LABORATORIO MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA 3: Preparación de medios de cultivo y esterilización

. Docente: Laura Milena Rivera García

Preparación de medios de cultivo y esterilización.

Objetivos:
Al finalizar el trabajo práctico usted estará en capacidad de:
1. Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de medios de cultivo
deshidratados.
2. Indicar el método de esterilización apropiado.

Marco teórico:
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y
en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos
medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su
fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y
reproducibilidad de los resultados obtenidos.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de
oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de
cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de
las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes
bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos
de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor
nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos
que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el
crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo,
la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras
(el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido.
La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria
de las bacterias Gram-positivas).
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como
mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán
necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne,
extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas
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sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores
nutritivos lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar
peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón
ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las
proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más
simples de nitrógeno presentes en la peptona.
En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que
pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida.

Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le

añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus
constituyentes en:

 Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen

animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de
minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las
cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
 Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición
química definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de
investigación.

De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:

 Medio enriquecido: medio que presenta un gran exceso de nutrientes y se
utilizan para microorganismos que tiene grandes exigencias nutricionales.
 Medios selectivos: están diseñados para el aislamiento de microorganismos
específicos.
 Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos
derivados de la actividad metabólica microbiana. No contienen ningún tipo de
sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características
fisiológicas de los microorganismos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus
constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos asequibles
comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los
medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se
tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

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 Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o
proveedores que suministren productos de calidad.
 Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y
fisicoquímica adecuada.
 Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o
desmineralizada.
 Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca
se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.

ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las
condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco
(entre 15 y 25oC), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa.

Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre
2 y 8oC, a menos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener
en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación.

Materiales:
Los medios que va a preparar son: Plate Count Agar (PCA), Agar bacteriológico,
Caldo nutritivo, Agua destilada estéril, agar tripticasa de soya, caldo tripticasa de
soya.
Cajas de Petri
Tubos de ensayo
Cinta esterilidad

Procedimiento:
1. Lea cuidadosamente la etiqueta y prepare los medios siguiendo las instrucciones;
adicionalmente revise el libro de medios Merck las características de los medios e
instrucciones de preparación.
2. Para diluir los medios se debe utilizar agua destilada, limpia y con el pH lo más
cercano posible al neutro. Debe medir el agua en material volumétrico y pesar el
medio de cultivo, reconstituir y en caso de ser sugerido en la etiqueta llevar a
ebullición hasta total disolución.
3. En caso de ser agares dejar en el Erlenmeyer, marcar, tapar. En caso de ser caldo
servir en los recipientes en los que van a quedar las muestras el agua peptona
servir 9mL en cada tubo y los caldos servir 5mL en cada tubo.
4. llevar al autoclave, encender y esperar que alcance los 121ºC/15 libras de presión
por 15 minutos, una vez completado el proceso, abrir la válvula esperar que

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despresurice el sistema y sacar las muestras. Verificar con la cinta indicadora que
se haya completado el proceso.
5. Deje enfriar hasta que sea capaz de colocar el Erlen-Meyer sobre la piel, en este
momento comience a servir el medio en las cajas de petri, tubos y en los tubos,
adicionando aproximadamente 15 a 20 ml por caja de petri y llene un poco menos
de la mitad, los tubos.
6. Deje solidificar completamente el agar, Algunos tubos déjelos solidificar de forma
inclinada.
7. Selle las cajas y los tubos con papel para film o cinta de enmascarar, guarde en
lugar seco y seguro, ya que este medio se utilizara en la práctica siguiente.
8. Separe, un tubo de medio líquido, otro solidó y una caja de petri con medio solidó
para incubar a 37°C.

Vertido en placa: en el caso de las cajas de Petri, esperar 45 a 50ºC, una vez alcanzada la
temperatura servir en las cajas, cerca de los mecheros para garantizar un ambiente
estéril; para esto debe usar guantes y tapabocas. Esperar que solidifiquen para ser
usados.

Tubos de agar inclinado bisel o pico de flauta y tubos sin inclinación: servir el agar en
tubos de ensayo que todavía esté en estado líquido (45-50ºC), colocar en posición
inclinada de tal forma que se forme un bisel y esperar que solidifiquen.

Para los tubos con agar sin inclinación, servir en tubos a temperatura líquida, colocar en
gradilla y esperar que se enfríen.

Verificar: la estabilidad del agar, pH, esterilidad.

Completar con los medios usados la siguiente información: Microrganismo objetivo,

composición del medio, forma de preparación, interpretación del medio.

Cepas ATCC
1. Buscar los siguientes microorganismos en American Type Culture Collection:
-Salmonella
-Escherichia coli
-Sacharomyces cerevisiae
-Lactobacillus lactis
- Entamoeba sp.
-Listeria
-Zika

Caracterizar: número, clasificación, aislado de?, formato del producto, nivel de

bioseguridad, depositario, recomendaciones de siembra e incubación.
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Contenido que debe tener el informe:

El informe debe contener:
- Título.
- Resumen.
- Palabras clave.
- Introducción.
- Materiales y métodos.
- Resultados y análisis de resultados.
- Cuestionario.
- Bibliografía.

Cuestionario:
1. ¿Para qué se dejan incubando algunos medios de cultivo recién preparados en
incubación?
2. ¿El medio de cultivo preparado en la práctica en que categoría lo clasificaría y por
qué?
3. Investigue de donde proviene el agar-agar y cuál es su estructura.

Bibliografía a consultar o de apoyo:

- Michael T. Madigan; John M. Martinko; Jack Parker (2015): Brock Biología de los
Microorganismos , Ed.Pearson Prentice Hall
- Brown C.M.. Campbell I., Priest F.G. (1998). Introducción a la biotecnología”. Ed
Acribia
- Smith J.E., (1996): Biotechnology (3ª edición). Cambridge: Cambridge University
Press

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