KINETIKA REAKSI ENZIM

Oleh
Ni Made Septiana Dewi Yustanti (1513031053)
Program Studi Pendidikan Kimia, FMIPA, Universitas Pendidikan Ganesha
Jalan Udayana Singaraja, Bali
e-mail: septianady97@gmail.com

ABSTRAK
Praktikum ini bertujuan untuk menentukan Vmaks dan KM untuk waktu 20 menit dan 0 menit yang ditentukan
dengan menggunakan grafik hubungan antara laju reaksi enzimatis dan konsentrasi substrat. Metode yang
digunakan adalah metode eksperimen laboratorium dimana lima dari sepuluh tabung reaksi ini diberi waktu
inkubasi selama 20 menit dan lima tabung reaksi lainnya diberi waktu inkubasi selama 0 menit. Kemudian
dimasukkan larutan kasein, tripsin, buffer pospat dan TCA.. Hasil yang diperoleh adalah harga Vmaks dalam
reaksi enzimatis dengan menggunakan enzim tripsin dan substrat kasein sebesar 0.54mol/menit dan harga KM
sebesar 0.30 mg/mL
Kata Kunci : Kinetika, Enzim, KM, Vmaks

ABSTRACT

This experiment aims to determine Vmax and Km for 20 minutes and 0 min were determined by using charts the
relationship between the rate of enzymatic reaction and substrate concentration. The method used is the method
of laboratory experiments which five of the ten test tubes are given incubation for 20 minutes and five others
were given test tube incubation for 0 min. Then solution of casein, trypsin, phosphate buffer and TCA are
poured into test tube. The result is the price of Vmax in the enzymatic reaction using the enzyme trypsin and
casein substrate of 0,54 μmol / min and KM price of 0,30 mg / mol.
Keywords: Kinetics, Enzyme, KM ,Vmaks

PENDAHULUAN

Enzim merupakan suatu protein yang
mempunyai struktur tiga dimensi tertentu yang
mampu mengkatalisis reaksi biologik. Enzim
dapat meningkatkan laju reaksi karena dengan
adanya enzim maka reaksi yang terjadi
mempunyai energi aktivasi yang rendah
daripada energi biasanya. Enzim membantu
reaksi dalam menyediakan jalur reaksi yang
memiliki energi aktivasi lebih rendah untuk
transisi substrat menjadi produk dibandingkan
dengan proses tanpa katalis, sehingga enzim
disebut sebagai katalisator.
Enzim sebagai katalisator mempunyai
sifat-sifat seperti katalis pada umumnya.
Enzim ikut bereaksi namun pada akhir reaksi
enzim kembali dalam bentuk semula. Hal
tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai
kembali setelah melaksanakan aktivitasnya
sehingga tubuh tidak memerlukan enzim
dalam jumlah besar. Jumlah atau kadar enzim
yang kecil tersebut menimbulkan kesulitan
tersendiri untuk mengukur kadar enzim.
Secara klinis, pengukuran kadar enzim sangat
penting untuk dilakukan (Tika,2010).
Pada kinetika reaksi enzim akan
ditentukan Vmax dan KM dengan menggunakan
kurva hubungan antara laju enzimatis dengan
konsentrasi substrat. Dimana konsentrasi
substrat ini diperoleh pengukuran %T melalui
spektrofotometer20+ dimana %T akan diperoleh
absorbansi dan dari absorbansi tersebut dapat
dicari konsentrasinya. Dari hubungan antara
konsentrasi substrat dan laju reaksi akan dapat
ditentukan nilai Vmax dan KM (Tika,2010).
Laju reaksi awal (V0) dari reaksi yang
dikatalisis oleh enzim meningkat dengan
bertambahnya konsentrasi substrat hingga
tercapai keadaan dimana penambahan substrat
hingga tercapai keadaan dimana penambahan
substrat tidak lagi meningkatkan laju reaksi
awl. Keadaan dimana penambahan substrat
pada laju reaksi awal (V0) dicapai pada kondisi
substrat jenuh. Hal ini dapat dijelaskan dengan
postulat reaksi sebagai berikut dimana E,S,
dan P masing-masing adalah enzim, substrat,
dan produk reaksi.
 k1 k3
E+S ES E+P
k2 k4
reaksi berlangsung melalui menurunkan persamaan yang menggambarkan
pembentukan kompleks-kompleks enzim- hubungan antara laju reaksi awal dan
substrat [ES]. Kompleks ES dapat berdisosiasi konsentrasi substrat. Persamaannya adalah:
lagi untuk membentuk enzim ataupun substrat
atau membentuk enzim dan produk. Konstanta
kecepatan k1,k2,k3 menunjukkan kecepatan 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉0 =
yang berhubungan dengan masing-masing 𝐾𝑀 + [𝑆]
tahap katalitik. Dari pengamatan terhadap
beberapa sifat enzim diketahui bahwa Dalam persamaan ini (Vmax) dan (V0) adalah
kecepatan awal (V0) pada konsentrasi substrat laju maksimum dan laju awal reaksi. [S]
yang rendah akan berbanding lurus dengan adalah konsentrasi substrat dan (KM) adalah
[S]. Namun pada kondisi dimana kecepatan konstanta Michaelis dan Menten yang
substrat yang tinggi, maka akan memiliki nilai rumusnya
maksimum dimana kecepatan tidak lagi 𝑘2 + 𝑘3
bergantung pada substrat. Bila semua enzim 𝐾𝑀 =
𝑘1
berada dalam keadaan ES (enzim dijenuhkan
oleh substrat) maka laju reaksi akan mencapai Sering (KM) didefinisikan sebagai tetapan
nilai maksimum Vmax. Kecepatan disosiasi disosiasi reaksi yang dikatalisis oleh enzim.
produk dari enzim dan penambahan substrat Pada reaksi sederhana dapat dilihat:
lebih lanjut tidak akan mempengaruhi (V0)
(Redhana & Maryam, 2004).
k2 [E ][S ] k2
ES k1 E + S maka K s =[E S ] = k1

k2  k3
Karena KM adalah maka Ks =
k1
k2  k3
k1
Jadi KM akan selalu sama atau lebih besar
daripada Ks. Dilihat dari persamaan:
Vmaks [S] 1  K  1 1
V maka   M  
K M  [S] V  Vmaks  [S] Vmaks
Gambar 1. Hubungan konsentrasi substrat dan
Vo plot langsung Persamaan diatas identik dengan persamaan
garis lurus y = ax + b
Michaelis dan Menten menyatakan Dengan
1 1 K 1
bahwa reaksi enzimatis pada berbagai y= ;x ; a  M dan b 
konsentrasi substrat mengalami dua fase; 1) V [S] Vmaks Vmaks
ketika [S] rendah, daerah enzim tidak
semuanya terikat oleh enzim;2) pada [S]
tinggi, sisi aktif yang terikat seluruhnya
dengan substrat. Pada saat ini enzim telah METODE
bekerja dengan kapasitas penuh (Wirahadi
Kusuma,2001). Alat dan bahan
Kemudian Briggs dan Heldane Alat-alat yang digunakan dalam
menggunakan skema reaksi diatas untuk percobaan ini adalah tabung reaksi,
spektronik20+, gelas kimia 100mL, inkubator
air, sentrifuge, pipet volume 5mL dan 10mL,
batang pengaduk, pipet tetes, spatula, kaca
arloji dan pemanas magnetik.
Bahan-bahan yang digunakan adalah
larutan TCA (Trichloro Asetat) 20%, larutan
kasein 1%, larutan buffer fosfat 0,1 M (pH 8),
larutan tripsin, larutan NaOH 0,5M, dan
reagen folin-ciocalteu.
Prosedur Kerja
Waktu inkubasi 20 menit (t=20 menit)
Sebanyak 5 mL larutan kasein 1%
diinkubasi dalam tabung reaksi selama 5 menit
pada 35oC, kemudian ditambahkan larutan
buffer pospat dan larutan tripsin sambil diaduk
perlahan-lahan. Kemudian diinkubasi selama
20 menit pada penangas air dengan suhu 35oC
dihitung mulai enzim ditambahkan. Reaksi
dihentikan dengan 3 mL penambahan larutan
TCA 20% yang disertai dengan pengadukan
yang kuat. Selanjutnya, didiamkan selama 30
menit dalam air es agar pengendapan protein
dan tripsin dapat berlangsung dengan
sempurna. Setelah itu, larutan disentrifugasi
selama 10 menit lalu disaring. Filtrat yang
diperoleh lalu dikerjakan menurut metode
Anson, dimana filtrate diambil sebanyak 2 mL
lalu ditambahkan 4 mL NaOH 0,5 M dan
reagen cioceltau. Kemudian didiamkan selama
10 menit. Masing-masing larutan yang berada
pada tabung reaksi diukur absorbansinya
dengan menggunakan spektrofotometer.
Waktu inkubasi 0 menit (t= 0 menit)
Ke dalam tabung reaksi dimasukkan
larutan buffer dan larutan enzim. Kemudian
ditambahkan 3 mL larutan TCA 20% lalu
diaduk kuat dan terakhir ditambahkan larutan
kasein 1% sebanyak 5 mL. Kemudian,
diinkubasi selama 20 menit pada penangas air
dengan suhu 35oC dihitung mulai enzim
ditambahkan. Setelah itu, diambil sebanyak 2
mL filtrat kemudian ditambahkan 4 mL NaOH
0,5 mL lalu ditambahkan reagen folin-
cioceltau dan diamkan selama 10 menit.
Selanjutnya, masing-masing larutan dalam
tabung diukur absorbansinya dengan
menggunakan alat spektrofotometer.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam percobaan ini dilakukan
pengujian kinetika reaksi enzim. Kinetika
reaksi enzim ini ditentukan dengan harga Vmaks
dan Km. Harga Vmaks dan Km ini ditentukan
dengan cara membuat grafik hubungan antara
laju reaksi terhadap konsentrasi substrat.
Dalam percobaan ini yang digunakan sebagai
substrat adalah kasein dan sebagai enzim
digunakan tripsin. Tripsin merupakan enzim
proteolitik, enzim ini mengkatalisis hidrolisis
ikatan pepetida, dimana ikatan peptida yang
dipecah dalam substrat kasein terletak pada
sisi karboksil dari residu lisin atau arginin
yang bermuatan.
Sebelum dilakukan pengujian terlebih
dahulu disedikan sepuluh tabung reaksi yang
telah diisi dengan larutan kasein, tripsin dan
buffer asetat dengan konsentrasi yang berbeda-
beda. Kemudian diberi dua macam perlakuan
berbeda. Lima dari sepuluh tabung reaksi
diberikan waktu inkubasi 0 menit dan lima
tabung reaksi lainnya diberi perlakukan
inkubasi selama 20 menit.
Kemudian untuk tabung reaksi dengan
perlakuan inkubasi selama 20 menit, terlebih
dahulu dilakukan inkubasi awal selama 5
menit pada suhu 35oC. Tujuan dari proses
inkubasi ini adalah untuk mengkondisikan
substrat pada suhu yang optimal (35oC).
Setelah itu ditambahkan dengan buffer pospat
(pH =8,0) dan larutan tripsin. Penambahan
larutan tripsin ini bertujuan untuk
mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan peptida
yang ada pada kasein. Larutan selanjutnya
diinkubasi selama 20 menit, dimana pada
inkubasi ini memungkinkan terikatnya enzim
tripsin dengan substrat. Setelah proses
inkubasi selesai dilakukan, barulah pada
larutan ditambahkan larutan TCA 20% dan
disertai dengan pengadukan. Tujuan dari
penambahan larutan TCA ini adalah untuk
menghentikan aktivitas enzim tersebut
sehingga dapat dianalisis pengaruh konsentrasi
substrat terhadap laju reaksi enzimatis.
Terhentinya aktivitas enzim karena
penambahan TCA ini dibuktikan dengan
terbentuknya endapan coklat pada kelima
tabung reaksi ini. Endapan yang terbentuk
merupakan hasil denaturasi protein dari kasein
dan enzim tripsin. Kemampuan TCA untuk
menghentikan aktivitas enzim ini disebabkan
karena larutan TCA bersifat asam sehingga
mampu menurunkan pH larutan sehingga
mampu mendenaturasi protein baik pada
tripsin maupun kasein.
Setelah endapan terbentuk, larutan
disentrifugasi selama 10 menit dan kemudian
dilakukan penyaringan. Sebanyak 2mL filtrat tirosin yang ada pada filtrat menghasilkan
diambil dan ditambahkan 4mL larutan NaOH tungstat. Setelah itu dilakukan pengukuran
0,5mL serta reagen folin-ciocalteu. Reagen ini absorbansi dengan spektronik20+.
direduksi oleh gugus fenolik pada asam amino

(2a) (2b)
Gambar 2. (2a) Filtrat dengan waktu inkubasi 20 menit setelah ditambahkan NaOH dan reagen
Folin-Ciocalteu berwarna biru bening; (2b) pengujian larutan dengan alat spektronik20+
Mengenai larutan dengan waktu inkubasi barulah kemudian ditambahkan
inkubasi selama 0 menit, ada sedikit perbedaan larutan kasein dengan volume berbeda-beda.
dalam prosedur kerjanya. Dimana 5 tabung Kemudian dilakukan penambahan NaOH
reaksi terlebih dahulu ditambahkan larutan dengan reagen folin-ciocalteu dan dilakukan
buffer fosfat kemudian larutan tripsin dan pengukuran absorbansi dengan menggunakan
larutan TCA. Setelah mengalami proses spektronik20+.
Tabel 1. Harga absorbansi dan ΔA pada tabung t= 20 dan t= 0

Tabung ke- Waktu (menit) A ΔA

1 20 0, 230 0, 175
0 0, 055
2 20 0, 440 0, 380
0 0,060
3 20 0, 513 0, 440
0 0, 073
4 20 0, 607 0, 488
0 0, 119
5 20 0, 687 0, 562
0 0, 125

Dari data di atas dapat dihitung nilai 1/V0 1/V0 = 2, 049

pada setiap tabung  Tabung 5 : 1/A = 1/V0; 1/0, 562= 1/V0
 Tabung 1 : 1/V0 = 1, 779
1/A = 1/V0; 1/0, 175 = 1/V0 Kemudian, konsentrasi kasein di setiap
1/V0 = 5, 714 tabung adalah sebagai berikut.
 Tabung 2 : 1/A = 1/V0; 1/0, 380= 1/V0 1,00gram
1/V0 = 2, 631 [Casein] = = 0.01 gr/mL
100 mL
 Tabung 3 : 1/A = 1/V0; 1/0.440= 1/V0
= 10mg/mL
1/V0 = 2, 272
 Tabung 4 : 1/A = 1/V0; 1/0, 488= 1/V0
 Tabung 1 : V1 = 0.1 mL ; V2 = 7 mL ; M1 = 1.0 mL x 10 mg/mL
10 mg/mL M2= 1,428mg/mL
7 mL
M2=
[S] = 1, 428, jadi 1/[S] = 0,700
0.1 mL x 10 mg/mL
 0,1428mg/mL  Tabung 4 : V1 = 3.0 mL ; V2 = 7 mL ; M1
7 mL = 10 mg/mL
[S] = 0, 1428 jadi 1/[S] = 7, 042 M2=
 Tabung 2 : V1 = 0.5 mL ; V2 = 7 mL ; M1 3.0 mL x 10 mg/mL
= 10 mg/mL  4,285mg/mL
7 mL
M2=
[S] = 4, 285 jadi1/[S] = 0, 233
0.5 mL x 10 mg/mL
 0,714mg/mL  Tabung 5 : V1 = 5.0 mL ; V2 = 7 mL ; M1
7 mL = 10 mg/mL
[S] = 0, 714 jadi 1/[S] = 1, 401 M2=
 Tabung 3 : V1 = 1.0 mL ; V2 = 7 mL ; M1 5.0 mL x 10 mg/mL
= 10 mg/mL  7,142mg/mL
7 mL
[S] = 7,142, jadi 1/[S] = 0.140

Table 2. Data 1/[Vo] dan 1/[S]

Tabung 1/[Vo] 1/[S]
1 5,714 7,042
2 2,631 1,401
3 2,272 0,700
4 2,049 0,233
5 1,779 0,040

1 1
Berdasarkan data dari tabel 2. Maka dapat dibuat kurva hubungan dan
[S] Vo .

kurva hubungan antara 1/V0 dengan 1/[S]

7
6 y = 0.5488x + 1.8555
R² = 0.9985
5
4
1/v0 Series2
3
Linear (Series2)
2
Linear (Series2)
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
1/[S]

Gambar 3. Kurva hubungan antara 1/Vo dan 1/[S]

Kurva di atas menghasilkan persamaan garis Lineweaver-Burk, maka nilai dari 1/Vmax,
lurus dengan y = 0,5488x+1,855 dengan R = 1/[S], dan -1/Km dapat ditentukan.
0.9985. kemudian, dengan mengkombinasikan 1  KM  1 1
garis lurus tersebut dengan persamaan    
Vo  Vmaxs  [S] Vmax
 1 2. Harga Km untuk reaksi enzimatis dengan
Nilai dari pada x = 0, enzim tripsin dan substrat kasein dengan t
Vmax
= 0 menit dan t = 20 menit adalah 0.30
y = 0,5488x+1,855 mg/mL dan harga Vmaks sebesar 0.54
y 0,5488 (0)+1,855 mol/menit
1
y = 1,855, = 1,855
Vmax
UCAPAN TERIMAKASIH
jadi Vmax = 0.54 mol/menit
jika y=0, maka Ucapan terima kasih penulis sampaikan
y = 0,5488x+1,855 kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., dan I Dewa
0 = 0,5488x+1,855 Subamia selaku laboran di Jurusan Pendidikan
-0,5488 = 1,855 Kimia atas masukan dan sarannya sehingga
x = -3,380 percobaan ini dapat dilaksanakan dengan baik.
1
- = -3,380
KM
DAFTAR PUSTAKA
jadi 𝐾𝑀 = 0,30𝑚𝑔/𝑚𝐿
Redhana, I Wayan dan Siti Maryam. 2003.
Penuntun Praktikum Biokimia.
SIMPULAN Singaraja : IKIP Negeri Singaraja
Berdasarkan uraian pembahasan di atas maka
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun
dapat disimpulkan beberapa hal sebagai
berikut : Praktikum Biokimia. Singaraja:
1. Kinetika reaksi enzim dapat dipelajari dan Universitas Pendidikan Ganesha
ditentukan dengan menentukan harga Km
dan Vmaks