.1-0.5 0.1-0.5
Cloruro 0.5 --- ---
Hierro 0.02-0.2 0.01-0.5 0.1-0.2
Fuente: Principles of FermentationTechnology. Stanbury and A. Whitaker. 1989.
28
 Cálculos de la composición del medio mínimo de cultivo de

Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 para un crecimiento
en biomasa de 2g/L.
a) Cálculo nutriente:
(𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜)(𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜)

(100%)
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜
MALTOSA Compuesto Fuente

C12H22O11 C
Peso molecular 342 12
12 ∙ 12
( ) 100% = 𝟒𝟐. 𝟏%
342
SULFATO DE Compuesto Fuente Fuente

AMONIO (NH4)2SO4 N S
Peso molecular 132 14 32
2 ∙ 14
𝑁=( ) 100% = 𝟐𝟏. 𝟐%
132
1 ∙ 32
𝑆=( ) 100% = 𝟐𝟒. 𝟐%
132
FOSFATO DIÁCIDO Compuesto Fuente Fuente

DE POTASIO KH2PO4 P K
1 ∙ 31
𝑃=( ) 100% = 𝟐𝟐. 𝟖%
136
29
1 ∙ 39
𝐾=( ) 100% = 𝟐𝟖. 𝟕%
136
SULFATO DE Compuesto Fuente Fuente

MAGNESIO MgSO4.7H2O Mg S
1 ∙ 24
𝑀𝑔 = ( ) 100% = 𝟗. 𝟖%
246
1 ∙ 32
𝑆=( ) 100% = 𝟏𝟑%
246
b) Cálculo del rendimiento:
%𝑪 𝒆𝒏 𝒏𝒖𝒕𝒓𝒊𝒆𝒏𝒕𝒆
𝒀𝑿⁄ = (𝒇)
𝑺 % 𝑪 𝒆𝒏 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂
Solo al compuesto limitante se le multiplicarás además por

un factor. Donde f para metabolismo aeróbico va de 0.5 –
0.6. Como el proceso se trata de condiciones microareadas
consideramos 0.5.
Nutriente Fuente % en célula % en nutriente
C12H22O11 C 48.5 42.1

Maltosa
42.1%
𝑌𝑋⁄ = (0.5) = 0.43𝑔/𝑔
𝑆 48.5%
30
% en célula % en nutriente
Nutriente Fuente
(NH4)2SO4 N 8.9 21.2

Sulfato de S 0.125 24.2
amonio
21.2%
𝑌𝑋⁄ 𝑁𝑖𝑡𝑟ó𝑔𝑒𝑛𝑜 = (0.5) = 1.2𝑔/𝑔
𝑆 8.9%
24.2%
𝑌𝑋⁄ 𝐴𝑧𝑢𝑓𝑟𝑒 = (0.5) = 96.8𝑔/𝑔
𝑆 0.125%
% en célula % en
Nutriente Fuente nutriente
KH2PO4 P 1.7 22.8

Fosfato diácido de K 2.5 28.7
potasio
22.8%
𝑌𝑋⁄ 𝐹ó𝑠𝑓𝑜𝑟𝑜 = (0.5) = 6.7𝑔/𝑔
𝑆 1.7%
28.7%
𝑌𝑋⁄ 𝑃𝑜𝑡𝑎𝑠𝑖𝑜 = (0.5) = 5.7𝑔/𝑔
𝑆 2.5%
% en célula % en
Nutriente Fuente nutriente
MgSO4.7H2O Mg 0.3 9.8

Sulfato de magnesio S 0.125 13
9.8%
𝑌𝑋⁄ 𝑀𝑎𝑔𝑛𝑒𝑠𝑖𝑜 = (0.5) = 16.3. 𝑔/𝑔
𝑆 0.3%
13%
𝑌𝑋⁄ 𝐴𝑧𝑢𝑓𝑟𝑒 = (0.5) = 52𝑔/𝑔
𝑆 0.125%
31
c) Cálculo sustrato inicial:
𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒓 𝒇𝒊𝒏𝒂𝒍

𝑺𝟎 = ( )
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐
Biomasa: 2g/L concentración final
 Maltosa
Rendimiento = 0.43g/g
2𝑔/𝐿
𝑆0 = ( ) = 4.65 𝑔/𝐿
0.43 𝑔/𝑔
 Sulfato de amonio
Rendimiento = 1.2 g/g (Nitrógeno)
2𝑔/𝐿
𝑆0 = ( ) = 1.7 𝑔/𝐿
1.2 𝑔/𝑔
Rendimiento = 96.8 g/g (Azufre)
2𝑔/𝐿
𝑆0 = ( ) = 0.02 𝑔/𝐿
96.8 𝑔/𝑔
 Fosfato diácido de potasio
Rendimiento = 6.7 g/g (Fósforo)
2𝑔/𝐿
𝑆0 = ( ) = 0.3 𝑔/𝐿
6.7 𝑔/𝑔
Rendimiento = 5.7 g/g (Potasio)
32
2𝑔/𝐿
𝑆0 = ( ) = 0.4 𝑔/𝐿
5.7 𝑔/𝑔
 Sulfato de magnesio
Rendimiento = 16.3 g/g (Magnesio)
2𝑔/𝐿
𝑆0 = ( ) = 0.12 𝑔/𝐿
16.3 𝑔/𝑔
Rendimiento = 52 g/g (Azufre)
2𝑔/𝐿
𝑆0 = ( ) = 0.04 𝑔/𝐿
52 𝑔/𝑔
d) Cálculo sustrato inicial corregido con el sustrato

limitante:
𝑺𝟎 ′ = 𝑺𝟎 (𝒆𝒙𝒄𝒆𝒔𝒐)
Exceso = 2. Sin embargo, el exceso no lo multiplicamos al
compuesto limitante (maltosa), por su propia condición.
 Sulfato de amonio
Sustrato inicial = 1.7 g/L (Nitrógeno)
1.7𝑔/𝐿
𝑆0 ′ = ∙ 2 = 3.4
𝐿
Sustrato inicial = 0.02 g/L (Azufre)
0.02𝑔/𝐿
𝑆0 ′ = ∙ 2 = 0.04
𝐿
 Fosfato diácido de potasio
Sustrato inicial = 0.3 g/L (Fósforo)
33
0.3𝑔/𝐿
𝑆0 ′ = ∙ 2 = 0.6
𝐿
Sustrato inicial = 0.4 g/L (Potasio)
0.4𝑔/𝐿
𝑆0 ′ = ∙ 2 = 0.8
𝐿
 Sulfato de magnesio
Sustrato inicial = 0.12 g/L (Magnesio)
0.12𝑔/𝐿
𝑆0 ′ = ∙ 2 = 0.24
𝐿
Sustrato inicial = 0.04 g/L (Azufre)
0.04𝑔/𝐿
𝑆0 ′ = ∙ 2 = 0.08
𝐿
e) Cálculo del peso en gramos de cada nutriente utilizado

para la preparación de 200 ml de un medio de
fermentación, presentados en la tabla N 4
o Maltosa:
5g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X=1g
o Extracto de levadura:
1.8g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.36 g
o (NH4)2SO4:
3.4g ------- 1000 ml

X -------- 200 ml
X = 0.68 g
34
o KH2PO4:
0.8g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.16 g
o MgSO4.7H2O:
0.24g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.048 g
o Solución de sales:
10ml ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 2 ml
f) Calculo del TFERMENTACION:
o Hallando el 𝜇𝑚𝑎𝑥 mediante el Td:
𝑙𝑛2
𝑇𝑑 =
𝜇𝑚𝑎𝑥
o Tiempo de duplicación:
(Hacemos uso de la tabla 9)
Tabla 9:
Tiempos de duplicación característico dependiendo del tipo
de microorganismo:
Tipo de celula Td (h-1)
Bacterias 0.3 – 20.5
Levaduras 1.0 – 4.0
Hongos 1.5 – 7.0
Fuente: guía de práctica de laboratorio de ingeniería de bioprocesos.
o Hallando 𝜇𝑚𝑎𝑥 :
𝑙𝑛2 𝑙𝑛2
𝜇𝑚𝑎𝑥 = =
𝑇𝑑 1+4
2
35
𝜇𝑚𝑎𝑥 = 0.277
o Hallando TFERMENTACION:
𝑋
𝑙𝑛 ( ) = 𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗ 𝑇
𝑋0
2
𝑙𝑛 ( ) = 0.277 ∗ 𝑇
0.2
𝑇𝐹𝐸𝑅𝑀𝐸𝑁𝑇𝐴𝐶𝐼𝑂𝑁 = 8 ℎ 31 𝑚𝑖𝑛
36
TECNICA ASEPTICA
Matraz
Nombre de la cepa
ROTULAR Fecha
Nombre del
alumno o grupo
SOSTENER Los matraces
Área de
FLAMEAR desinfección 30 cm
a la redonda
La tapa con el
RETIRAR
dedo meñique
Boca de ambos
FLAMEAR matraces en
posición inclinada
Matraz
Inoculo SEMBRAR
estéril
Boca y
FLAMEAR tampones de
los matraces
37
PREPARACION DEL MEDIO

DE MANTENCION
Cantidades requeridas de Balanza

PESAR
cada compuesto analítica
Vaso
20 ml de agua destilada MEDIR
precipitado
Varilla (toda la
DILUIR
mezcla)
Agua destilada hasta 50 ml AGREGAR
Matraz
Nutrientes COLOCAR Erlenmeyer de
250 ml
Mechero
CALENTAR
Bunsen
Varilla de vidrio
AGITAR
(constantemente)
Formación de la
OBSERVAR
primera burbuja
38
6 Tubos de
PREPARAR
ensayo
6 ml de la mezcla anterior ADICIONAR
TAPARLOS Inmediatamente
Los tubos
COLOCAR en un vaso
precipitado
Los tubos de ensayo AJUSTAR El pH a 7
En una olla a
ESTERILIZAR presión a 121°C
por 20 min
ENFRIAR
Los tubos
RETIRAR ajustados
las tapas
De forma
inclinada a
COLOCAR T° ambiente
para
solidificación.
39
PREPARACION DEL
MEDIO DE ACTIVACION

PESAR
cada compuesta analítica
Tubo de ensayo hasta 5 ml

ESTERILIZAR Matraz Erlenmeyer hasta 10 ml
(Por separado) Tubo de ensayo hasta 5 ml
Por separado los

DISOLVER
componentes
El volumen
ALISTAR
requerido de sales
Con una micro pipeta al

Sales minerales AGREGAR matraz con extracto de
levadura
ESTERILIZAR A 121ºC por 15 min
Con los demás

componentes
MEZCLAR
en un ambiente
aséptico
40
PREPARACION DEL MEDIO

DE FERMENTACION

PESAR
Por separado,
DISOLVER cada uno en un
matraz de 1L
AJUSTAR pH 7
Las diluciones
ESTERILIZAR
por separado
ENFRIAR
41
PREPARACION DE
SOLUCION DE SALES
CONCENTRADAS

PESAR
En un vaso de
Con 100 ml de agua destilada DILUIR precipitado con un
agitador magnético
Con agua destilada hasta 1 L ENRAZAR Fiola
Para su posterior
REFRIGERAR
utilización
42

Imprimir Bio

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Imprimir Bio

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA - ING.

INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES DE

1.1. Objetivo general:

1.2. Objetivos específicos:

II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

2.1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

La finalidad del diseño de un medio de fermentación es elegir los

a) DISEÑO DEL MEDIO DE MANTENCIÓN:

Para la formulación del diseño de medio de mantención para el

Medio Nutrientes Concentración (g/l) Pesos (gr)

Extracto de levadura 3 0.15

b) DISEÑO DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN:

Se trabajará los datos teniendo en cuenta que el volumen del

En el cual está presente los siguientes requerimientos

Medio Nutrientes Concentración Pesos (gr)

Fuente: Elaboración propia a partir de las referencias de composición para medios de

c) DISEÑO DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN:

Se trabajará con el 40% del volumen de un matraz de 500ml es

Como primer paso se debe calcular la concentración de nutrientes

Fuente: Fuente: Elaboración propia a partir de las referencias de la guía de práctica de

Segundo paso, determinación de los pesos necesarios de los

Medio Nutrientes Concentración (g/l) Pesos (gr)

Fuente: Elaboración propia a partir de las referencias de la guía de práctica de

Elemento Fuente S0 (g/l)

Zn ZnSO4. 7H2O 0.11

Mn MnCl2. 6H2O 0.027

Fuente: Elaboración propia a partir de las referencias de la guía de práctica de

2.2. PREPARACIÓN DE MEDIOS

La preparación de medios es una etapa fundamental para el

 Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales

 Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente

incorporados a estructuras celulares y de función metabólica

2.2.1. Condiciones de asepsia: Cuando se trabaja con cultivos

a) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MANTENCIÓN

b) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN

 Pesar cada compuesto manteniendo los cuidados

c) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN

 Pesar los componentes para el medio de Fermentación

 En un tubo de ensayo grande mezclar el sulfato de

2.3. MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL Y CULTIVOS DEL

a) CULTIVO DEL MICROORGANISMO:

b) DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO

El método se basa en el aumento de la turbidez del

calibrado, para lo cual las concentraciones de

 En condiciones asépticas mezclar los medios

 Con la curva de calibrado de la biomasa (D.O) para

c) DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CONSUMO

1. Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen

La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir

PREPARACIÓN DEL REACTIVO DNS

El consumo de azúcares se determinará mediante el

La preparación del reactivo DNS se requiere de lo

 10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el

PREPARACIÓN TAMPÓN CITRATO PH: 4.5 A 0.2M

80.25ml (A) 80.25ml (B)

AGREGAR 150ml de H2O destilada

CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

Nº Hora Tiempo Absorbancia Nombre del Observaciones

d) DETERMINACIÓN DE ETANOL POR

Preparación de 50 ml de solución patrón de Etanol a 6

Preparación de 50 ml de solución patrón de Propanol

 Instalar una columna capilar RTX-20 utilizando férulas

 Encender el cromatógrafo de gases, abrir la válvula del