Cinética enzimatica INTRODUCCION Pot ser las enzimas os catalizadores empleados por los seres vivos en una mayoria de reaeciones, es de gran importancia conocer culls son las leves que rigen la cinética de estos biocatalizadores y qué variables afectan Ia velocidad €e reaccidn, pues ese conocimiento permitiré disefar y operar procesos enzimaticos. Cuando una mokécula'de sustrato se ha difundido hasta le vecindad de la enzima, ésta es detenida y atraida por diferentes grupos. Las cadenas salientes de aminodcidos la atraen al mismo tiempo que otros grupos pueden atraer otra porcién de esa misma molécula, lo que puede causar Ia tuptura de alguna lunién u otros cambios en la molécula. A’ lo: anterior se’ le denomina reaccion enzimétiea, ya que los sitios reactivos de una enzima (llamados sitios actives) pueden catalizar una reyccién quimica convirtiendo una molécula en otra Recientemente Seyel,! Laidler y Bunting? han publicado excelentes revisiones sobre los mecanismos de reaccion propuestos para diferentes sistemas y la evidencia experimental en que se basen. Dada fa compleja naturaleza de la enzima y del fendmeno enzimatico en si, fio es de extrafiar que muchos pardmetros afecten la velocidad de reaceion. Fntre los més importantes se euentam: tiempo, temperatura, pH y sustrato. EFECTO DEL TIEMPO EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA, Cuando se efeetiia una reaccién enzimética, se observa, uni aumento en la concentracién del producto y una disminucion en la concentracién del sustrato hasta que la reaceién termina o alcanza suv punto de equilbrio. El cambio observeto en la concentracién inicial respeeto al tiempo se denomina234 Cinética enzimatica velocidad inicial de reaccién y, en general, se expresa en Unidades Internacior nales 0 en moles de producto por minuto: V; oe bajo condiciones especifi- a cas descritas, La figura B.1 A presenta la curva obtenida en una reaccién enzimética y su dependencia del tiempo. La forma de la curva es general pero se presontan muchas otras formas segin Ia naturaleza de la reaccién, las condiciones y la presencia de impurezas.? EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA YEN LA ACTIVIDAD INICIAL, ‘A medida que se aumenta la temperatura, ocurren dos reacciones simulténeas 1. La velocidad de reaccién aumenta como sucede en la mayoria de las reacciones quimicas. 2. La estabilidad de la enzima disminuye por inactivacién térmica. Las constantes de reaceién aumentan con la temperatura de acuerdo con una dink at sustratos estd en el rango de 4000 a 2.000 cal/mol, y de 40.000 a 160 000 cal/mol para las enzimas. En la figura B.1B se muestra el resultado neto de estas dos reacciones en ta forma de una curva acampanada cuya posicin es dependiente del tiempo. Por esta razén, el término “temperatura Optima” es inadecuado y puede ocasionar ferrores, a menos que se interprete como la temperatura éptima para un conjunto particular de pariimetros, ecuacién de Arrhenius, JRT?, y la energia de activacién para EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ESTABILIDAD DE LASENZIMAS, La temperatura de desnaturalizaciéa de una enzima se determina incubando muestras de la enzima a diferentes temperaturas durante periodos especificos Ge tiempo y midiendo después Ia actividad de todas las muestras a la misma temperatura y bajo las mismas condiciones de reaccién. Se ha notado que on los periodos inicisles de incubacién aparece generalmente una pérdida rapida de actividad, pero después ésta permanece constante aunque con una tenden- cia a la disminucién, lo que se explica porque al principio los enlaces hidrofobos, inicos y electrostéticos se debilitan y un aumento en la energia cinética permite cn conjunto la rotacién de las uniones, lo que cambia la Posicién normal de los grupos radicales importantes, etc. La figura B.IC presenta dos easos: en el primero no hay pérdida inicial de actividad; en el segundo I faetividad disminuye répidamente al principio y después permanece constante. ‘Ambas curvas son dependientes del tiempo.t Debido a que la energia de activaciGn es considerable, los efectos de la temperatura son dristicos y debe recordarse que el rango de operacién de las enzimas es limitado y fuera de él, la desnaturalizacion de la proteina es casi total. EFECTO DEL pl EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA El grado de ionizacién de los residuos de aminoacids en la superficie de ta enzima esté en funcidn del pH del medio, por lo que de nuevo se obtiene unaEfecto del pH en Ia activided enzimética 235 ; Weloeidod nical Concenteacién ——— el producto ‘ re / Tiempo « Velocidad . ce rencoibn oh ie v 18 Tenner Votocida fp ‘rica exo ‘observeds (er Seaver av einge TP gama 1c Temperatura Figura 8.1. Tfecte de diferentes parimettos en ta sctividad enrimatica (los eason 1 y 2 50 deseriben en el texto) curva de tipo campana al graficar la velocidad de reaccién contra el pH, aunque las condiciones de reacci6n influyen en ella mucho menos que en los 8808 anteriores. El factor que mds influye es Ia titulacién de los grupos fonizables que mantienen la carga en la superficie, actian en el sitio activo o estabilizan la enzima; cualquier modificacién del o debida al pH altera estas condiciones; se puede decir, pues, que existe un pH éptimo para la enzima, Las ionizaciones del sustrato o del producta deben considerarse también, pues pueden afectar la velocidad de reaccidn, LangerS presenta un estudio experi- mental en el que destaca la importancia de la ionizacién del sustrato y de los productos, sobre todo cuando los estados de jonizacién pueden ser varios, 1a inética se complica bastante y la obtencién de las constantes cinéticas requiere de artificios experimentales y matematicos, El efecto del pH puede proporcionar una informacion valiosa respecto a la naturaleza de Ia enzima y al sitio activo en particular, lo que constituye informacién sobre ef mecanismo de reaceién.6236 Cinética enziméica EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA, Debido a la compleja naturaleza de las reacciones enciméticas existen y han sido comprobados experimentalmente muchos mecanismos de reaccién. Se recomienda al interesatlo consultar los trabajos de Segel,! Laidler2 y Plow. man,8 sobre todo en lo que se refiere a los mecanismos en que participan dos © mas sustratos. A continuacion se presentan diferentes modelos de reacciones: enzimitices de un solo sustrato, En todos los casos se usaré la siguiente nomenclatura: concentracién del sustrato concentracién del producto concentracién de Ia enzima concenteacién del inhibidor concentracién del complejo enzima-susteato K-1/k, constante de disociacién del complejo ES constante de rompimiento de ES.a E +P constante de Michaelis Menten velocidad maxima velocidad inicial de reacci6n con una concentracion de sustrato deter- sminada E En una reaccidn enzimética del tipo S—+ P se pueden distinguir tres etapas. En la primera una enzima B se mezcla con un sustrato S y le reaccion entre ellos produce el complejo enzimasustrato ES. Esta interacci6n es tan ripida que resulta dificil estudiarla sin aparatos especiales. Por lo general existe un exceso de sustrato respecto a la cantidad de enzima, y Ia cantidad de ES aumenta hasta alcanzar un régimen estacionario (48S/dt = 0), El producto P hha aumentado simulténeamente con el aumento de ES hasta que éste dltimo alcanza el réginien estacionario, momento en que la velocidad de formacién del producto es constante, Esta Velocidad constante de formacién se denomina velocidad inicial de reaccton, v, y es determinada experimentalmente en la mayoria de los trabajos de cinética enzimitica. Michaelis Menten estableci6 un modelo de la cinética suponiendo que el complejo ES permanece en equilibrio con la enzima libre y el sustrato a través del curso de la reaceién; sin embargo, Briggs y Haldone? aplicaron un tratamiento. mas general para el estado estacionario. Modelo sin inhi Un modelo simple de una reacei6n enzimética es el siguiente: cE B+ si. plese 1 In velocidad de reaccién se establec® como: = 4 v= SP = pes aEfecto de la concentracién del sustrato en la actividad enzit 237 cuyo comportamiento cinético puede ser deducido; haciendo un balance de materia sobre la cantidad total de enzima, se obtiene la ecuacién de Eyom “B+ ES B) dividiendo [2] por [3] 4 obtiene: ? E+ES @ la velocidad de: Ia reaceién total esti controlada por el segundo paso y le relacién E/ES se calcula suponiendo que ES tiene un valor constante. Durante este estado estacionario, 1a velocidad de formacién de ES es igual ala velocidad de reaccion ki(E) (8) = k_, (ES) + k, (ES) Is} por lo tanto, 16} vo 1 - ke 7 Er ek ml sks o tambisn v = kpE. (8) (91238 Cinética enzimatica ¥ considerando el caso en que Ey =ES, V, Kp, sustituyendo en [9 + ‘més = KE, fo} St+Ky Esta ecuacién se conoce como la ecuacién de Michaelis-Menten; y debe recordarse que para su derivacién se consideré que el segundo paso de la reacci6n es irreversible 0 que en el tiempo cero la concentracién de productos es cero y por ende la simplificacién es valida La constante Ky se define como la concentracién del sustrato cuando la velocidad maxima de reacci6n es Ia mitad. Ky es una constante caracteristica para cada entzima y tiene dimensiones de contentracién; Ky = Kg + Kp/ky ,la constante K, indica la afinidad de una enzima por su sustrato; cuatlto tis pequefio sea K, mayor seri la afinidad de la enzima por el sustrato. La figura B.2 es Ia forma esquemética de la ecuaciéa [10] y como el orden Ge la reaceién, va eambiando de acuerdo con la concentracién relativa de respecto a Ky. Lo anterior se aprecia claramente en la tabla B.1 ciando la concentracién de S es mayor de 10 veces el valor de Ky los cambios en la velocidad de reacei6n son menores, pero a medida que Sse acerca o es me- for que Kyg, la velocidad disminuye en forma lineal. En la tabla B.2 se pre- sentan algunos valores de Ky obtenidos experimentalmente; adviértase que el tango es muy amplio, de 10" a 10* molar, Flay diferentes formas de expresar la ecuacién [10], ya que por ser una hipérbola rectangular se puede obtener al valor de Ving. ¥ el de Kyy sie grafican diferentes parimetros. La figura B.2 representa uno de ellos; eh este caso el ‘inico problema es Ia incertidumbre acerca del valor de la velocidad maxima, pues en general no se conoce. Lineweaver y Burk introdujeron otto método et el que utilizaron el reciproco de la ecuacidn [10]; al graficar los reciprocos de la velocidad y de la concentracién de sustrato obtuvieron una linea recta (Gigura B.3A). La ecuaci6n es la siguiente: (my En esta ecuacién la pendiente de Ia Iinea recta es Ky4/Vyaigi la ordenada al origen 1/Vimx y la interseccién con la sbscisa es — 1/Ky- En las tiguras B.3B y B.3C se presentan otras dos formasde a ecuacién {10}; la representacion de Eadic o Hanes consiste en multiplicar la couscion [11] por 8, con Io que se obtiene (12) ¥ graficando Sv vs 8, obtiene que la pendiente de la recta sea 1/Viqix, laEfecto de la concentracién del sustrato en Ia actividad enzimética 239 rensecto do (S] primer orden resnecto de 1S} Koa ey Figure 8:2. Representacién prifica de ta ecuacién [10]. Los simbotos se deseriben en el texto. A Grafica de Lineweavery Burk Te Tas 3.8 Griica de Eau © de Hanes ts} SK vo Vinie Vine 3.C Gritica de Hotetee 2v vie v aoK weak + ka 11 Vents Kn Figura 8.3. Diferon dimitieas VAST ‘étodos para determinar ls constantes cinéticas de reacciones en240 Cinética enzimética ordenada al origen Ky/Vigx ¥ 12 interseccién con la abscisa Ky. Hofstee rearreslé 1a ecuacién [10] ¥"obtuve we Ky + Y U3} MS ib sraficando ¥ ys v/S encuentra que la pendiente es Ky4, la ordenada al origen, Ving ¥ la interseceion con el oj@ Vinix/Ky. Las tres expresiones son Formas néales y su empleo depende de los datos experimentales que se tengan Conviene sefalar que por complicada que sea una tescci6n su ecuacign de velocidad puede ser expresada on una forme similar a la ecuacion [10], es decir _ i M4 1+C,/8 os en donde C; y C2 son constantes, y al graficar 1/v 98 1/S se obtendré una recta; {a ordenada al origen dard 1/C, (1/Viniq aparente) y Ia interseccién con el eje -1/Cz (1/Kyy aparente); los diferentes tipos de inhibieidn ilustraran esta aplicacion, Inhibicién Algunas sustancias, llamads inhibidores reducen 1a velocidad de una reaccion enzimiitica. Se pueden distinguir dos tipos de inhidicién: el primero se caracteriza por un aumento en la pendiente de la grafica de Lineaweaver-Burk cuando | estd presente, pero la ordenada no cambia, A este tipo de inhibicion se le denomina competitiva. En el segundo tipo el efecto del inhibidor es contrario: la pendiente no cambia pero la ordenada aumenta, A esto se le lama inhibicion anticompetitiva. Cuando ambos efectos ocurren simultanes- mente, s@ dice que la inhibicién es no competitiva. Las tres formas de inhibicién pueden deseribirse tanto en grificas de Lineweaver-Burk como en términos de v contra S. En la inhibicién competitiva, la velocidad de reaccién aumenta mas Ientamente en presencia del inhibidor, pero. la larga alcanza el valor de la velocidad maxima. En Ia inhibicion anticompetitiva, la velocidad inicial de reaccion aumenta eon inerementos de S tan répidos como en ausencia de inhibidor, pero la velocidad maxima aleanzada es inferior a la de la enzima sin inhibidor. En la inhibiciOn competitiva el agregar S puede hacor que se aleance la velocidad méxima, pero no en el caso de Ia inhibicién anticompetitiva. En el caso de la inhibicién no competitiva los efectos son simulténeos y no se puede obtener ninguna caracteristica especial. La figura B4 presenta los tres casos anteriores, tanto de grificas del tipo Lineweaver- Burk como de v contra S. Modelo de inhibicion competitiva El siguiente constituye un posible modelo para este tipo de inhibicion:Efecto de la concentracién del sustrato en la actividad enzimatica 241 ky kp E+seh gs Seip * + us} Siguiendo un desarrollo semejante al anteriar se obtiene: [16] Suponiendo que E: E Kyr se ee 17 ES Ss 7] Suponiendo tambiga que IE ha Megado a la concentracién del régimen permanente: k(EXI) = k Us} Sky VST “Tey VAST vk VSI Figura B.4, Grificas de la velocidad de reaccién vs concenteacién, en la forma de Linewea- ver y Burk, pata diferentes tipos de inhibicién.242 Cinética enzimética donde K; = k-/k2: y sustituyendo [17] y [18] en [16] se obtiene: v= kp Ey [19] Cuando $ ¢s grande Io contenido en el paréntesis cuadrade es cereano a unidad, y v serd igual ak, Ez, €8 decir V,, gc. Cuando Les grande 0 IE no se disocia Fécilmente (esto es K, &3 pequefia), la inhibicion tendré gran efecto, porque la relacién IE/ES seré muy alta. Si utilizamos el reeiproco de la ecuacién [19] y graficamos 1/v contra 1/S se aprecia que la ecuacién [20] dard una Ky ] [20] aparente y que su pendiente sera: S™ (j 41) Viniix K a +(e + VK) Vind ale Vaiss Modelo de inhibicion anticompetitiva kK E+ ss= Sel og+p ka Tf ki ff ky Fl pay TABLA B.1 Relacion de ta concentracton de sustrato (S), respecto a ta constante de Michaelis Menten y la velocidad maxima de reaceion (Vmax) Concerntracion Velocidadt ig 3 88h BibsEfecto dela concentracién det sustrato en la activided enzimética 243 TABLA B2 Valores de ta constante de MichaelissMenten Para algunas enzimas\0, 11 Enzima Sustrate Kypmolaridad Maltasa Maltosa 21 x 107 Sacara Sacarasa 28 x 1077 Fostatasa Glieezo-fosfato 30 x 102 Tripsina Beneil-L-arginina 69 x 107 Lactasa Lactosa 63 x10" Dehidrogenasa Yietic Piruvato 33 x 10-* Si_establecemos todas las suposiciones anteriores y hacemos un balance de matetia obtenemos: kp B; ke vee Yt (es > 6 + 1S 12) Suponiendo que ES y IES estén en concentraciones de régimen permanente, la ecuacion [22] se transforma en: L K, 1 [23] r+ iM Ss K, v= kp By De esta expresion se deduce que aunque la concentracién de § sea muy grande, la fravcion comprendida en el paréntesis munca ser la unidad cuando I y K, son finitas, Esto explica por qué aunque aumente $ no se elimina el efecto de la inhibiciGn no competitiva, Tomando el reefproco de ambos lados de la ecuacién [23] de esto se puede ver que una grifica de 1/y conta 1/S dard una pendiente Ku V, 1 + de ordenada al brigen de —— (1 +1/K)). ‘mix Veni Este mecanismo explica el porqué del aumento en la ordenada y el que no244 Cinética enziméatica cambie la pendiente de Is grafica tipo Lineweaver-Burk para inhibicion anticompetitiva, Modelo de inhibicion no competitiva 1 siguiente esquema representa el caso d inhibicién no competitiva 25] Para este mecanismo Ia velocidad de reaccidn est dada por la velocidad de conversion de ES a E+ P; expresando ES como fraccién de Ey se obtiene: 26) R71 para simplificar se considera que k;/k-2 =k, /k-s, pero en general no ocurre asi. Rearreglando la ecuacién [27] y utilizando el reciproco de ambos miembros se convierte en: 1\1 A! 4 at ince VK DS NR) Vian i En este modelo se aprecia que, en una gritica tipo Lineweaver-Burk, tanto la pendiente como la ordenada’ serén mayores cuando el inhibidor esté presente, pero los cambios relatives dependeran del valor de las constantes de disociacion del inhibidor.OTROS FACTORES QUI APECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA, Otros muchos factores ambientales pueden afectar la actividad enzimitica: éstos incluyen la fuerza i6nica del medio, la presién (especialmente si uno de los reactivos es gaseoso), los buffers empleados, la pureza de los reactivos y de la enzima, etc. Todos ellos deben determinarse experimentalmente, © por lo menos escogerse arbitrariamente y mantenerlos constantes durante cualquier estudio enzimético.? WW. C NOMENCLATURA, constantes concentracion de la enzima (g/l, mg/ml) concentracién del complejo enzima-sustrato (g/!) concentracién de enzima total concentracién del inhibidor constante de Michaelis-Menten (mg/ml) k —1/k, constante de disociacién del complejo ES constante de rompimiento de ES a E +P concentracién del producto (g/l, mg/ml) concentracién del sustrato (¢/1, mg/ml) velocidad maxima (g/l-h) velocidad inicial de reaccién (g/I-h) velocidad inicial de reaccién con una concentracién de sustrato deter- minada (g/I-h) REFERENCIAS. LiL. Segel, Enzyme Kinetics: Behavior and Analysts of Rapid Equilibrium and Steady State Enzyme Systems, John Wiley, Nueva York, 1975. KJ. Laidler y P.S. Bunting, The Chemical Kinetics of Enzyme Action, 2a. ed., Claren- don Press, Oxford, 1973, M, Dixon y F.C, Webb, Enzymes, Academic Press, Nueva York, 1964. LC, Maralen y C.F, Stoneman, Enzymes and Equilibria, Heinemann Educstional Books, Londres, 1974 R. 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