Escuela de

Microbiología
PRÁCTICA ENZIMAS:
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD AMILASA Biotecnología
CON APLICACIÓN EN LA HIDRÓLISIS DEL Industrial
ALMIDÓN
Laboratorio de
Biotecnología
1-207
Profesora: Luisa Fernanda Rojas Hoyos

INTRODUCCIÓN

Las amilasas son unas de las enzimas más utilizadas en los procesos de hidrólisis del almidón,
uno de los polímeros más abundantes en el reino vegetal. La α-amilasa en particular, cataliza los
enlaces α 1-4 de la amilosa y la amilopectina, que son los polisacáridos lineales y ramificados,
respectivamente, que conforman el almidón. Por su parte la amiloglucosidasa, es uno de los
catalizadores más antiguos en la industria de alimentos y cataliza la ruptura tanto de los enlaces
α 1-4 como α 1-6, dando como producto un jarabe glucosado con un porcentaje de conversión
superior al 90% en equivalentes de dextrosa (Kumar y Satyanarayana, 2009). Estas enzimas
pueden ser obtenidas a partir de diferentes fuentes vegetales y microbianas, en especial
microorganismos del género Aspergillius, Trichoderma, así como levaduras (Castaño et al.,
2011).

En los últimos años, se ha incrementado el interés en los procesos de hidrólisis enzimática del
almidón obtenido a partir de diferentes fuentes (maíz, yuca, banano, entre otros, etc.), utilizado
para la producción de glucosa, la cual es empleada como sustrato para procesos microbiológicos
orientados a la biosíntesis de metabolitos para la industria de alimentos (Whitaker et al., 2003),
productos farmacéuticos y biocombustibles entre otros (Rojas et al., 2003; Castaño et al., 2011)

Con el fin de incrementar la eficiencia de los procesos de hidrólisis enzimática del almidón, se
vienen comercializando una diversidad de enzimas del tipo α-amilasas y mezclas de ellas. En este
sentido es importante adquirir destreza en procesos de caracterización y selección de las
enzimas adecuadas para la realización de estos procesos. Por lo anterior, surge una pregunta,
¿Cuáles son los criterios para seleccionar una enzima aplicable a un proceso industrial? Dentro
de estos criterios, se encuentra la validación de la actividad enzimática, reportada por el
fabricante de la enzima y en combinación con la información reportada en la ficha técnica, es
posible iniciar un proceso de selección adecuado.

OBJETIVOS

General

Adquirir destreza en el proceso de selección de una enzima del tipo α-amilasa con aplicación en
la hidrólisis del almidón.

1
Específicos

 Aplicar procesos de hidrólisis enzimática del almidón

 Determinar la actividad enzimática de amilasas de diferentes referencias y comparar su
efecto sobre el proceso de hidrólisis enzimática.

 Adquirir criterios para la selección de enzimas con base en la información consignada

en las fichas técnicas.

REACTIVOS

 10 g Almidón de yuca, arroz, maíz o banano (Solicitar a los estudiantes el mismo tipo de
almidón para todos).
 5 mL de amilasas de cada una de las siguientes referencias (Se solicitan en el grupo de
Biotransformación):
Termamyl®,
Gzyme480®
StargenTM
Optidex TM L-400
 200 mL Agua destilada
 50 mL de Reactivo DNS con curva de calibración
 Soluciones para ajustar pH.

MATERIALES POR GRUPO DE TRABAJO

 2 Erlenmeyers de 250 ml con tapón de gasa.

 25 Tubos de ensayo en gradilla
 Tubos cónicos de 15 mL
 14 Celdas para espectrofotómetro de 1 mL
 1 caja de Puntas de 1000 μL
 1 caja de Puntas de 200 μL
 Papel aluminio

EQUIPOS

 1 Baño maría a 95°C

 1. Shaker a 60°C a 150 rpm
 2 Baños de hielo
 4 Termómetros
 1 Espectrofotómetro
 1 Espátula

2
PROCEDIMIENTO

1. Preparar 100 mL de una solución de almidón de concentración (50 g/L) y ajustar pH de

acuerdo a las recomendaciones del profesor. Depositar de a 50 mL en dos Erlenmeyers
de 250 mL y marcar como E1 y E2 (tomar de cada ensayo 1 mL del sobrenadante y
marcarlos como E1(t=0) y E2(t=0).

2. Incubar a 70°C, cada solución de almidón de acuerdo a la enzima asignada (ver Tabla 1).
Cuando la solución alcance la temperatura adecuada, adicionar 300 μL de la enzima
(Verificar que el almidón no se gelifique). Registrar el tiempo en calentamiento y tomar
una muestra de cada ensayo. Marcarla como E1(t=x) y E2(t=x), donde x es el tiempo que
demoró en alcanzar la temperatura de 70°C, aproximadamente 10 min).

3. Incubar nuevamente la reacción durante 60 min y tomar muestras de 1 mL cada x min

(los minutos del muestreo, deben ser el mismo tiempo demorado en calentar el
Erlenmeyer antes de adicionar la enzima).

4. Determinar para cada muestra el contenido de azúcares reductores de acuerdo al

protocolo conocido DNS

5. Recopilar la información obtenida por el equipo de trabajo que le corresponda.

RESULTADOS

1. Obtener para cada tratamiento la velocidad de formación de azúcares reductores, con

un gráfico de C vs t.

2. Calcule para cada tratamiento la actividad enzimática (AE) en unidades (U). Defina la
actividad enzimática para las amilasas trabajadas.

3. Obtener las fichas técnicas de las enzimas trabajadas y en combinación con AE obtenida,
seleccionar la enzima o el tratamiento apropiado para el proceso de hidrólisis
enzimática del almidón.

4. Solicitar al equipo que corresponda, los datos con los cuales debe hacer la comparación.

PREGUNTAS

1. Cuáles son las condiciones de operación que afectan la actividad enzimática de las
amilasas?

2. Con relación a las fichas técnicas consultadas, cual enzima o mezcla de enzimas
compraría? Justifique

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 3. Cual información relevante debe estar consignada en una ficha técnica en general? Esta
completa la información de las fichas consultadas?

4. Investigue otros usos para las amilasas.

DIAGRAMA DE TRABAJO

Tabla 1. Guía de trabajo

Equipo Tratamiento Comparar con

1 Termamyl® Termamyl®-Gzyme480®
2 Termamyl®-Gzyme480® StargenTM
3 StargenTM Termamyl - Optidex TM L-400
4 Termamyl - Optidex TM L-400 Termamyl®

BILBIOGRAFÍA

Castaño, H.; Cardona, M.; Mejía, C.; Acosta, A. 2011. Producción de etanol a partir de harina de
yuca en un sistema de hidrólisis enzimática y fermentación simultánea. Dyna, 78 (169),
158-166.

Kumar, P.; Satyanarayana, T. 2009. Microbial glucoamylases: characteristics and applications.

Crit Rev Biotechnol. 2009;29(3):225-55.

Rojas L. F., Mazo J. C., Sánchez C. P., Ríos R. y Figueroa C.2003. Efecto del Ca2+ sobre la actividad
catalítica de glucosa isomerasa inmovilizada durante la producción de jarabes fructosados
a partir de almidón de yuca. Alimentación, Equipos y Tecnología. 184: 49-54

Whitaker J.; Voragen A.; Wong, D. 2003. Handbook of Food Enzymology, Publisher: Marcel
Dekker