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FARMACIA 

 
 
 
 

 
MICROBIOLOGÍA 
 
2017 
 
TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 
 
 
CULTIVO DE 
MICROORGANISMOS

FARMACIA 

ÍNDICE 
NUTRICION BACTERIANA ........................................................................................................... 1 
1.  CONCEPTOS BÁSICOS ...................................................................................................... 1 
2.  CLASES DE NUTRIENTES .................................................................................................. 2 
2.1.  Nutrientes Universales ............................................................................................. 2 
2.2.  Nutrientes Particulares ............................................................................................ 4 
3.  MEDIOS DE CULTIVO ....................................................................................................... 5 
3.1.  CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA COMPOSICIÓN .. 6 
3.2.  CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA CONSISTENCIA .. 7 
3.3.  OTRA CLASIFICACIÓN ............................................................................................... 7 
Tabla 1. Ejemplos de medios de cultivo usados para el cultivo de bacterias .................... 9 
4.  PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS .......................................................... 12 
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ................................................................ 13 
1.  INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 13 
2.  SIEMBRA Y FORMAS DE REALIZAR LA TRANSFERENCIA ................................................ 13 
2.1.  Cultivo en medio sólido ......................................................................................... 14 
2.2.  Cultivo en medio semisólido (siembra por picadura o punción) ........................... 14 
2.3.  Cultivo en medio líquido ........................................................................................ 15 
3.  TÉCNICAS DE AISLAMIENTO .......................................................................................... 15 
3.1.  Métodos generales ................................................................................................ 15 
3.2.  Métodos Especiales ............................................................................................... 17 
3.3.  Siembra y aislamiento de microorganismos anaerobios ....................................... 18 
TRABAJO EXPERIMENTAL ......................................................................................................... 19 
Objetivos .............................................................................................................................. 19 
1.  Preparación de placas y tubos en condiciones asépticas ............................................. 19 
2.  Siembra de microorganismos ........................................................................................ 20 
3.  Siembra por dispersión en placa y recuento de microorganismos viables .................. 21 
4.  Análisis de resistencia a antibióticos por medio de antibiograma ............................... 22 
CUESTIONARIO ......................................................................................................................... 23 
PROBLEMAS .............................................................................................................................. 24 
 
FARMACIA 

NUTRICION BACTERIANA 
 

1. CONCEPTOS BÁSICOS 
La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias 
químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para 
dos objetivos: 
 fines energéticos (reacciones de mantenimiento)  
 fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo) 
 
La biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía procedente del 
medio  ambiente.  Todo  microorganismo  necesita  para  vivir  una  fuente  de  carbono,  una  fuente  de 
energía  y  un  dador  de  electrones.  Según  de  donde  obtenga  estos  requerimientos,  estos  pueden 
clasificarse en: 
                   
  FUENTE  DENOMINACIÓN  POSIBLE FUENTE 

FUENTE DE  Lumínica  FOTOSINTETIZANTE   


ENERGIA  Química  QUIMIOSINTETIZANTE   
Inorgánico  LITOTRÓFICO  SH2, NH3, NO2‐, Fe 
DADOR DE 
ELECTRONES  Orgánico   ORGANOTRÓFICO  Hidratos  de  carbono,  lípidos,  
hidrocarburos, proteínas, alcoholes 

FUENTE DE  Inorgánico  AUTOTRÓFICO  CO2    


CARBONO  Orgánico   HETEROTRÓFICO   Glucosa, Aminoácidos, Acetato 
 
 Autótrofas estrictas son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica 
como fuente de carbono. 
 Mixotrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litótrofo (obtienen energía 
de  compuestos  inorgánicos),  pero  requieren  sustancias  orgánicas  como  nutrientes  para  su 
metabolismo biosintético. 
Sean  autótrofas  o  heterótrofas,  todas  las  bacterias  necesitan  captar  una  serie  de  elementos 
químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como:  
 macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y  
 micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...) 
En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias orgánicas 
y/o  inorgánicas.  Algunos  de  los  nutrientes  serán  incorporados  para  construir  macromoléculas  y 
estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía, y no se incorporan directamente 
como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles. 
El  mundo  bacteriano,  como  conjunto,  exhibe  una  gigantesca  versatilidad  metabólica  de  uso  de 
nutrientes: desde autótrofos que obtienen su carbono por reducción del CO2 y los demás elementos a 
partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterótrofos capaces de usar amplia gama de fuentes 
orgánicas de carbono. 

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A su vez, dentro de los heterótrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutrición distintos, desde 
bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de carbono y energía, hasta los 
muy  versátiles  Pseudomonas,  que  pueden  recurrir  a  degradar  más  de  100  tipos  de  fuentes  de  C, 
incluyendo sustancias tan "exóticas" como hidrocarburos alifáticos y cíclicos. De cualquier modo, entre 
los heterótrofos, una de las fuentes más típicas de carbono es la glucosa.  
En los heterótrofos‐organótrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy distinto 
del material celular ‐CH2O‐) entran simultáneamente a: 
 metabolismo energético (donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con 
otras sustancias no totalmente oxidadas);  
 metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular). 
Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las bacterias 
que  pueden  nutrirse  solamente  de  sustancias  inorgánicas  sencillas  (H2O,  CO2,  N2,  NO3‐,  NH3,  SO4=, 
fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy interesantes. De hecho, existen 
tipos metabólicos que sólo han evolucionado en procariotas. Como paradigma de esto citaremos los 
microorganismos quimioautótrofos (o quimiolitoautótrofos): obtienen su energía de la oxidación de 
sustancias inorgánicas sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a partir de sales 
inorgánicas, por lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales. Lo habitual, sin embargo, es que 
muchas  bacterias  recurran,  siempre  que  puedan,  a  tomar  del  medio  ciertos  compuestos  más 
complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas. 
 

2. CLASES DE NUTRIENTES 
Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías: 
2.1. Nutrientes Universales 
Agua: Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden 
considerar  como  organismos  acuáticos.  Requieren  cierto  grado  de  humedad  para  crecer.  Desde  el 
punto de vista de sus posibles papeles, el agua es: 
 el principal constituyente del protoplasto bacteriano;  
   el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;  
   un  reactante  en  exceso  (es  decir,  un  producto  resultante  de  algunas  reacciones 
bioquímicas). 
Las fuentes de agua pueden ser: 
 endógena: procedente de procesos de óxido‐reducción;  
 exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las membranas. 
 
Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria: 
 Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben, de modo más o menos 
intenso, moléculas de agua, dejándolas inasequibles a la bacteria.  
 Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas de H2O 
que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo. 
 
CO2: El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias: 
 Las autótrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente 
de  energía  la  luz  (en  el  caso  de  las  fotoautótrofas)  u  oxidaciones  de  determinadas  sustancias 
inorgánicas (los quimioautolitótrofos).  

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 Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones 
procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía: 
CO2 + 4H2 ‐‐‐‐‐‐‐‐‐> CH4 + 2H2O        (ΔG'0<0) 
 Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de 
electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas rutas 
anabólicas y catabólicas. 
El origen del CO2 puede ser: 
 endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente 
orgánica de carbono;  
 exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas. 
Normalmente,  las  bacterias  crecen  a  la  concentración  de  CO2  atmosférico  (0.03%),  pero  algunas 
bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aislan por primera vez, requieren atmósferas enriquecidas, 
con 5‐10% de CO2. Ello parece deberse a que poseen alguna enzima con baja afinidad hacia el dióxido 
de carbono; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen adaptarse a crecer a tensiones normales. 

Fósforo: Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánicos o inorgánicos. Las bacterias que pueden 
usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, 
ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados 
por fosfatasas extracelulares o (en las Gram‐negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina). El 
fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece 
también en coenzimas y en proteínas. 

Sales minerales: Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl‐) y de cationes para la célula. 
Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++, 
Ca++, Fe++. 
El ión potasio (K+):  
   interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan en la
síntesis de proteínas.  
   en Gram‐positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared. 
El ión magnesio (Mg++): 
   estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos;  
   como  cofactor  en  muchas  reacciones,  especialmente  las  que  implican  transferencia  de 
grupos  fosfato.  Por  ejemplo,  en  las  reacciones  que  requieren  ATP,  el  Mg++  puede  unir  la 
enzima al sustrato durante el mecanismo de acción de la misma.  
   Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas. 

El ión calcio (Ca++): 
   es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas. 
El hierro  
Principalmente  como  ión  ferroso,  Fe++,  suele  estar  complejado  en  la  naturaleza,  formando  sales 
insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas, denominadas sideróforos, capaces de 
captar ese hierro (p.ej., enterobactina). 
 
 

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El hierro: 
   participa  en  muchas  moléculas  implicadas  en  procesos  de  respiración,  como  citocromos  y
ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe‐S);  
   interviene como cofactor en ciertas enzimas. 
Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan 
minúsculas  cantidades  de  otros  elementos  (oligoelementos),  a  los  que  también  se  denomina  como 
micronutrientes o elementos traza. 
   El manganeso (Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al Mg++.  
   El  cobalto  (Co++)  se  requiere  casi  exclusivamente  para  la  vitamina  B12  (de  hecho,  si
suministramos esta vitamina al medio, la bacteria se vuelve independiente del Co++ libre).  
   El  zinc  interviene  en  la  estabilización  de  complejos  enzimáticos  como  las  ADN‐  y  ARN‐
polimerasas.  
   El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la asimilación de
nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el complejo nitrogenasa de
las bacterias fijadoras de N2 atmosférico.  
   El níquel participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2. 
 
2.2. Nutrientes Particulares 
Se  trata  de  elementos  que  pueden  ser  cubiertos  de  modo  muy  distinto,  dependiendo  del  tipo  de 
bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren todos los seres vivos) 
pueden  ser  captados  por  las  bacterias  de  modos  muy  distintos,  dependiendo  de  sus  capacidades 
biosintéticas. 
Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido: 
   el radical ‐NH2 forma parte de los aminoácidos (que a su vez son los sillares de las proteínas) 
y de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucleicos y en algunas coenzimas);
   el radical ‐SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA. 
La  mayoría  de  bacterias  fotosintéticas  y  muchas  heterótrofas  asimilan  estos  elementos  en  forma 
combinada inorgánica oxidada: 
 como  NO3‐,  merced  a  la  actuación  secuencial  de  nitrato‐reductasas  y  nitrito‐reductasas
asimilatorias.  

 como  SO4=.  Este  sulfato  se  activa  con  ATP,  y  luego  se  reduce  hasta  sulfito  y  finalmente
sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la incorporación del S. 
Muchas bacterias heterótrofas pueden usar alguna forma reducida: 
   de N inorgánico: amonio (NH4+)  
   de S inorgánico: sulfuros (S=, SH‐)  
   de N orgánico: aminoácidos, péptidos  
   de S orgánico: cisteína. 
Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno también pueden 
usar nitratos. 

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Factores de crecimiento 
Los  factores  de  crecimiento  son  moléculas  orgánicas  específicas  que,  en  muy  pequeña  cantidad, 
algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica (no son sillares 
de  macromoléculas)  ni  sirven  como  fuente  de  energía.  Suelen  ser  coenzimas  o  sus  precursores, 
vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por sí mismas, al carecer de parte o toda 
de una ruta biosintética. 
Ejemplos: 
   las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus medios de
cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico.  
   Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín‐nucleótidos. 
 
En  la  siguiente  tabla  se  muestran  algunas  de  las  vitaminas  y  cofactores  requeridos  por  algunas 
bacterias: 
Factor o vitamina  Funciones principales 
p‐aminobenzoico (PABA)  Precursor del ácido fólico 
Acido fólico  Metabolismo  de  compuestos  C1,  transferencia  de 
grupos metilo. 
Biotina  Biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2 
Cobalamina (vitamina B12)  Reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis de 
desoxirribosa 
Niacina (ácido nicotínico)  Precursor  del  NAD;  transferencia  de  electrones  en 
reacciones redox 
Riboflavina  Precursor de FAD y FMN  
Ácido pantoténico  Precursor de la CoA 
Tiamina (vitamina B1)  Descarboxilaciones; transcetolasas. 
Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina)  Transformaciones de aminoácidos y cetoácidos 
Grupo Vitamina K, quinonas  Transportadores  de  electrones  (ubiquinonas, 
menaquinonas, etc.) 
 

3. MEDIOS DE CULTIVO 
El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. 
Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos requerimientos de 
macro‐ y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que cada nutriente es captado 
puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa de cada nutriente. Los 
microbiólogos,  en  su  trabajo  cotidiano,  están  acostumbrados  a  manejar  multitud  de  "recetas"  o 
fórmulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo. Un medio de cultivo es una solución 
acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel) en la que están presentes 
todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). 
 
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: 
a) de acuerdo a su composición : 
 Complejos o indefinidos 
 Sintéticos o definidos 

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b) de acuerdo a su consistencia : 
 Sólidos 
 Semisólidos 
 Líquidos 
 
Otra clasificación adicional permite caracterizarlos como: 
 Selectivos / No selectivos 
 Diferenciales / No diferenciales 
 
 
3.1. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA COMPOSICIÓN 

Medios complejos o indefinidos 
Su composición química exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos 
de materiales naturales complejos: Ejemplos: 
 Extracto de carne: resulta de la extracción de los productos solubles de la carne hervida o macerada 
y luego concentrado hasta la consistencia de una pasta o polvo. Su composición es compleja, 
contiene proteínas, muy pocos aminoácidos libres, bases nitrogenadas y glúcidos.   
 Extractos de levadura: resulta del líquido que contiene el protoplasma de las células lisadas. Se lo 
seca y concentra a consistencia de polvo. Contiene gran cantidad de vitaminas.  
 Peptonas: se denominan peptonas a productos sin identidad química definida, obtenidos a partir de 
la hidrólisis parcial de proteínas. Sometiendo las proteínas a  hidrólisis se llega a las metaproteínas, 
proteosas, peptonas, polipéptidos y finalmente a los aminoácidos. Entre estos distintos compuestos 
no existe una línea neta de demarcación pasándose de unos a otros en forma gradual con la extensión 
del proceso hidrolítico. No todos los productos de hidrólisis son iguales ni utilizados de la misma forma 
por las bacterias. Para algunas bacterias la fuente de obtención de Nitrógeno pueden ser proteínas 
parcialmente hidrolizadas, pero para otras el crecimiento depende o al menos es favorecido por la 
presencia de aminoácidos libres que, por otra parte, si se encuentran en gran cantidad pueden actuar 
como inhibidores del desarrollo. Las peptonas utilizadas normalmente contienen similar composición 
química puesto que se preparan a partir de la misma materia prima y los mismos métodos de digestión 
para elaborarlas. Las peptonas usadas comúnmente son las preparadas por las firmas: White, Parke‐
Davis, Merck, Difco y Microquim. Las más comunes son peptonas a partir de carne o de caseína (de la 
leche).   
Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. Si lo que 
pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal, 
ya  que  su  confección  es  fácil  y  rápida  (basta  pesar  una  cierta  cantidad  del  extracto  desecado, 
suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e 
incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N 
orgánicos,  sales  minerales  y  micronutrientes.  Sin  embargo,  con  ellos  no  podemos  tener  un  control 
nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de los distintos 
nutrientes. 
La presencia de al menos uno de los extractos enumerados es suficiente para clasificar al medio como 
complejo o indefinido. 
 
Medios sintéticos o definidos 
Se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias químicas puras, 
orgánicas y/o inorgánicas. La composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria 
que queramos cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades 

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biosintéticas  será  más  sencillo  que  el  medio  definido  de  otra  bacteria  con  menores  posibilidades 
biosintéticas. 
3.2. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA CONSISTENCIA 
Cualquiera que sea el tipo de medio podemos elaborar tres tipos de "versiones", según su estado físico 
o consistencia: 

• medios líquidos: sin gelificante  

• medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva un coloide en 
estado de gel que solidifica (da consistencia) a esta solución.  

• medios semisólidos: si se agrega una cantidad de coloide en estado de gel menor que la adicionada 
a los medios sólidos. 

El  gelificante  más  usado  es  el  agar‐agar,  extraído  de  algas  rojas  (p.  ej.  Gelidium),  del  cual  existen 
versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido agarosa; 
son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introducción de sustancias 
"contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional 
de la bacteria). El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 
100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias estudiadas, que son mesófilas. En 
general se requiere una concentración mayor a 1% p/v para los medios sólidos y habitualmente 0,3‐
0,7% p/v a los medios semisólidos. 

Para  cultivar  ciertas  bacterias  (sobre  todo  los  quimioautótrofos)  se  suele  recurrir  a  un  gelificante 
inorgánico, el silicagel o gel de sílice. 

 
3.3. OTRA CLASIFICACIÓN 

Medios selectivos o no selectivos 
Los  medios  Selectivos  son  aquellos  que  permiten  seleccionar  un  tipo  (o  unos  pocos  tipos)  de 
microorganismos.  En  el  laboratorio  se  emplean  mucho  medios  selectivos  sólidos  que  incorporan 
ciertas  sustancias  que  inhiben  el  crecimiento  de  ciertas  bacterias,  pero  permiten  el  crecimiento  de 
otras.  Medios  que  llevan  violeta  cristal,  por  ejemplo,  inhiben  el  crecimiento  de  bacterias  Gram‐
positivas. 
 
Medios diferenciales o no diferenciales 
Los medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de 
bacterias  en  función  de  su  distinto  comportamiento  respecto  de  algún  nutriente  del  medio.  Ese 
comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora 
presente en el medio. 
Ejemplos:  
 en el medio EMB (eosina‐azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias 
producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por fermentación de la 
fuente de carbono.  
 el medio llamado agar‐sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la 
capacidad (y el tipo) de hemólisis de ciertas bacterias. 

‐ 7 ‐ 
FARMACIA 

 el  medio  de  Kempler  &  McKay  permite  identificar  aquellas  bacterias  capaces  de 
metabolizar citrato. Entre sus componentes posee ferricianuro de potasio y citrato férrico. Cuando las 
bacterias  consumen  el  citrato,  el  hierro  que  queda  libre  reacciona  con  el  ferricianuro  dando  el 
complejo azul de Prusia; luego de 24 o 48 hs de incubación a 30°C las colonias que metabolizan citrato 
adquieren color azul. 
 el medio llamado  caldo tioglicolato  permite  diferenciar microorganismos en base a su 
requerimiento  de  oxígeno.  Contiene  0,075  %  de  agar  para  evitar  que  las  corrientes  de  convección 
transporten el oxígeno de la superficie a toda la masa del caldo. El ácido tioglicólico actúa como agente 
reductor, disminuyendo el potencial de óxido‐reducción del medio. La presencia de una importante 
variedad de nutrientes (caseína, extractos de levadura y carne, vitaminas, etc.) en el medio permite el 
desarrollo de la mayor parte de las bacterias. Hay distintas fórmulas modificadas en las que se han 
incluido otros componentes: un indicador de óxido‐reducción (Resazurina) el cual vira a rojo ante el 
eventual aumento del contenido en oxígeno, Glucosa, Vitamina K1 y Hemina. El crecimiento en los 
tubos se distingue por la presencia de turbidez a distintas profundidades: se observa que las bacterias 
estrictamente  aerobias,  crecen  en  la  parte  superior,  mientras  que  las  anaerobias  facultativas  o 
anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio. 
A continuación, puede observarse el comportamiento 
de los distintos microorganismos con distinta tolerancia 
 o dependencia del oxígeno.  
 
1. Aerobios estrictos 
2. Anaerobios estrictos 
3. Facultativos 
4. Anaerobios aerotolerantes 
5. Microaerófilos 

 
Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales, por ej., el agar de MacConkey. 
Se  trata  de  un  medio  de  color  rosado  y  transparente,  que  posee,  entre  otras  sustancias,  lactosa, 
peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal.  
Este  medio  es  selectivo  contra  muchas  bacterias  Gram‐positivas  debido  a  la  inhibición  del 
violeta  cristal  y  a  las  sales  biliares,  que  contraseleccionan  también  a  algunas  gram  negativas  a 
excepción  de  las  enterobacterias.  Las  sales  biliares  son  agentes  tensioactivos  que  desorganizan 
membranas,  sin  embargo,  las  Enterobacterias  están  evolutivamente  adaptadas  a  soportar  sales 
biliares en su hábitat natural (el intestino de vertebrados superiores) y pueden crecer en este medio.  
En  su  faceta  de  medio  diferencial,  el  agar  MacConkey  permite  visualizar  dos  tipos  de 
Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos. Las bacterias 
fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca 
que sus colonias y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro; 
además,  se  forma  un  halo  turbio  a  cierta  distancia  de  estas  colonias,  fenómeno  ocasionado  por  la 
precipitación de las sales biliares inducida por la acidez. En cambio, las bacterias Lac‐, al no poder usar 
la lactosa, recurren como fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto 
carbonado, excretando iones NH4+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el 
indicador rojo neutro vira a amarillo. 

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FARMACIA 

Tabla 1. Ejemplos de medios de cultivo usados para el cultivo de bacterias 

MEDIO  TIPO  INDICADOR/REACTIVO  INHIBIDOR  TEORIA  EJEMPLOS 


Diferencial ‐ Selectivo. 
1. Rojo Neutral absorbido  Sales biliares y verde  Fermentadores de lactosa: producen  Salmonella, Shigella: colonias transparentes 
Aislamiento de bacilos 
por sales biliares  brillante‐inhiben a Gram  ácidos ‐ el pH ácido hace cambiar el  Lac‐.   
Gram negativos y en 
precipitadas, indicando  (+), la mayoría de las  color del indicador y provoca la 
particular patógenos  Proteus y Salmonella thyphimurium: colonias 
fermentación de lactosa.  coliformes y Proteus spp.  precipitación de las sales biliares que 
entéricos (Salmonella y  transparentes con centro negro (productora 
absorben el rojo neutro ‐ las colonias 
Shigella) a partir de  Acido=Rojo                             de SH2 ‐ formación FeS). 
crecen rojas. 
heces, alimentos y  Alkali=Ambar               
E. coli: colonias pequeñas,  rojas o rosadas si 
SS  otros materiales en los  rango de pH: 6,8 – 8,0  No fermentadores de lactosa: no 
fermentan lactosa (Lac+). 
cuales se sospeche su  cambia el pH del medio ‐ sin cambios 
2. Citrato férrico ‐ indica 
presencia.   en el indicador ‐ las colonias no se 
producción de H2S  a 
colorean. 
Permite distinguir  partir de tiosulfato‐ 
fermentadores de  precipitado negro de FeS.
lactosa y productores 
de H2S. 
Diferencial – Selectivo  Rojo Neutral absorbido  1. Cristal Violeta contra        Igual que SS, excepto coliformes que  E. coli: rojas o rosas con halo turbio (Lac+) o 
Aislamiento de bacilos  por sales biliares  Gram (+)  no son inhibidas y muestran buen  transparentes (Lac‐). 
Gram negativos y en  precipitadas, indicando  crecimiento. 
2. Sales biliares contra Gram  Enterobacter aerogenes: rosas (Lac+) y 
particular patógenos  fermentación de lactosa. 
(+) y algunos Gram (‐).   mucosas. 
entéricos a partir de 
Mac Conkey  muestras clínicas, agua  Acido=Rojo                            
Permite aislar  Staphylococcus aureus: muy inhibidas. 
Alkali=Ambar                     
o alimentos.   enterobacterias. 
rango de pH: 6,8 – 8,0  Salmonella, Shigella, Pseudomonas: colonias 
Permite diferenciar    transparentes (Lac‐).  
fermentadores de 
lactosa 
Diferencial – Selectivo  Azul Tripan es adsorbido  Violeta Cristal inhibe Gram  Violeta cristal y telurito inhiben la  Streptococcus mitis: colonias azules y 
para el aislamiento de  por las colonias  (+) excepto streptococos y  mayoría de los organismos presentes  pequeña (0,2 mm). 
Mitis‐
estreptococos y  produciendo color azul.  enterococos.  en materia fecal, para el aislamiento 
Salivarus  S. salivaris: colonias azules de mayor tamaño 
enterococos de la  y testeo de streptococos y 
Agar  Telurito contra Gram (‐)  (1‐5 mm) 
cavidad oral o  enterococos. 
 

‐ 9 ‐ 
FARMACIA 

intestinal u otras  Enterococcus: Colonias brillantes azul oscuro 
muestras  o negras, 1‐2 mm de diámetro. 

Selectivo‐Diferencial  Yema de huevo‐actividad  Telurito contra Gram(‐)  El Piruvato estimula el crecimiento S.  Staphylococcus: colonias negras, brillantes y 


para el aislamiento de  lecitinasa y lipasa  aureus y la yema de huevo sirve para  pequeñas debido a la reducción del telurito. 
Glicina: selectivo para cepas 
Baird‐Parker  estafilococos coagulasa  indicar la producción de lecitinasas y  Halo transparente alrededor si son coagulasa 
coagulasas (+) de S. aureus. 
Agar  (+) en alimentos,  lipasas. Estas actividades generan un  (+) 
muestras ambientales  Cloruro de Litio contra  halo transparente o ligeramente 
Cualquier otro organismo tienen su 
y clínicas  Gram  (‐)  opaco alrededor de la colonia. 
crecimiento inhibido o no crecen. 

Diferencial‐Selectivo  Rojo Fenol usado para la  7,5 % de NaCl inhibición  Fermentadores de Manitol: producen  S. aureus: colonias amarillas y anillo amarillo 


para el aislamiento de  indicacion de  parcial o completa de otros  ácido de modo que el indicador  alrededor de la colonia (fermentadores de 
estafilococos a partir  Fermentación de  microorganismos,  cambia a Amarillo.  manitol) 
de muestras clínicas o  Manitol.  especialmente Gram (‐) 
No Fermentadores de Manitol: no  S. epidermis: ningún cambio en el medio. Las 
Mannitol  muestras sospechosas 
Acido=Amarillo                      producen ácido, no produciéndose  colonias se observan rojas. 
Salt Agar  de contaminación 
Alkali=Rojo                   cambio de color en el indicador. 
rango de pH: 6,8 – 8,4 
Generalmente Manitol (+) son 
  fermentadores y Manitol (‐) son no 
fermentadores. 

Diferencial‐Selectivo  1. Azul de Metileno  Azul de Metileno y eosina  Fermentadores de lactosa: producen  E. coli: colonias negro azuladas con brillo 


para la detección y  inhiben desarrollo de Gram  ácido y cambia el indicador.  metálico 
2. Eosina 
Eosin‐ aislamiento de  (+). 
No Fermentadores de lactosa: no  E. aerógenes: colonias mucoides con centro 
Methylene  enterobacterias,  Ambos indicadores de 
producen ácido.  oscuro. 
Blue (EMB)  particularmente  fermentación de la 
patógenos intestinales.  lactosa y/o sacarosa.  Se agrega Sacarosa para detectar  Salmonella, Shigella y otros Lac‐, producen 
fermentadores de Lactosa lentos.  colonias no coloreadas. 

‐ 10 ‐ 
FARMACIA 

Diferencial para la  1. Citrato férrico ‐ indica    Los ensayos se realizan en tubo.               Salmonella  Shigella  E. coli 


identificación de  producción de H2S  a 
Semi‐sólido para motilidad.  Motilidad   (+)           (‐)            (+) 
enterobacterias  partir de tiosulfato.‐ 
(Salmonella  y  precipitado negro de FeS. H2S + Fe = FeS (ppdo negro)  H2S              (+)           (‐)             (‐)                      
Shigella). Permite ver 
2. Reactivo de Kovac o de  Indol + p‐dimetilamino‐benzaldehido  Indol            (‐)           (‐)             (+)   
movilidad y evidenciar  
SIM  Ehrlich‐se agrega para  (Kovac´s) = Compuesto Rojo 
producción de sulfuro 
detectar producción de 
e indol. 
Indol  a partir de 
triptofano. 
3. Bajo contenido de 
agar‐movilidad 

Diferencial para  1. Fenol rojo indica    Los ensayos en general se realizan en                   pico/fondo – Gas – H2S 


identificación de  fermentación de  tubos en pico de flauta. Organismos 
E. coli                 A/A        (+)      (‐) 
enterobacterias  azúcares.  capaces de fermentar glucosa 
patógenas en base a la  acidifican el medio en el fondo del  P. mirabilis        K/A        (‐)      (+) 
Amarillo = Acida            
capacidad de  tubo (amarillo, A). El medio 
Rojo = Alcali  S. flexneri           K/A       (‐)       (‐) 
fermentar glucosa,  permanece rojo si no hay 
lactosa y/o sacarosa y  2. Sulfato de hierro y  fermentación (alcalino, K). La  P. auriginosa     K/K       (‐)       (‐) 
de producir H2S y gas  amonio‐ indica  fermentación de lactosa o sacarosa 
Triple Sugar  S. typhimurium K/A       (‐)      (+) 
producción de H2S  a  en mayor cantidad acidifica el medio 
Iron (TSI) 
partir de tiosulfato.  en toda la superficie. Si aparece 
rotura o desplazamiento del medio, 
la bacteria produce gas.  
La producción de H2S  se produce a 
pH neutro o alcalino, ya que el pH 
ácido inhibe la reacción: 
H2S + FeSO4 = FeS (ppdo negro) 
 

‐ 11 ‐ 
FARMACIA 

4. PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS  
 
Algunas especies  bacterianas son  capaces  de  producir  metabolitos secundarios. Estos  compuestos 
poseen un amplio rango de estructuras químicas y actividades biológicas, aunque no son esenciales para 
el crecimiento. Las funciones biológicas que pueden cumplir son: agentes de defensa competitiva contra 
otras  bacterias,  hongos,  insectos  y  animales  superiores,  agentes  de  transporte  de  metales,  hormonas 
sexuales y efectoras de diferenciación, entre  otras.  Algunos de  estos  compuestos son coloreados y se 
pueden distinguir fácilmente en el medio de cultivo. 
Serratia  marcescens  es  una  bacteria  Gram  negativa,  facultativa,  baciliforme,  de  la  familia 
Enterobacteriaceae, que produce un metabolito secundario característico de color rojo, la prodigiosina.  
El  género  Gram positivo  Streptomyces también  es  un  gran  productor  de  metabolitos secundarios. 
Dentro  de  este  género  la  especie  bacteriana  S.  coelicolor  produce  dos  compuestos  coloreados 
característicos que presentan actividad antibiótica, la actinorhodina, que es de color azul y se libera al 
medio extracelular y la undecilprodigiosina, que es rojo y permanece anclado a la membrana celular. 
 

‐ 12 ‐ 
FARMACIA 

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 
 
1. INTRODUCCIÓN 
En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados 
en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es 
necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. 
Un  cultivo  axénico  o  puro  es  aquel  que  contiene  un  sólo  tipo  de  microorganismo  y  que  procede 
generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células 
fácilmente visible que recibe el nombre de colonia. 
Para  obtener  cultivos  puros  a  partir  de  una  población  microbiana  mixta,  se  utilizan  las 
denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister 
utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es 
decir, de microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los 
medios  sólidos,  complementados  con  agar,  y  las  placas  de  Petri  en  Bacteriología,  permitiendo  así  la 
separación física de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El 
aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. 
 
2. SIEMBRA Y FORMAS DE REALIZAR LA TRANSFERENCIA 
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio 
adecuado,  con  el  fin  de  iniciar  un  cultivo  microbiano.  Para  sembrar  en  microbiología  es  necesario 
mantener la habitación sin corrientes de aire, estar al lado de la llama de un mechero (no más de 15 cm. 
de distancia). También se puede trabajar bajo campana, o en flujo laminar, previa esterilización con luz 
UV.  
 

El ansa se toma del


mango como si
fuera un lápiz

 
Luego  de  sembrado,  el  medio  de  cultivo  se  incuba  a  una  temperatura  adecuada  para  el 
crecimiento. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, ansa, 
hisopo o pipeta estéril.  
 
a) Medio líquido a medio líquido: pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo. 
b) Medio líquido a medio sólido: pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo, e hisopo. 

‐ 13 ‐ 
FARMACIA 

c) Medio sólido a medio sólido: ansa o hilo (en el primer caso por estrías, en el segundo por punción). 
d) Medio sólido a medio líquido: ansa o hilo. 
 
2.1. Cultivo en medio sólido 
TUBOS CON AGAR INCLINADO (Pico de flauta) 
Para sembrarlos, se mueve el ansa o el hilo suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento 
en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar. Se observará el aspecto 
general del medio y la aparición de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo 
de microorganismos aerobios o facultativos y además se utiliza para almacenar cultivos durante cortos 
períodos de tiempo a temperaturas de 4oC, o para la amplificación de un inóculo pequeño. 
 
SIEMBRA EN PLACAS 
Puede ser en superficie (utilizando espátula de Drigalski, ansa o hisopo) o por mezcla (el inóculo con el 
medio de cultivo agarizado aún fundido, a temperatura de unos 45oC, se mezclan y se vierte en la placa 
de Petri, como se explica en detalle más adelante). 
Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede provocar 
condensación durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento 
confluente. En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas 
se puede utilizar, no solo  para cultivar  microorganismos, sino  además para  contar  y  aislar.  En  general 
cuando  se  quieren  tener  colonias  aisladas  a  partir  de  un  material  determinado,  es  necesario  diluir  la 
muestra en tubos con suero fisiológico estéril.  
 
2.2. Cultivo en medio semisólido (siembra por picadura o punción) 
Se utilizan tubos sin inclinar. Este tipo de medio contiene una proporción menor de agar que los 
medios sólidos, y la siembra se lleva a cabo con un ansa en hilo previamente esterilizada con el mechero. 
El  medio  queda  inoculado  al  introducir  el  hilo  en  profundidad  hasta  el  fondo  del  tubo,  retirándolo 
posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura.  
 

 
En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer 
caso  se  observará  que  el  crecimiento  difunde  alrededor  de  la  zona  donde  se  hizo  la  picadura, 
detectándose turbidez. Los microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de la  picadura. 
Una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de crecimiento que 
se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana.  
Este  tipo  de  siembra  en  picadura  sirve,  también,  como  otro  de  método  de  conservación  de 

‐ 14 ‐ 
FARMACIA 

microorganismos facultativos. 
 
2.3. Cultivo en medio líquido 
Habitualmente se realiza en tubos o frascos o erlenmeyers. En estos casos, las bocas de los tubos, 
erlenmeyers y frascos deben pasarse por la llama (flameado), destaparlos, sembrar con ansa flameada y 
enfriada,  y  luego  volverlos  a  tapar,  siempre  cerca  del  mechero.  El  flameado  genera  corrientes  de 
convección  que  previenen  que  los  contaminantes  del  aire  caigan  dentro  de  los  recipientes.  El 
calentamiento  puede  también  matar  los  microorganismos  que  se  encuentren  en  la  boca  de  los 
recipientes. 
En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto no sirven como técnica 
de  aislamiento.  La  utilización  de  medios  de  cultivo  líquidos  permite  la  obtención  de  una  población 
microbiana grande, con un elevado número de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. En 
estos cultivos se examinará la existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la formación de una 
película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento en el fondo del tubo, etc.  
 
3. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO 
Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población que contiene varios tipos. 
En hábitats naturales raramente encontramos un solo tipo de microorganismo en una muestra, por lo 
tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos 
de  microorganismos  presentes.  El  objetivo  del  aislamiento  es  obtener  colonias  bien  separadas  (las 
colonias  se  forman  a  partir  de  una  sola  “unidad  formadora  de  colonias”)  de  las  que  se  conseguirá  un 
cultivo puro. Una vez obtenidos los cultivos puros se podrán estudiar las características macroscópicas, 
microscópicas, fisiológicas, etc. en un microorganismo en particular. Hay que tener en cuenta que siempre 
el aislamiento se da en un medio sólido. El medio líquido sirve para enriquecer, pero no para aislar.  
El  aislamiento  se  puede  lograr  directamente  a  partir  de  una  muestra  cuando  el  o  los 
microorganismos están en una proporción adecuada. Cuando el microorganismo que se desea aislar e 
identificar se encuentra en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se 
lleva  a  cabo  un  procedimiento  que  involucra  una  primera  etapa  de  aumento  del  número  de 
microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la población (enriquecimiento). Luego 
se aisla por el método de estrías o por dilución y se identifica.  
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:  
A) Métodos generales 
      1‐.Por diseminación en superficie (agotamiento de ansa, depósito y posterior quemado y dilución) 
      2‐ Por mezcla. 
B)  Métodos  especiales  (calentamiento,  agregado  de  álcali  o  ácido,  por  temperatura  de  incubación, 
cambios  en  el  pH  y  presencia  de  sales  o  colorantes).  Estos  métodos  sirven  cuando  se  desea  aislar  un 
microorganismo que posea una característica especial (resistente al calor, anaerobio, etc) 
 
3.1. Métodos generales 
Por diseminación en la superficie de un medio sólido en placa de Petri 
Es la técnica más utilizada. Con un ansa de siembra, calentada al rojo vivo en el mechero y enfriada 
cerca del mismo, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre la superficie 
de la placa con el medio agarizado, pero sin hacer presión para no dañar el agar. Se lleva la placa a incubar 
a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida lo que evitará que el agua de condensación se 
deposite  sobre  la  superficie  del  medio,  dificultando  la  obtención  de  colonias  aisladas.  Mediante  estas 
técnicas  se  obtienen  colonias  aisladas  a  partir  de  una  muestra  que  contenga  un  elevado  número  de 
bacterias. 

‐ 15 ‐ 
FARMACIA 

Existen  distintos  tipos  de  trazados  tendientes  a  lograr  una  buena  separación  entre  los  gérmenes 
sembrados. Se puede sembrar por: 
Agotamiento de ansa: Se flamea el ansa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, 
se realizan estrías en dos placas en forma consecutiva sin recargar el ansa. 
Depósito y posterior quemado: Se carga el ansa con la muestra y las estrías se extienden sobre un área 
pequeña de la superficie de la placa. Se retira el ansa, se quema a la llama, y luego de enfriarla en 
el  interior  de  la  placa  se  hacen  nuevas  estrías  por  otra  zona  tocando  ligeramente  la  muestra 
sembrada anteriormente. Este proceso puede repetirse sucesivamente, flameando y enfriando el 
ansa  al  comienzo  de  las  sucesivas  siembras  en  estría,  de  acuerdo  a  la  carga  inicial  de 
microorganismos. Tras la incubación, se observarán las colonias aisladas en alguna región de la 
placa inoculada, donde se puede estudiar la morfología colonial. 
 

 
Dilución  previa  en  solución  fisiológica  o  caldo:  Se  toma  la  muestra  para  aislar  y  se  la  resuspende  en 
solución fisiológica o caldo nutritivo, preparando luego diluciones decimales en condiciones asépticas. Se 
toman las diluciones y se estría con ellas una placa para cada una. En la dilución adecuada se obtendrán 
colonias aisladas.  
 
Extensión en superficie con espátula de Drigalski: Aquí también pueden prepararse diluciones decimales. 
Se deposita sobre la superficie de la placa una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de 
microorganismos  problema  y  se  extiende  con  ayuda  de  la  espátula,  previamente  esterilizada  por 
flameado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco. 
 

 
 
Depósito y posterior quemado               Extensión en superficie con espátula de Drigalski 

‐ 16 ‐ 
FARMACIA 

Tras el período de incubación las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la 
siembra se ha realizado de forma correcta. Podrán diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamaño, 
forma, color, textura, etc. Esta técnica de siembra, además de permitir el aislamiento de colonias, permite 
el  recuento  de  bacterias  viables  en  la  muestra,  si  conocemos  exactamente  el  volumen  de  muestra 
sembrado. 
                  
 
Por mezcla 
Esta  técnica  tiene  la  ventaja  de  permitir  el  cálculo  del  número  de  bacterias  presentes  en  la 
muestra, si se trabaja con exactitud. En tubos un volumen conocido de distintas diluciones de la muestra, 
inocular  el  medio  de  cultivo  fundido  y  atemperado  aproximadamente  a  45oC.  El  contenido  se 
homogeneiza por rotación del tubo entre las manos, y luego se lo vierte en una placa de Petri. Tras la 
homogeneización,  se  dejan  enfriar  las  placas  hasta  que  se  solidifique  el  medio  y  posteriormente  se 
incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición invertida). 
Otra variación de esta técnica  consiste en depositar en una placa  de Petri  vacía un  pequeño  volumen 
conocido de muestra y a continuación añadir el medio de cultivo fundido y atemperado, mezclando por 
rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán homogéneamente en el 
medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Las colonias aparecen distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que están en la superficie 
tendrán  distintas  características,  dependiendo  del  tipo  microbiano,  mientras  que  las  colonias  que  se 
desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos 
que  formen  las  distintas  colonias  sean  de  distinto  tipo.  Por  tanto,  las  colonias  que  aparecen  en  la 
profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfología. Aunque 
con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza para determinar el número de 
microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son  facultativos o microaerófilos. 
 
3.2. Métodos Especiales 
Se basan en las características del germen que se quiere aislar. Hay que tener en cuenta que puede 
haber gérmenes que poseen idénticos comportamientos frente a un mismo agente físico o químico. 
 
i) Calentamiento: Se utiliza para el aislamiento de gérmenes esporulados de los no esporulados. Consiste 
en calentar la suspensión a 100oC durante 10 min. y 85oC durante 15 o 30 min. Luego se siembra en medios 
sólidos. 

‐ 17 ‐ 
FARMACIA 

ii) Agregado de álcali o ácido: Tratamiento de la muestra con algunos de estos agentes ya que existen 
microorganismos que los resisten y otros que no. 
iii) Variaciones de la temperatura de incubación: incubando a dos temperaturas distintas 
iv) Cambios en el pH: Existen unos pocos gérmenes que pueden crecer en medios con pHs extremos. 
v) Presencia de sales o colorantes: Debido a la capacidad de distintos microorganismos de crecer o no en 
medios con sales, sustratos, colorantes o antibióticos, se utilizan distintos medios de cultivo con el fin de 
lograr su aislamiento. 
 
3.3. Siembra y aislamiento de microorganismos anaerobios 
Para aislar microorganismos anaerobios que son rápidamente destruidos por el contacto con el 
oxígeno,  una  vez  que  la  muestra  ingresa  al  laboratorio  debe  ser  procesada  evitando  su  exposición  al 
oxígeno atmosférico. Los medios de cultivo sólidos deben ser preparados inmediatamente antes de ser 
usadas para evitar una posterior difusión de oxígeno al medio. Por el mismo motivo, los medios líquidos 
deben ser regenerados por calentamiento a baño maría durante 10 min. 
Los medios de cultivo que se utilizan contienen agentes reductores (convierten el O2 en H2O) como 
por ejemplo la cisteína, glutatión, tioglicolato. Algunos son tapados con agentes semisólidos (una capa de 
vaselina‐parafina o agar al 0,5%) para evitar el acceso de aire. Otros medios contienen trozos de tejidos, 
lo que da una atmósfera reducida. 

Métodos para incubar en anaerobiosis 
Puede  recurrirse  al  uso  de  tubos  con  pirogalol  o  velas, 
pero más frecuentemente suelen usarse jarras anaerobias de las 
cuales  existen  varios  tipos  (Brewer,  Torbal,  Gas  Pack,  etc.). 
Generalmente todas ellas se basan en el mismo principio que es 
extraer el oxígeno o,  mejor  dicho,  consumirlo. El  material  de la 
jarra  suele  ser  plástico,  vidrio  o  metal.  Tiene  además,  una  tapa 
que asegura el cierre hermético. 
La  generación  de  hidrógeno  permite  la  reducción  del 
oxígeno  y  da  lugar  a  la  formación  de  agua.  Se  utiliza  el  paladio 
como  catalizador,  el  cual  es  inactivado  con  el  ácido  sulfhídrico, 
exceso de humedad y otros productos metabólicos volátiles de las 
bacterias. Al catalizador se lo puede reactivar  en horno de calor 
seco a 160‐170 °C durante dos horas. 
Como  indicador  de  óxido‐reducción  suelen  utilizarse  tiras  de 
papel embebidas con azul de metileno, las cuales son incoloras en 
estado reducido o azuladas cuando están oxidadas. 
 
Generadores de mezclas gaseosas: 
Sobres  comerciales  de  Gas  Pack:  son  de  aluminio  y  contienen  dos  tabletas:  a)  Ácido  cítrico  y 
bicarbonato de sodio y b) borhidruro de sodio. 
Al hidratarse el sobre, la primera tableta libera CO2 y la segunda H2. Si la jarra funciona bien al cabo de 
una hora existe menos del 1% de O2 
 
 
 
 
 

‐ 18 ‐ 
FARMACIA 

TRABAJO EXPERIMENTAL 
Objetivos 
 Aprender las técnicas básicas que se utilizan para la siembra y el cultivo de microorganismos. 
 Ejercitarse en las técnicas de aislamiento de microrganismos a partir de muestras complejas. 
 Familiarizarse con el fundamento y la utilización de distintos medios de cultivo, incluyendo medios 
de cultivos selectivos y/o diferenciales 

1. Preparación de placas y tubos en condiciones asépticas 
La asepsia se refiere a la exclusión continua de microorganismos no deseados. Un requisito fundamental 
en el laboratorio de microbiología es trabajar con cultivos puros, para lo cual es primordial el manejo de 
técnicas asépticas de manera de asegurar que durante la manipulación de los mismos no se permite el 
ingreso de microorganismos contaminantes al cultivo. 
 
Utilización de medios sólidos y semisólidos  
Fundir en el microondas el medio de cultivo que ha sido esterilizado previamente en un frasco y, una 
vez  atemperado  (aproximadamente  45oC),  homogeneizar  y  verterlo  en  placas  o  tubos  estériles  en  la 
proximidad  de  la  llama  de  un  mechero  o  una  campana  de  flujo  laminar.  Si  se  han  de  incorporar 
compuestos termolábiles al medio ‐como vitaminas o antibióticos‐ éstos se esterilizarán por filtración y 
se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado y atemperado.  
 
Práctica 
Preparar los siguientes materiales:  
1. Una placa de LB Agar (LBA) por alumno. Volcar en condiciones de esterilidad 20 ml de LBA sobre la 
base de una  placa de Petri vacía. Tapar y dejar solidificar sobre la mesada. 
2. Una placa de Agar Mac Conkey por grupo. Volcar en condiciones de esterilidad 20 ml de Agar Mac 
Conkey sobre la base de una placa de Petri vacía. Tapar y dejar solidificar sobre la mesada. 
Una vez solidificadas, poner a secar con la tapa entreabierta en el flujo laminar o estufa a 42oC. 
3. Preparar un tubo con LBA en pico de flauta. Colocar aproximadamente 4 ml de medio LBA fundido 
en un tubo de hemolisis estéril por grupo. Tapar y dejar inclinado sobre un soporte (pico de flauta). 
4. Preparar un tubo con medio SIM. Colocar aproximadamente 4 ml de medio SIM fundido a un tubo 
de hemolisis estéril por grupo. Tapar y dejar en posición vertical. 
5. Preparar  un  tubo  con  caldo  Tioglicolato  por  grupo.  Calentar  el  medio  de  cultivo  previamente 
esterilizado  en  microondas  para  eliminar  el  oxígeno  residual.  Transvasar  en  las  cercanías  del 
mechero aprox. 10 mL caldo Tioglicolato a un tubo de ensayo estéril y tapar. 
 
 
Utilización de medios líquidos  
El  medio  líquido  previamente  esterilizado  se  trasvasará  desde  el  frasco  hacia  el  tubo  en  las 
proximidades de la llama de un mechero, utilizando las técnicas descriptas en el Trabajo Práctico 1. Al 
igual  que  con  los  medios  sólidos,  los  compuestos  termolábiles,  como  vitaminas  o  antibióticos,  se 
esterilizarán por filtración en forma separada y se añadirán al medio de cultivo luego de la esterilización.  

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FARMACIA 

 
Práctica 
1. Preparar un tubo con LB por grupo. Transvasar en las cercanías del mechero  aprox. 3 mL de LB a 
un tubo de ensayo esteril y tapar. 

2. Siembra de microorganismos 
Siembra por depósito y posterior quemado en placa 
Con  el  objetivo  de  aislar  microorganismos  sobre  una  placa  de  LBA  se  realizará  la  siembra  de  los 
microorganismos provistos por el docente, utilizando la técnica de depósito y posterior quemado (ver la 
figura ilustrativa a continuación).  

a. Depósito inicial  b. Primer estriado  c. Segundo  d. Tercer estriado 


estriado 
Antes de sembrar, es importante observar la dureza del medio y la posición del ansa necesaria para 
no romper la superficie. 
1. Colocar las placas que utilizará con las bases conteniendo el medio de cultivo hacia arriba. 
2. Flamear el ansa y enfriar manteniendo esterilidad.  
3. Levantar la base de la placa de partida conteniendo E. coli o B. subtilis (provista por los docentes) 
y, utilizando el ansa, tomar una colonia aislada en forma estéril. 
4. Realizar el depósito y aislar en la nueva placa de Petri mediante la técnica de depósito y posterior 
quemado siguiendo básicamente el procedimiento ilustrado en la figura y las instrucciones del 
docente.  
5. Tapar y flamear el ansa al terminar de sembrar.  
6. Incubar la nueva placa de Petri a 37°C (invertida) hasta aparición de colonias. 
 
Utilizando un marcador dividir la base de la placa de Agar McConkey en 3 sectores iguales, en los 
que  se  sembrarán  los  siguientes  microorganismos:  Escherichia  coli  lac+,  Escherichia  coli  lac‐,  Bacillus 
subtilis.  Para  sembrar,  utilizar  básicamente  la  misma  metodología  que  se  describe  más  arriba,  pero 
utilizando un tercio de la superficie de la placa para cada microorganismo. 
 
 
Siembra por punción  
El medio de cultivo SIM se inoculará con distintas especies de microorganismos, utilizando la técnica 
de punción con hilo (ansa recta, ver figura pag. 14). Este medio es semisólido, por lo que se deberá prestar 
especial atención en no romper el medio al momento de la siembra. Para ello se realizará una “punción 
franca”, es decir introducir y sacar el hilo por un mismo punto (ver la figura ilustrativa). 

‐ 20 ‐ 
FARMACIA 

El tubo con LBA en forma de pico de flauta se utiliza normalmente para el almacenaje y manutención 
de cepas de uso corriente en el laboratorio. El mismo se inoculará por punción con hilo y posterior estriado 
sobre la superficie del medio. 
El caldo Tioglicolato se utiliza para observar la relación con el oxígeno de un microorganismo dado 
(aerobio estricto, facultativo, aerotolerante, etc). Por ello, para evitar la difusión de oxígeno dentro del 
mismo, el tubo de ensayo no debe ser agitado ni manipulado con brusquedad. Las muestras bacterianas 
se sembrarán por punción en este medio. 
 
Para realizar la inoculación por punción se procederá en todos los casos como sigue: 
1. Flamear un hilo (ansa recta, ver figura pag. 14). Tener en cuenta que sólo la porción del hilo que 
es flameada y llevada a rojo vivo es la que permanece libre de contaminación. Por ello, para evitar 
el crecimiento de microorganismos no deseados, sólo esta parte del hilo debe ingresar al tubo. 
2. Una  vez  frío,  tomar  una  colonia  aislada  de  la  placa  de  los  microorganismos  (provista  por  los 
docentes) en forma estéril. 
3. Punzar cuidadosamente en el centro del tubo conteniendo el medio de cultivo sin llegar al fondo 
y retirar el hilo cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino de la punción. En el caso 
del tubo de LBA en forma de pico de flauta, al completar la punción, realizar además un estriado 
sobre el resto de la superficie del medio de cultivo. 
4. Tapar el tubo y flamear el hilo. 
5. Incubar a 37°C, en posición vertical hasta observar desarrollo de los microorganismos. 
 
 
Siembra de medio líquido 
Para inocular medio de cultivo líquido que se utilizará para propagación del microorganismo (en este 
caso tubo de ensayo conteniendo LB) se utilizando un ansa.  Tener en cuenta que sólo la porción del ansa 
que es flameada y llevada a rojo vivo es la que permanece libre de contaminación. Por ello, para evitar el 
crecimiento de microorganismos no deseados, sólo esta parte del ansa debe ingresar al tubo de ensayo. 
 
1. Flamear el ansa. 
2. Una  vez  fría,  tomar  una  colonia  aislada  de  la  placa  de  los  microorganismos  (provista  por  los 
docentes) en forma estéril. 
3. Introducir  la  punta  en  el  medio  cultivo  y  mover  hasta  observar  el  desprendimiento  de  los 
microorganismos.  
4. Flamear el ansa. 
5. Incubar tapado a 37°C, con agitación (para permitir la oxigenación homogénea del mismo) y hasta 
observar desarrollo de los microorganismos. 
 

3. Siembra por dispersión en placa y recuento de microorganismos viables 
 
A partir de una muestra suministrada por el docente y utilizando placa de LBA, se procederá de la 
siguiente manera para realizar la siembra por dispersión en placas:  

‐ 21 ‐ 
FARMACIA 

a) A partir de la suspensión bacteriana provista, realizar diluciones seriadas hasta un orden de 10‐7 
en tubos eppendorf estériles. 
b) Sembrar las diluciones 10‐5, 10‐6 y 10‐7 en placas de LBA utilizando espátula de Drigalsky.  
c) Incubar una noche a 37oC, observar y hacer el recuento de colonias en la placa que corresponda. 
 

4. Análisis de resistencia a antibióticos por medio de antibiograma  

Un  antibiograma  es  un  estudio  de  la  sensibilidad  de  un 
microorganismo  ante  distintos  compuestos  antimicrobianos.  Las 
distintas especies y cepas  microbianas presentan  distintos grados  de 
sensibilidad  a  estos  agentes,  de  ahí  que  sea  necesario  hacer  una 
evaluación para poder seleccionar el compuesto más apropiado para el 
tratamiento de una infección bacteriana.  

a) Preparar el inóculo: suspensión del microorganismo al cual se 
le determinará la sensibilidad al antibiótico (Bacillus subtilis JH642 o 
MC530). 
b) Sembrar 100 µl del inóculo de la cepa bacteriana en una placa de LB, utilizando la técnica de 
diseminación en superficie con espátula de Drigalsky.  
c) Agregar a cada disco de papel 5 µl de distintas concentraciones de Cloranfenicol 40 mg/ml, 5 
mg/ml y 2.5 mg/ml, y 10 µl de Kanamicina 10 mg/ml. Luego depositarlos sobre la placa, como se muestra 
en la imagen 
d) Incubar 16 horas a 37oC y observar el desarrollo de crecimiento. 

Durante la incubación el agente difunde desde el papel de filtro al agar: cuanto más se aleja del papel 
menor  es  la  concentración  del  agente.  A  una  cierta  distancia  del  disco  se  alcanza  la  concentración 
inhibitoria mínima (CIM). Pasado ese punto, el microorganismo puede crecer ya que la concentración del 
antimicrobiana no es suficiente para inhibirlo. Se crea por lo tanto una zona de inhibición, y el diámetro 
de esta zona es proporcional a la cantidad de agente antimicrobiano añadida al disco y a la efectividad 
del agente.  

Este  método  se  utiliza  rutinariamente  para  determinar  la  sensibilidad  de  microorganismos  patógenos  
frente  a  distintos  antibióticos,  y  por  ende  determinar  qué  medicamente  suministrar  al  paciente  que 
presenta dicha infección.  

‐ 22 ‐ 
FARMACIA 

CUESTIONARIO 
 
1. Defina medio de cultivo. 
2. Clasifique el metabolismo de la bacteria Bacillus subtilis según la fuente de energía, el dador 
de electrones y la fuente de carbono utilizadas. 
3. ¿Con qué objetivo se utilizan los medios de cultivo sólidos y líquidos en un laboratorio de 
microbiología? 
4. ¿Qué significa que un medio de cultivo sea diferencial? Cite ejemplos 
5. ¿Qué debe poseer un medio de cultivo para ser selectivo? Cite ejemplos 
6. Si un medio es NO selectivo. ¿Esto quiere decir que el medio es diferencial? 
7. ¿Qué diferencia existe entre medios de cultivo complejos y sintéticos? 
8. ¿Qué sucedería si uno agrega los antibióticos al medio de cultivo previo al autoclavado del 
mismo?  
9. ¿Para  qué  se  utiliza  el  medio  de  cultivo  Mac  Conkey?  Clasifíquelo  de  acuerdo  a  su 
composición, selectividad y diferencialidad.  Justifique 
10. Describa  diferentes  modos  de  aislar  un  microorganismo.  ¿Para  qué  es  necesario  obtener 
colonias aisladas?  
11. ¿Qué significa que un microorganismo sea facultativo? 
12. ¿Por  qué  es  necesario  utilizar  una  jarra  de  anaerobiosis  para  cultivar  microorganismos 
anaerobios estrictos? 
13. ¿Qué  diferencia  encuentra  entre  el  metabolismo  de  un  anaerobio  estricto  y  un 
aerotolerante? 
14. ¿Por qué deben realizarse diluciones para realizar el recuento de células viables? 
15. ¿Cuándo se realiza un recuento de células viables, qué es lo que se cuenta y qué es lo que se 
asume? 
16. El antibiograma es una técnica que permite determinar la sensibilidad de un microorganismo 
frente  a  un  agente  antibiótico.  ¿Qué  otra  técnica  podría  utilizar  para  determinar  este 
parámetro? ¿Qué ventajas/desventajas presenta respecto al antibiograma? 
17. En un antibiograma, el antibiótico A genera un halo más grande que el antibiótico B.  ¿Esto 
significa que el microorganismo es más resistente a A que a B?  

‐ 23 ‐ 
FARMACIA 

PROBLEMAS 
 
1. El cloruro de sodio en concentración mayor de 6 % inhibe la mayoría de los gérmenes permitiendo 
el crecimiento de Estafilococos. Dado el siguiente medio de cultivo: 
  Extracto de carne   1 g/l 
  Peptona     10 g/l 
  NaCl      75 g/l 
  D‐Manitol     10 g/l 
  Agar       10 g/l 
  Rojo de fenol     25 mg/l 
  pH 7,4 
 
A‐ ¿Cómo clasificaría este medio? 
B‐ ¿Si hubiera fermentación de azúcar, se produciría algún cambio en el medio? 
 
 
2. Dados los siguientes medios cuya composición se detallan a continuación: 
Medio 1            Medio 2                                           .                                            
Lactosa     5 g/l        Triptona       5 g/l 
Sacarosa                5 g/l                    Extracto de levadura   25 g/l 
K2HPO4    2 g/l        Glucosa     10 g/l 
Eosina     0,4 g/l        Agar       15 g/l 
Azul de metileno 0,065 g/l      pH 7 
Agar     15 g/l       
pH  7,4           
 
A‐ ¿Qué medio usaría para realizar un recuento de microorganismos totales de un lote de pastillas? 
B‐ ¿Qué razones tiene para haber hecho esa elección? 
 
 
3. Sabiendo que el citrato de sodio y el desoxicolato de sodio inhiben el crecimiento de bacterias Gram 
(+) y algunos otros microorganismos, y permite el crecimiento de Salmonella y Shigella. Dado el 
siguiente medio de cultivo: 
 
Peptona      20 g/l 
Glucosa       1 g/l 
D‐Manitol    2 g/l 
Citrato de sodio    5 g/l 
Desoxicolato de sodio  5 g/l 
K2HPO4      4 g/l 
KH2PO4      1,5 g/l 
NaCl      5 g/l 
pH  7,4 
¿Cómo clasificaría a este medio de cultivo? Fundamente su respuesta. 
 
4. Se toma un inóculo de uno de los cultivos puros y se siembra por punción en un tubo que contiene 
medio SIM, cuya composición es: 

‐ 24 ‐ 
FARMACIA 

Peptona de caseína    20,0 g/l 
Peptona de carne     6,6 g/l 
Citrato de amonio y Fe(III)  0,2 g/l 
Tiosulfato de sodio     0,2 g/l 
Agar         3,0 g/l 
 
  El medio SIM es: 
a‐ Sólido y complejo 
b‐ Líquido y sintético 
c‐ Semisólido y complejo 
d‐ Semisólido y sintético 
e‐ Todo lo anterior es cierto 
f‐ Nada de lo anterior es cierto 
 
Luego  de  incubar  a  37°C  durante  12  horas  se  observa  que  el  crecimiento  se  extiende  sobre  toda  la 
superficie del medio, pero no hay crecimiento en la punción. 
De los resultados obtenidos usted puede deducir que se trata de un microorganismo: 
a‐ Anaerobio estricto (movilidad +) 
b‐ Facultativo (movilidad ‐) 
c‐ Aerobio (movilidad +) 
d‐ Todo lo anterior es cierto 
e‐ Nada de lo anterior es cierto 
 
5. El agar TCBS (agar‐tiosulfato‐citrato‐sales biliares‐sacarosa) se utiliza para el aislamiento de Vibrio 
cholerae.  Las  elevadas  concentraciones  de  tiosulfato  y  citrato  inhiben  el  crecimiento  de 
enterobacterias, mientras que la bilis y el colato inhiben a enterococos. 
a‐ Dada la composición del medio, indique como lo clasificaría de  una manera más completa, y 
justifique. 
Peptona de caseína  5 g/l 
Peptona de carne  5 g/l 
Extracto de levadura  5 g/l 
Citrato de sodio    10 g/l 
Tiosulfato de sodio  10 g/l 
Bilis desecada    5 g/l 
Colato de sodio    3 g/l 
Sacarosa     20 g/l 
Cloruro de sodio    10 g/l 
Hierro (III) citrato               1 g/l 
Azul de bromotimol  0,04 g/l 
Azul de timol    0,04 g/l 
Agar‐agar    14 g/l 
 
 
 
 
 
b‐ De  acuerdo  a  los  requerimientos  de  fuente  de  carbono  y  energía,  señale  que  clase  de 
microorganismos podrían cultivarse en el medio TCBS. 

‐ 25 ‐ 
FARMACIA 

1‐ Quimioorganoheterótrofo 
2‐ Quimiolitoheterótrofo 
3‐ Fotoautótrofo 
4‐ Fotoheterótrofo 
5‐ Todo lo anterior es cierto 
6‐ Nada de lo anterior es cierto 
 
 
6. Señale con una cruz qué tipo de medio de cultivo, de acuerdo a su consistencia, utilizaría para los 
siguientes ensayos: 
Líquido   Semisólido  Sólido 
‐ Movilidad determinada       
   macroscópicamente        ...........    ..............  ........... 
 
‐ Obtener cultivos puros      ...........    ..............  ........... 
 
‐  Movilidad determinada     
    microscópicamente        ...........    ..............  ........... 
 
‐  Recuento de células viables      ...........    ..............  ........... 
 
‐ Realizar una curva de crecimiento    ...........    ..............  ........... 
   por D.O. 
 
 
7. Si una cepa de Escherichia coli posee un genotipo met‐ trp‐, dicha cepa: 
a‐ Es auxótrofa para metionina y triptofano 
b‐ Puede cultivarse en un medio de cultivo mínimo al cual se le adicionó metionina y triptofano. 
c‐ Puede cultivarse en medio de cultivo complejo. 
d‐ Es incapaz de sintetizar metionina y triptofano. 
e‐ Todo lo anterior es cierto. 
f‐ Nada de lo anterior es cierto. 
 
 
8. Se desea obtener un cultivo puro de la bacteria Gram positiva Bacillus subtilis a partir de una mezcla 
de microorganismos. ¿Cuál de los siguientes medios utilizaría? 
Medio 1              Medio 2 
    Peptona     20 g/l        extracto de levadura    5 g/l 
    NaCl                  5 g/l        triptona      10 g/l 
    Lactosa    10 g/l        NaCl        5 g/l 
    Sales biliares      1,5 g/l        agar        20 g/l 
    Rojo neutro    0,03 g/l 
    Violeta cristal         0,001 g/l 
    Agar      20 g/l     
 
Justifique su respuesta. Clasifique ambos medios de cultivo. 
9. Dado el siguiente medio de cultivo: 
Hidrocloruro de cisteína     0.1 g/l 

‐ 26 ‐ 
FARMACIA 

Citrato de sodio      0.3g/l 
Dextrosa       0.2 g/l 
Fosfato diácido de potasio  1 g/l 
Extracto de levadura    0.5 g/l 
Cloruro de sodio      5 g/l 
Agar        15 g/l 
Rojo fenol      0,012 g/l 
NH4Cl        1 g/l 
pH        6.9 
 
a. Se trata de un medio sintético, sólido, que permite el crecimiento de bacterias Gram (+) y (‐). 
b. Se trata de un medio sólido, complejo, que permite el crecimiento de bacterias Gram (+). 
c. Es un medio complejo, semisólido, diferencial y selectivo para Gram (+). 
d. Es un medio sólido, diferencial, complejo, que impide el crecimiento de bacterias Gram (+). 
 
 
10. Se desea conocer el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml), de un cultivo 
de Escherichia coli LE392. A partir de dicho cultivo se realizaron tres diluciones 1:100, y una dilución 1:10. 
Se sembraron con espátula de Drigalski 0,1 ml de la tercera y cuarta dilución, por triplicado. En la tercera 
dilución se contaron 50, 55 y 48 colonias, mientras que en la cuarta el recuento arrojó 1, 3 y 3 colonias. 
a‐ ¿Qué significado tiene el término UFC/ml? 
b‐ ¿Cuál de las dos diluciones se usa para calcular el número de UFC/ml? Justifique. 
c‐ Calcule en número de UFC/ml del cultivo original. 
d‐ Este método de cuantificación de microorganismos determina: 
I. número total de microorganismos. 
II. número de microorganismos viables. 
III. número de microorganismos muertos. 

 
11. Se necesita cuantificar la carga bacteriana de un polvo medicinal coloreado hidrosoluble. Para ello 
disuelve 5 g de polvo en 5 ml agua estéril, logrando disolución completa. A partir de la mezcla inicial realiza 
una primera dilución 1/20 y a partir de ella, 4 diluciones seriadas al décimo (1/10) más. Luego inocula, por 
triplicado, 0,2 ml de cada una de las  diluciones al décimo sobre placas conteniendo medio de cultivo. 
Luego de la incubación, los resultados obtenidos fueron: 
 
  Número de colonias 
Seriada 1  520  480  530 
Seriada 2  60  54  62 
Seriada 3  3  6  4 
Seriada 4  0  1  0 
 
a) Calcule el número de UFC/ml en la disolución inicial del polvo ¿Qué esperaría observar si siembra 
la primera dilución, 1:20? Justifique 
b)  De las siguientes opciones seleccione que medio de cultivo utilizaría en las placas. Justifique su 
elección. 
i. sintético, sólido y diferencial 
ii. complejo, sólido y selectivo 

‐ 27 ‐ 
FARMACIA 

iii. complejo y semisólido 
iv. complejo, sólido, selectivo y diferencial 
v. complejo y sólido 
vi. sintético y sólido 
vii. sintético y semisólido 
 
 
12. Ud. cultiva en caldo peptonado una bacteria para la cual la relación con el oxígeno es desconocida. 
Luego de 24 hs a 37 oC, saca el cultivo de la estufa sin agitación y observa que el microorganismo creció 
a todo lo largo del tubo. Ud. concluye que es: 
1. un aerobio obligado 
2. un microaerófilo 
3. un facultativo 
4. un anaerobio obligado. 
        Justifique 
 

‐ 28 ‐