Las bebidas vegetales se preparan utilizando plantas o extractos de plantas como materias primas,

incluidas bebidas a base de hierbas, bebidas de cereales, bebidas fungosas comestibles y bebidas
de algas. Los principales ingredientes de las bebidas vegetales son polifenoles, azúcares y
proteínas, y estos compuestos pueden combinarse para generar complejos inestables, causando
turbidez y precipitación de la bebida (Cerreti et al., 2017; Lin et al., 2007; Park et al. , 2016; Siebert,
2006; Xu et al, 2017). Para evitar turbidez y sedimentos en la bebida y mejorar su transparencia y
estabilidad, es necesario un tratamiento de clarificación. Los métodos actuales de tratamiento de
clarificación incluyen la precipitación natural, la hidrólisis enzimática y la utilización de
clarificadores (Bilal, Asgher, Iqbal, Hu y Zhang, 2017; Feng, Zhang, Ma y Tian, 2009; Kochergin,
Gaudet y Robert, 2011; Ma, Luo & Zeng, 2015; Parish, Herbst-Johnstone, Bouda, Klaere y Fedrizzi,
2017; Sandri, Fontana, Barfknecht y Silveira, 2011). La precipitación natural implica dejar la bebida
a baja temperatura durante un período prolongado, durante el cual las sustancias suspendidas se
sedimentan lentamente sin ninguna ayuda. Este método consume tiempo, energía y costos, por lo
que es ineficiente. La hidrólisis enzimática y la utilización de clarificadores son opciones populares
para la clarificación de bebidas vegetales. La hidrólisis enzimática puede reducir los componentes
en la bebida que tienden a formar precipitados. La utilización de clarificadores se caracteriza por
una operación simple, alta eficiencia y bajo costo. Los clarificadores comúnmente utilizados
incluyen quitosano, quitosano modificado, gelatina, carbón activado y sílice; El quitosano y la
gelatina se consideran naturales y tienen buena biocompatibilidad (Bilal, Asgher, Iqbal, Hu y
Zhang, 2017; Ma, Luo y Zeng, 2015; Parish, Herbst-Johnstone, Bouda, Klaere y Fedrizzi, 2017). Vale
la pena desarrollar nuevos clarificadores naturales para bebidas vegetales

El clarificador hidrolizado de colágeno (CHC) con una gran propiedad de floculación se preparó
mediante la hidrólisis de pepsina en nuestro trabajo previo (Fu et al., 2017). La materia prima de
CHC son las virutas de piel de cerdo (desechos de colágeno) obtenidas del matadero, por lo que es
natural. Además, el CHC preparado por hidrólisis enzimática tiene un pH neutro sin ningún
químico. La pepsina utilizada es de grado alimenticio. Por lo tanto, CHC es lo suficientemente
seguro como para aplicarse en la industria alimentaria. Hay muchos productos de hidrolizado de
colágeno actualmente en el mercado. Por ejemplo, un líquido oral, desarrollado por American
Nature's Bounty Company (Nueva York, EE. UU.), Es un hidrolizado de colágeno con un peso
molecular inferior a 3 kDa y muestra buenos efectos en el cuidado de la piel. También se prepara
usando hidrólisis enzimática. Nuestro trabajo previo ha verificado que el CHC mostró una
excelente propiedad de floculación para el caolín basado en la neutralización de carga y una
capacidad de puente (Fu et al., 2017). Por lo tanto, CHC también puede ser eficaz en la
clarificación de bebidas vegetales a través de la misma acción. La bebida de crisantemo es una
bebida vegetal preparada utilizando la flor de un Crisantemo (Dendranthema morifolium Ramat.
Tzvel) como materia prima a través de los procesos de recolección, secado, corte, extracción,
filtración y esterilización. Tiene un color amarillo brillante, aroma de Crisantemo y un sabor
ligeramente amargo. El crisantemo contiene una variedad de flavonoides, que imparten
bioactividad en la bebida (Tao, Duan, Qian, Qian y Guo, 2016). En este trabajo, se usó una bebida
de crisantemo como una bebida de planta representativa para investigar el rendimiento de
clarificación de CHC. Los efectos de la dosificación de CHC, el pH, la temperatura y la clarificación
Se investigó el tiempo de clarificación de la bebida de Crisantemo y luego se optimizó. Se
analizaron los principales componentes químicos, la calidad sensorial y la estabilidad de
almacenamiento de las bebidas de Crisantemo con y sin clarificación. Finalmente, el

el costo de producción de 78 CHC fue estimado.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales, reactivos e instrumentos

CHC fue preparado en base a nuestro trabajo previo (Fu et al., 2017). Se preparó una bebida de
Crisantemo como se describe en la sección 2.2. El crisantemo y el azúcar en polvo se compraron
en un mercado local en Chengdu, China. La albúmina de suero bovino, azul brillante Coomassie G-
250, reactivo de fenol Folin-Ciocalteu, ácido gálico, glucosa y rutina fueron de grado analítico y se
adquirieron en Sigma Co, Ltd. en Shanghai, China. El etanol y el ácido fosfórico eran de calidad
analítica y se compraron en Kelong Chemical Reagent Company en Chengdu, China. La trehalosa
era de grado alimentario y se compró a Kelong Chemical Reagent Company en Chengdu, China. La
solución azul brillante Coomassie G-250 se preparó mezclando 10 mg de azul brillante Coomassie
G-250, 5 ml de etanol al 90% (v / v) y 10 ml de ácido fosfórico al 85% (v / v) y diluyendo a 100 mL
por agua desionizada. Los instrumentos incluyen un espectrofotómetro UV-Vis (UV-1100, Shanghai
Mapada Instrument Co., Ltd., China), un agitador magnético con un sistema de control de
temperatura (90-3, Shanghai Huxi Analysis Instrument Factory Co., Ltd., China ), un medidor de pH
(PHS-3C, Shanghai INESA Instrument Limited de Share Ltd., China), un

incubadora a prueba de agua (9080, Shanghai Yiheng Technical Co., Ltd., China), un
espectrofotómetro (CM-5, Konica Minolta Co., Ltd., Japón) y un refractómetro de mano (WY-020R,
Chengdu Wanchen Optical Instrument Factory, China).

2.2. Preparación de bebida de Crisantemo

Los principales procesos de producción de una bebida de Crisantemo se enumeran a

continuación.

(1) Corte: el crisantemo se cortó en tiras pequeñas con 0,3 cm de ancho y 1 cm longitud después
de la limpieza y secado a 45 ° C durante 2 hy a 65 ° C durante otras 2 h.

(2) Extracción: se empaquetaron 10 g de tiras de crisantemo y se agregaron a 400 ml agua. La

extracción se llevó a cabo durante 30 minutos a 100 ° C. El líquido extraído era derramó y recogió.
Se agregaron otros 300 mL de agua y la segunda extracción se llevó a cabo durante 20 min a 100 °
C. El líquido extraído de la segunda extracción fue recolectado y mezclado con el de la primera
extracción.

(3) Mezclado: 16 g de trehalosa y 16 g de azúcar en polvo (malla 100) se disolvieron por completo
en 96 mL de agua y se agrega al líquido extraído.

(4) Esterilizado: después del enlatado, la bebida se esterilizó durante 20 minutos a 121 ° C.

2.3. Factores de influencia en la clarificación

2.3.1. Dosificación de CHC

Se añadió un total de 10 ml de bebida de Crisantemo a un cilindro de 10 ml con un tapón a su pH
natural de 5.0. Luego, 2 mg, 4 mg, 6 mg, 8 mg y 10 mg de CHC se agregaron para obtener una
bebida de Chrysanthemum con dosis de CHC de 0.2 g / L, 0.4 g / L, 0.6 g / L, 0.8 g / L y 1.0 g / L,
respectivamente. La bebida sin CHC añadida era usado como control. Las mezclas se fijaron a
temperatura ambiente (30 ° C) y se dejaron reposar por 4 h. Se obtuvo una muestra en la línea de
7 mL del cilindro para detectar la transmitancia (T,%) usando el espectrofotómetro UV-Vis a 700
nm. Una mayor transmitancia indica un mejor efecto de clarificación.

2.3.2. pH

Se ajustaron un total de 10 ml de bebida de crisantemo a pH 4,0, 4,5, 5,0,5.5, 6,0, 6,5 y 7,0
utilizando una solución de HCl 1 mol / L o una disolución de NaOH 1 mol / L. Se añadió CHC y la
dosificación en todas las mezclas fue de 0,6 g / l. Las mezclas se ajustaron a temperatura ambiente
(30 ° C) y se dejaron reposar durante 4 h. Se obtuvo una muestra en la línea de 7 mL del cilindro
para detectar la transmitancia (T,%) mediante un espectrofotómetro UV-Vis a 700 nm.

2.3.3. Temperatura

Un total de 10 ml de bebida Chrysanthemum con una dosis de CHC de 0.6 g / L a su pH natural de

5.0 se ajustó a 5 ° C, 10 ° C, 15 ° C, 20 ° C, 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C y 40 ° C y dejar reposar durante 4 h.
Se obtuvo una muestra en la línea de 7 mL del cilindro para detectar la transmitancia (T,%)
mediante un espectrofotómetro UV-Vis a 700 nm.

2.3.4. Tiempo de aclaración

Un total de 10 ml de bebida Chrysanthemum con una dosis de CHC de 0.6 g / L a su pH natural de

5.0 se ajustó a temperatura ambiente (30 ° C) y se dejó reposar durante 6 h. Se obtuvo una
muestra en la línea de 7 ml del cilindro a ciertos intervalos para detectar la transmitancia (T,%)
mediante un espectrofotómetro UV-Vis a 700 nm.

2.4. Optimización de las condiciones de clarificación

Con base en los resultados del experimento de factor único y el principio de diseño experimental
Box-Behnken (Cerreti et al., 2017), tres factores: dosis de CHC (A), pH (B) y temperatura (C), todos
los cuales tuvieron una influencia más fuerte en el efecto de clarificación, se eligieron como
variables independientes, y la transmitancia de la bebida Chrysanthemum fue el valor de
respuesta. Metodología de superficie de respuesta (tres factores y tres niveles) se llevó a cabo
para optimizar aún más las condiciones de clarificación de CHC.

El diseño experimental específico se muestra en la Tabla 1.

2.5. Determinación de parámetros fisicoquímicos

2.5.1. Contenido de proteínas

El contenido de proteína de la bebida Chrysanthemum se determinó usando el método de tinción

con azul brillante Coomassie (Bouiche & Faure, 2017; Bruijn et al., 2009). Brevemente, se
diluyeron 0,1-1,0 ml de una solución estándar de albúmina sérica bovina de 0,1 g / l a 1,0 ml para
obtener varias soluciones con diferentes concentraciones. Luego, se agregaron 5,0 ml de solución
azul de Coomassie a cada solución y se establecieron a 30 ° C durante 5 minutos. La absorbancia se
leyó a 595 nm, y se usó una solución sin albúmina de suero bovino como control. La curva
estándar con una ecuación relativa se preparó usando la concentración de álbum de suero bovino
como el eje xy la absorbancia como el eje y. Luego, se usó 1,0 mL de la bebida Chrysanthemum
para determinar la absorbancia como se describió anteriormente. Su contenido de proteína se
calculó en base a la ecuación de la curva estándar.

2.5.2. Contenido de polifenoles

El contenido de polifenoles de la bebida Chrysanthemum se determinó utilizando el reactivo de

fenol Folin-Ciocalteu (Ivanova, Gerasimova, Gazizullina, Popova y Matern, 2017; Rover & Brown,
2013). Brevemente, se diluyeron 0,1-1,0 ml de solución estándar de ácido gálico de 0,1 g / l a 2,0
ml. Luego, se agregaron 2,0 ml de reactivo de fenol Folin-Ciocalteu al 10% (v / v), 4,0 ml de
solución de Na2CO3 100 g / l y 2 ml de agua desionizada a cada solución diluida y se ajustaron a 25
° C durante 2 h. La absorbancia se leyó a 760 nm; la muestra de control no contenía ácido gálico.
La curva estándar con una ecuación relativa se preparó usando la concentración de ácido gálico
como el eje x

y absorbancia como el eje y. Luego, se usaron 0,2 ml de la bebida 179 Crisantemo para determinar
la absorbancia como se describió anteriormente. Su contenido de polifenol se calculó en base a la
ecuación de la curva estándar.

2.5.3. Contenido total de azúcar

El contenido total de azúcar de la bebida de Crisantemo se determinó usando

ácido fenol-sulfúrico (Rover, Johnston, Lamsal, y Brown, 2013). Brevemente, se diluyeron 0,1-1,0
ml de solución estándar de glucosa de 0,1 g / l y se fijaron a 1,0 ml. Luego, se añadió 1,0 ml de
solución de fenol a 50 g / l a cada solución diluida, y se añadieron rápidamente 5,0 ml de ácido
sulfúrico concentrado. La solución se dejó reposar durante 10 minutos. La absorbancia se leyó a
490 nm usando la solución sin glucosa como control. La curva estándar con una ecuación relativa
se preparó usando la concentración de glucosa como el eje xy la absorbancia como el eje y. Una
muestra de 0,3 ml de la bebida Chrysanthemum se diluyó primero a 1,0 ml y se leyó la
absorbancia.

El contenido total de azúcar se calculó en base a la ecuación de la curva estándar.

2.5.4. Contenido de flavonoides

El contenido de flavonoides de la bebida Chrysanthemum se determinó usando el método de la

sal de aluminio (Weng et al., 2017; Protsenko y Kostina, 2016). Brevemente, se diluyeron 1,0-10,0
ml de solución estándar de rutina de 0,2 g / l a 10,0 ml con solución de etanol al 60% (v / v). Luego,
se añadió 1,0 ml de solución de nitrito a 50 g / l a cada solución diluida y se ajustó durante 6 min.
Luego, se añadió 1,0 ml de solución de Al (NO3) 3 100 g / l y se dejó reposar durante 6 minutos.
Las soluciones estándar se diluyeron en 25 ml con etanol al 60% y se dejaron reposar durante 15
min. La absorbancia se leyó a 500 nm usando la solución sin rutina como control. La curva
estándar con una ecuación relativa se preparó usando la concentración de rutina como el eje xy la
absorbancia como el eje y. Una muestra de 1.0 mL de la bebida Chrysanthemum se diluyó primero
a 10mL con 60% de etanol, y luego se leyó la absorbancia a 500 nm. El contenido de flavonoides se
calculó en base a la ecuación de la curva estándar.

2.5.5. Contenido sólido soluble

Se colocaron dos o tres gotas de la bebida Chrysanthemum en el refractómetro de mano para

determinar el contenido de sólidos solubles (%).

2.5.6. Contenido total de ácido

El contenido total de ácido de la bebida Chrysanthemum se determinó usando el método de

titulación (Hou, 2004). Una muestra de 1 ml de la bebida Chrysanthemum se diluyó a 10 ml con
agua desionizada, y se añadieron 2 gotas de indicador de fenolftaleína. La solución se tituló
lentamente con una solución de NaOH 0,1 mol / l hasta que emergió un color rojizo y persistió
durante 30 s. El volumen de solución de NaOH consumida se registró como V1 (ml). El agua
desionizada se usó como control, y el volumen de solución de NaOH consumida se registró como
V2 (ml). El contenido total de ácido (g / L) se calculó utilizando y = 0.1 × (V1-V2) × K × 1000
convirtiendo todos los ácidos en ácido acético.

K fue el coeficiente de conversión de ácido acético, que fue de 0.060.

2.5.7. Cromaticidad

Se colocó un total de 10 ml de bebida de Crisantemo en el espectrofotómetro CM-5 para obtener

su valor de L, un valor yb para la cromaticidad. Se calculó la aberración cromática ΔE entre las
bebidas con y sin clarificación.

2.6. Evaluación de la calidad sensorial

La calidad sensorial de la bebida Chrysanthemum fue evaluada en términos de apariencia, aroma y

sabor por un grupo de evaluación compuesto por 10 miembros entrenados.

Las muestras (aproximadamente 20 ml cada una) se sirvieron en vasos de plástico transparente.

Todas las evaluaciones se realizaron en un laboratorio bien controlado en el Departamento de
Ingeniería de Alimentos de la Universidad de Sichuan. A cada panelista se le proporcionó agua
potable para eliminar el arrastre de sabor y enjuagar sus bocas entre muestras. Las muestras
recibieron códigos antes de las pruebas. Los resultados se presentaron como puntaje, y el puntaje
completo fue 100. El estándar de evaluación específico se incluyó en la Tabla 2. El miembro
primero eligió la opción más adecuada y luego dio una puntuación basada en una escala hedónica
del puntaje más bajo de 'extremadamente dislike 'al puntaje más alto de' extremadamente como '.

2.7. Determinación de la estabilidad de almacenamiento

Se envasa un total de 30 ml de bebida Chrysanthemum en un frasco de vidrio transparente.

Después de la esterilización, se enfrió a temperatura ambiente y se almacenó a 4 ° C durante 30
días, durante los cuales se usaron observaciones frecuentes para detectar si surgió el precipitado y
cuándo. Ningún precipitado se expresó como "-"; una pequeña cantidad de precipitado que no
cubría el fondo del recipiente de vidrio se expresó como "+"; y una gran cantidad de precipitado
que ha cubierto el fondo del recipiente de vidrio se expresó como "++".

2.8. Análisis de los datos

Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Los datos recopilados se analizaron
utilizando Origin Pro 8.0 (Origin Lab Company, America) y SPSS Statistics 17.0 (IBM Company,
America). El diseño de Box-Behnken de la metodología de superficie de respuesta se realizó con
Design-Expert 8.0.6 (Stat-Ease Company, América). Los resultados se muestran como la media ±
desviación estándar. La prueba de Tukey de ANOVA se usó para determinar diferencias
significativas entre las medias (P <0.05).

3. Resultados y discusión

3.1. Factores de influencia en la clarificación

3.1.1. La dosificación de CHC de dosificación de CHC puede influir en el efecto de clarificación

porque el clarificador puede interactuar con sustancias en suspensión en función de la
neutralización de carga y la capacidad de puente; pueden inducir precipitación, lo que lleva a una
aclaración (Fu et al., 2017). La transmisión de la bebida Chrysanthemum en dosis variadas de CHC
se muestra en la Figura 1. CHC tuvo un efecto de clarificación significativo (P <0.05) en la bebida
Chrysanthemum debido al incremento obvio en la transmitancia de la bebida, del 55% a más del
80%. Con el aumento en la dosificación de CHC, primero se mejoró el efecto de clarificación y
luego se disminuyó. Cuando la dosificación de CHC fue de 0,8 g / l, la transmitancia de la bebida de
crisantemo alcanzó un máximo del 95%. Por lo tanto, CHC tuvo el mejor efecto de clarificación a
una dosis de 0.8 g / L. A medida que la dosificación de CHC aumentó aún más a 1,0 g / l, el efecto
de clarificación se debilitó y la transmitancia de la bebida disminuyó al 85%. En general, una dosis
más alta de clarificador tendría un efecto de clarificación más fuerte. Sin embargo, una
dosificación excesiva dificultaría la agregación y la precipitación de las sustancias suspendidas
cuando surgiera un aspecto protector coloidal del clarificador con respecto a las sustancias
suspendidas (Fu et al., 2017). En general, la dosis más adecuada de CHC fue de 0.8 g / L.

3.1.2. pH

Se informó que el pH influyó en la carga eléctrica y la morfología microscópica de CHC en solución

acuosa (Fu et al., 2017). El pH también fue capaz de influir en el efecto de clarificación de CHC en
la bebida Chrysanthemum. Las transmitancias de la bebida Chrysanthemum clarificada por CHC a
diversos valores de pH se muestran en la Figura 2. Con un pH incrementado, la transmitancia de la
bebida3. Resultados 254 y discusión

3.1. Factores de influencia en la clarificación

3.1.1. Dosificación de CHC

La dosificación de CHC puede influir en el efecto de clarificación porque el clarificador puede

interactuar con sustancias en suspensión en función de la neutralización de carga y la capacidad
de puente; pueden inducir precipitación, lo que lleva a una aclaración (Fu et al., 2017). La
transmisión de la bebida Chrysanthemum en dosis variadas de CHC se muestra en la Figura 1. CHC
tuvo un efecto de clarificación significativo (P <0.05) en la bebida Chrysanthemum debido al
incremento obvio en la transmitancia de la bebida, del 55% a más del 80%. Con el aumento en la
dosificación de CHC, primero se mejoró el efecto de clarificación y luego se disminuyó. Cuando la
dosificación de CHC fue de 0,8 g / l, la transmitancia de la bebida de crisantemo alcanzó un
máximo del 95%. Por lo tanto, CHC tuvo el mejor efecto de clarificación a una dosis de 0.8 g / L. A
medida que la dosificación de CHC aumentó aún más a 1,0 g / l, el efecto de clarificación se
debilitó y la transmitancia de la bebida disminuyó al 85%. En general, una dosis más alta de
clarificador tendría un efecto de clarificación más fuerte. Sin embargo, una dosificación excesiva
dificultaría la agregación y la precipitación de las sustancias suspendidas cuando surgiera un
aspecto protector coloidal del clarificador con respecto a las sustancias suspendidas (Fu et al.,
2017). En general, la dosis más adecuada de CHC fue de 0.8 g / L.

3.1.2. pH

Se informó que el pH influyó en la carga eléctrica y la morfología microscópica de CHC en solución

acuosa (Fu et al., 2017). El pH también fue capaz de influir en el efecto de clarificación de CHC en
la bebida Chrysanthemum. Las transmitancias de la bebida Chrysanthemum clarificada por CHC a
varios valores de pH se muestran en la Figura 2. Con un pH incrementado, la transmitancia de la
bebida

CONCLUSIONES

El clarificador de hidrólisis de colágeno (CHC), preparado a partir de virutas de piel de cerdo

(desperdicio de colágeno), mostró un excelente efecto de clarificación sobre la bebida
Chrysanthemum a una dosis apropiada de CHC, pH de la bebida y temperatura ambiente; la
transmitancia de la bebida aumentó significativamente del 55.4% al 96.2%. La calidad,
especialmente la calidad sensorial y la estabilidad de almacenamiento, obviamente fue mejor que
eso sin ninguna aclaración. Además, el costo de CHC se estimó en solo $ 0.93 / kg, que es mucho
más bajo que otros clarificadores comerciales. Por lo tanto, CHC se puede aplicar en la clarificación
de bebidas vegetales.