ú nicamente los procm-iotas son capaces de captar de la reserva atmosférica
de nitrógeno al nitrógeno molecular (N2) y de fijarlo. En parte en formas de vida libre, en parte en simbiosis con plantas superiores, pueden pasar al N 2 inerte a una combinación orgánica, y lo incorporan directamente o a través de las sustancias celulares a la proteína del sucio. La fijación simbiótica del N~ por leguminosas posibilita una ganancia de nitrógeno de 100-300 kg N por hectárea y año. Se calcula que los microorganismos de vida libre fija- dores de N2 aportan al suelo entre 1-3 kg N/(Ha.a). Al suelo pueden llegar además cantidades considerables de nitrógeno combinado con las lluvias a partir de la atmósfera; según cual sea el grado de contaminación del aire entre 3-30 kg N/(Ha.a). (Ciclo del nitrógeno, pág. 9 y siguientes.) Medidas y cálculos aproximados indican que en el año 1974 se fijaron en Ja tierra 175· 106 tm N, de ellos 90· 106 tm en tierra de explotación agrícola; 40· 106 tm N se lijaron por el proceso químico de HABER-Bosrn. La fracción prin- cipal de la fijación de N2 la proporciona la simbiosis de los rizobios. La lijación biológica del nitrógeno es un proceso de reducción. El sistema de la nitrogenasa transfiert: 6 [H] al N 2 y libera 2 [H] como hidrógeno molecular. El amoniaco es el primer producto demostrable de la reacción.
La diimida y la hidracina se indican exclusivamente para considerar posi-
bles productos intermedios ligados al enzima. Los sistemas enzimáticos de la 11itroge11asa de muchas bacterias fijadoras de nitrógeno aislado~ hasta el momento son muy parecidos entre sí. Su característica más impor- tante es la elevada sensibilidad frente al oxígeno, tanto in situ como in \·itro. Hay que tenerla en cuenta en todas las consideraciones.
13.1 Fijación de nitrógeno por bacterias simbióticas
Debido a la elevada ganancia en nitrógeno, la lijación simbiótica de nitró- geno se conoce ya desde antiguo y se ha utilizado en el marco del '"barbe- cho" y del cultivo rotatorio con el nombre de ·'abonado verde'·. BouSSINGALLi dio los primeros indicios acerca de la incorporación de nitrógeno por parte de los tréboles y de las judías. El establecimiento de la relación entre los 442 13. Fijación del nitrógeno molecular ~~~~~~~~~~~~-
nódulos de las lcgum1no"" y la liJac1ón de ni1rógeno se debe a HLLlRIHil.I y
WH,FARTH ( 1886- 1888 ). Las judías i.<ílo crecen en ausencia de nitrógeno combina. do si sus raíces presentan nddulos; los nódulos se forman por iníección de los pelos radicales por parte de bacterias del sucio ( Fig. 13. 1).
13.1.1 Nódulos en las raíces de las leguminosas
Lru. bacterias que pronx:an los nódulos de las leguminosac;. lac; bacterias de los nódulo'>. \e reúnen en el género Rhi-::.ob111m. Los bacilos de vida libre en el suelo. Grnm negativos. 'ºn aeróbicos e..,trictos y crecen con compuestos orgánicos como nutriente-.. Alguna-. cepas pueden crecer autotróficamen1e con H~. Según la especificidad por el hospedador y por otrac; características se diferencian tres ... ubgrupos (Tab. 13.1); cada uno tiene un nombre gené- rico distinto: ( 1) Rhiwlnum: a él pertenecen las bacterias de los nódulos de crecimiento rápido de nuestras plantas de cultivo. (2) Bradyrhi:,obi11111 japo- 11ic11111. el grupo de los simbiontes de la soja de crecimiento lento. y {1) A:.orhizobium caulinoclam, una bacteria que forma nódulos en el tallo. Casi todas las leguminosas pueden formar nódulos con rizobios. Una determinada cepa de Rhizobi11111 puede establecer por lo general una rela- ción simbiótica con varias especies de leguminosas.
Estadios de la nodulación. La simbiosis de las leguminosas con los ri zo-
bios no es cíclica. fato quiere decir que las bacterias no se encuentran en las semillas. Las bacterias penetran en los pelo\ radicales jóvenes desde el suelo. Cuando los do\ miembro:-. de la '>irnbiosis entran en contacto. tiene lugar el reconocimiento. Las leguminosas contienen lectinas: éstas so'l glucoproteínas que unen e'>pccílicamente a polisacáridos. Están mu) extendida., en la naturaleza } llenen probablemente en general funcio nes de reconocimiento. La-. rnterrclac1ones entre las lectinas de la pared exter- na de lo'> pelos radicab. jÓ\enes } lo\ polisacáridos de las capas exterio- res de la pared celular de la'> bacteria'> '-C han investigado en la simbiosí" entre el trébol} Rl11;:.ob111111 trifoli1. Se da una unión exclusivamente c uan- do los do\ miembro'> son los adecuados; no todos los Rhi-:,obium pueden unirse a todas la., leguminosas y \1Ce,crsa. Si tiene lugar la fijació n. el extremo del pelo radical se cuna. la'> bacterias penetran y crecen como un cordón de infección. que está rodeado por un manto de celulosa de la célula radical. e infectan a otra\ células de la corten radical. Se destruyen la!> células normales diploidcs. Cuando llegan a una célula tetraploide, de las que siempre ex Í\te alguna. se reproducen los rizobios. se producen fac · tores de crecimiento y se multiplican las células de la corteza radical. Los nódulos son el resultado de esta inflamaci6n de los tejidos provocada por los rizobios con aporte de factores de crecimiento, probablemente cito- quininas. Las bacteria'> se reproducen muy rápidamente, crecen formando -- 13.1 Fijación de nitrógeno por bacterias simbióticas
A 443
Flg. 13.1 Fijación simbiótica de nitrógeno en los nódulos radicales de las legu- mlnosas. A Ralz de guisante con nódulos; B corte a través de un nódulo totalmen· te formado; e corte de una célula llena de rizobios; o las bacterias contenidas en las células tienen formas diversas (bacteroides); E penetración de las bacterias en la punta de un pelo radical y crecimiento del tubo de infección a través de la corteza radical. Dibujos muy esquematizados. 444 13. Fijación del nitrógeno molecular
Tab. 13.1 Subgrupos de bacterias formadoras de nódulos en las leguminosas.
células de aspecto irregular, bacteroides, que pueden tener un volumen
más de LO veces superior al de los rizobios. Los bacteroides se encuentran, por último, libres o en grupos rodeados por membranas en el citoplasma de las células vegetales. El tejido relleno de bacterias adquiere una tonali- dad roja; contiene el pigmento leghemoglobina. AJ envejecer los nódulos se vuelven verdes, debido a la degradación de la leghemoglobina a pig- mentos biliares verdes (biliverdinas). Si muere el nódulo. los rizobios que todavía estaban en un gran número en reposo, se liberan y se multiplican alimentándose de los productos de degradación del nódulo. Función de los bacteroides y de la leghemoglobina. Los bacteroides fi- jan nitrógeno. Durante la fase de fijación de nitrógeno los bacteroides son alimentados por la planta con ácidos dicarboxílicos de 4 carbonos, como malato, succinato y fumarato. En contraposición a los rizobios libres, Jos bacteroides no pueden utili?ar azúcares. Los bacteroides secretan iones amonio, que aparentemente establecen un enlace orgánico gracias a Ja glu- ramina-si11tetasa de las células vegetales vecinas (apartado 7.6). La rela- ción planta-Rhizobium es por tanto una verdadera simbiosis. La dependencia mutua de ambos miembros se pone aún más de manifies- to en la leghemoglobina, que desempeña un papel esencial en la fijación del N 2• La formación de la leghemoglobina es una capacidad específica de la simbiosis: el grupo prostético, el protohemo. es sintetizado por los bac- teroides, la parte proteica por el vegetal. La leghemoglobina es semejante a la mioglobina y en los nódulos se presenta predominantemente en la forma de hierro (II); tiene una elevada afinidad por el oxígeno. Se puede considerar que la leghemoglobina facilita el transporte del oxígeno desde la membrana envolvente a través de un espacio sin posibilidad de convec- ción hasta la superficie de los bacteroides, e incrementa. por tanto, la velo- cidad del transporte de oxígeno. Sus características garantizan que los bac- teroides dispongan de suficiente oxígeno para la ganancia energética y para el crecimiento, sin que se den presiones parciales de 0 2 excesiva- 13.1 Fijación de nitrógeno por bacterias simbióticas 445
mente elevadas que influirían en la fijación de N2 por los bacteroides. La
presencia de leghemoglobina asegura aparentemente una protección total frente a las lesiones del sistema enzimático fijador de Ni por el oxígeno (véase apartado J3.3). Los rizobios son las únicas bacterias fijadoras de N2 que disponen de una hidrogenasa (aunque no todas las cepas) que tiene una función protectora frente al oxígeno. Es poco probable que los rizo- bios de vida libre sean capaces de fijar N 2 en el suelo. Tan sólo en pocas cepas de Rhizabium se ha podido demostrar actividad nitrogenasa en colonias cultivadas sobre agar. La formación de la nitrogenasa es depen- diente de la presión parcial de 0 2en las colonias. Nódulos en el tallo. En algunas leguminosas aparecen nódulos en el tallo. Éstas albergan cepas de rizobios, que se reúnen en Azorhizobium cauli110- dans. Estas leguminosas, p. ej. Sesbania rostrata, crecen en hábitats húmedos del África tropical y de la India. Los nódulos aparecen en tallos aéreos y sumergidos. El conocimiento de esta simbiosis en el tallo aún es muy reciente. Se espera que la sensibilidad frente al 02 del sistema de fija- ción del N 2 sea menor que en otros sistemas.
13.1.2 Nódulos en las raíces de no leguminosas
Existe también una serie de dicotiledóneas superiores, que no pertenecen a las leguminosas, que disponen de nódulos radicales capaces de fijar N1. La fijación de N2 se basa igualmente en una simbiosis con procariotas. En la mayoría de Jos casos el endosimbionte es aquí un actinomiceto. y per- tenece al género Frankia. Entre las plantas que albergan actinomicetos se cuentan tanto leñosas como herbáceas. Están extendidas por todo el mundo y aparecen como plantas pioneras en los hábitats pobres en nitrógeno. El aporte de nitrógeno de por lo menos algunas de esta plantas supone 150-300 kg N/(Ha.a) y es por tanto de una gran importancia económica. Entre las plantas fijadoras de Ni más efectivas se cuentan la casuarina (Casuarina equisetifolia), el aliso (Alnus), el espino amarillo (Hippophae) y Ceanothus; menos efectivos son el mirto de Bravante (Myrica), Dryas, el árbol del paraíso (Elaeagnus) y Shepherdia. En las plantas leñosas los nódulos radicales pueden alcanzar el tamaño de una pelota de tenis. Se trata de raíces ramificadas en forma de coral, muy imbricadas, que han detenido su crecimiento. En Casuarina los nódulos forman un manojo de raíces engrosadas con crecimiento geotrópico nega- tivo. Las bacterias simbióticas infectan exclusivamente las células del parénquima cortical. Igual que en las leguminosas la infección de las raí- ces tiene lugar a partir del suelo y por los pelos radicales. Tienen e.n común con los nódulos de las leguminosas la presencia de leghemoglob1- 446 13. Fijación del nitrógeno molecular
na. T an sólo recientemente se ha demostrado una cepa de Rhizabiwn como
endosimbionte en una planta que no pertenece a las leguminosas, Paras- ponia parviflora (un olmo). Esta cepa pudo transferirse incluso a lcgum¡. nosas. Los nódulos fijan nitrógeno activamente.
13.1.3 Simbiosis con cianobacterias fijadoras de N2
Las cianobacterias (pág. 135 y sig.) también establecen simbiosis con plantas superiores comportándose como el miembro fijador de Ni . En el helecho acuático Azo/la que se encuentra en la superficie de las aguas tro- picales estancadas, se han encontrado cianobacterias en huecos entre los tejidos de las hojas. El simbionte es Anabaena azollae. Mientras que las especies de vida libre de Anabaena únicamente contienen pocos hetero- cistos (5%) en los tricomas de Anabaena simbióticas se presentan hasta un 15-20% de heterocistos. Esta relación indica ya por sí sola una fijación efectiva de Ni. Medidas de la actividad de la nitrogenasa confirman esta suposición. k:.olla crece sobre la superficie de las aguas de los campos de arroz inundados y si se trabaja convenientemente pueden cubrir todos los requerimientos de los arrozales en cuanto a nitrógeno. La ganancia en cuanto a nitrógeno en la simbiosis de Anabaena con Azol/a supone unos 300 kg N/(Ha.a). Entre los musgos hepáticos (Blasia pusilla, Anthoceros pw1ctatus, Peltigera) y Nostoc se establece una simbiosis semejante. En el arbusto tropical Gunnera macrophylla se encuentra Nostoc puncti- forme en la zona inferior del tallo, localizado en unas drusas especiales en el inicio del peciolo foliar. Este Nostoc también forma heterocistos y sin- tetiza 11itroge11asa.
13.2 Fijación de nitrógeno por bacterias de
vida libre y cianobacterias La capacidad para fijar el N2 está ampliamente extendida entre las bacte- rias de los suelos y las aguas. En todos los grupos fisiológicos hay algún representante capaz de fijar nitrógeno más o menos eficientemente. La gran mayoría de las bacterias pertenecientes a los grandes grupos de pro- cariotas fototróficos, las bacterias rojas del azufre y sin azufre, así como las cianobacterias, son capaces de fijar N 2 (Tab. 13.2). Esta capacidad es de significación ecológica. Como bacterias fijadoras de nitrógeno se han reconocido Xanthobacter autotrophicus. Alcaligenes latus y Derxia gum- mosa entre las bacterias autotróficas, Klebsiella pneumoniae y Baci/lus polymyxa entre las anaeróbicas facu ltativas, clostridios, metanógenos y reductoras de sulfatos (sulfurógenas) entre los anaeróbicos estrictos. La 13.2 Fijación de nitrógeno por bacterias de vida libre 447
fab. 13.2 Algunas bacterias de vida libre fijadoras de nitrógeno. Grupos fisio- rc>gicos, géneros y especies.
Klebsiella pneumoniae C/ostridium Mayoría de Bacillus polymyxa cianobacterias
demostración sin ninguna duda de la fijación de Ni en los metanógenos,
pertenecientes a las arqueobacterias, fue muy sorprendente. La investiga- ción de un gran número de bacterias se ha faci litado en gran manera por la introducción de la técnica isotópica (demostración de 15 N) y de la cro- matografía gaseosa, con cuya ayuda se demuestra fácilmente el etileno formado a partir del acetileno por los fijadores de Ni . No obstante, la demostración se sigue haciendo todavía por comprobación del crecimien- to. Es posible que incluso la mayoría de las bacterias dispongan de la información genética para la fijación del N 2, pero que los genes no se expresen como consecuencia de adaptaciones a determinados hábitats. Mientras que la mayoría de Jos fijadores de N 2 aeróbicos únicamente pue- den fijarlo bajo presiones parciales de Oi bajas, el grupo de Azotohacter está adaptado al aire. A;:.otobacter chroococcum, A. vinelandii, Beijerin- ckia indica, Derxia gummosa y A;:.omonas agilis pertenecen por tanto a las bacterias fáciles de aislar, incubando, bajo atmósfera de aire un medio de cultivo sin nitrógeno inoculado con agua o suelo. A. chroococcum es sig- nificativamente más abundante en suelos pobres en nitrógeno que en los abonados. ricos en nitrógeno. En las riLOsferas de algunas plantas se encuentran acúmulos de bacterias fijadoras de N2 ; entre ellas, A;:.otobacter paspali en las raíces superficiales de Paspalum notatum y Awspirillum lipoferum en la rizosfera de Digiwria decumbens. Como los dos miembros obtienen un beneficio, esta asociación se califica de simbiosis. 448 13. Fijación del nitrógeno molecular
La fijación de nitrógeno por las cianobacterias de vida libre es de una
significación no despreciable, por lo menos en los arrozales [30-50 kg N/(Ha.a)J. En aproximadamente 40 especies de cianobacterias se ha pod 1 do demostrar en cultivo puro la capacidad para fijar Ni . Las cianobactc- rias se cuentan entre los pioneros en la colonización de suelos pobres (vol- cánicos) y se encuentran en ambientes extremos, como la Antártida a tem- peraturas próximas a la congelación, y en fuentes termales. Viven de forma aislada o en simbiosis con hongos en forma de líquenes. En las aguas continentales y en zonas del mar se dan anualmente las llamadas "floraciones'', desarrollos masivos de cianobacterias bien conocidos. Aún no ha podido calcularse qué porcentaje de ganancia de nitrógeno y de pro- ducción de biomasa corresponde a las cianobacterias en el mar. Oligoelementos necesarios par a la fijación de nitrógeno. Para la fiJa- ción de N2 se requiere molibdeno y níquel. Hay dos procesos en los que las bacterias requieren molibden o: la fijación d e Ni y la red ucción de nitra tos. Los enzimas clave para ambos procesos son molibdoproteínas. El níquel es un componente de las hidroge11asas. Como todos los fijado- res de N 2 disponen de una hidrogenasa (excepto algunos riLObios) el níquel es de gran importancia para todos los fijadores de Ni . Ya hace 50 años que H. BORTELS descubrió que el molibdeno era necesa- rio para la fijación del N2. y que a veces se puede sustituir por vanadio. Los trabajos genéticos han demostrado que A::.otobacter vinelandii y Xa11t/10- hacter awotrophicus disponen de dos agrupaciones de genes. una que codi- fica para la síntesis de una 11itroge11asa que contiene molibdeno, y la otra para la formación de otra hidrogenasa que contiene vanadio. Totalmente inesperada fue la comprobación de que también hay actividad sin oligoele- mentos, y A. vinelandii puede fijar N2 incluso cuando se han deleccionado los genes para las dos nitrogenasas (dependientes de Mo y V). La 11irroge- 11asa que se forma entonces es una simple proteína sulfoférrica.
13.3 Bioquímica de la fijación de nitrógeno
La fijación de nitrógeno transcurre en un sistema enzimático, el sistema de Ja 11itroge11asa; tiene dos componentes. la 11itroge11asa y la nitrogenasa· reductasa (Fig. 13.2). Ambos componentes están asociados y se localizan en el citoplasma y son extraordinariamente sensibles al óxigeno. Esta característica justifica el por qué las bacterias anaeróbicas facultativas úni- camente lijan nitrógeno en condiciones anóxicas. las cianobacterias sólo en los heterocistos y los rizobios sólo en presencia de leghemoglobina. Ambos componentes son proteínas sulfoféfficas. La 11itroge11asa es el componente mayor y tiene cuatro subunidades (ex~. ~2) cada una de las cuales contiene un átomo de molibdeno. Las proteínas tienen un potencial 13.3 Bioquímica de la fijación de nitrógeno 449
nttrogenasa energía
fermentación 111.. ATP- -Pr _~ a mtrogenasa ,.....
f ig. 13.2 Esquema general de la fijación de nitrógeno. Fd =ferredoxina; Fld =
Flavodoxina.
redox negativo. Los electrones suministrados por la ferredoxina y la fla-
vodoxina se transfieren primero a la nitrogenasa-reducrasa. y posterior- mente con consumo de ATP (unos 16 mol ATP/mol N2) a la 11itroge11asa. Esta proteína molibdénica cataliza la verdadera reducción del N 2. Simul- táneamente se reducen 2 H+ a H2. El sistema en1.imático no sólo reduce N2. sino también acetileno (etino), azida. óxido nitroso. cianuro. nitrilos. i~o nitrilos y protones. La técnica metodológicamente más simple para demostrar la nitrogenasa se basa en Ja reducción del acetileno. El acetileno es reducido a etileno (eteno) que puede determinarse cuantitativamente de una forma muy cómoda mediante cromatografía de gases. Hasta ahora todas las bacterias fijadoras de N2 y sistemas simbióticos reducen el acetileno. El sistema alternativo de la nitrogenasa, que tiene vanadio como metal pesado carac- terístico, reduce aún un paso más el acetileno. hasta el etano. Por ello. ambos sistemas pueden diferenciarse bien i11 1>ii'o. La en er gía necesaria en forma de ATP para la fijación de N 1 puede su- ministrarse por ferm en tación , fotosíntesis o respiración (Fig. 13.2). Las cantidades necesarias de poder reductor y de ATP son tan altas, que se manifiestan en los rendimientos celulares de crecimiento. Si . por ejemplo, se cultiva una bacteria fijadora de nitrógeno con una canti- dad limitada de azúcar en un medio con amonio y otro sin él. el rendi- miento del crecimiento es superior en el primero. en el que no tiene que fijar Ni . Papel d e la hjdrogenasa. El sistema de la 11itroge11asa de toda!> las bac· terias produce H2 además de NH 1; se consideró este hecho inicialmente 450 13. Fijación del nitrógeno molecular
como sorprendente, ya que parecía que se desperd iciaba poder reductor
El hecho de que todas las bacterias fijadoras de N1 dispongan de un~ hidrogenasa ligada a membrana!>, parece apoyar que tiene una función protectora para el s istema de Ja 11itroge11asa sensible al oxígeno. El hidró- geno parece utilizarse para reducir el oxígeno que difunde a la célula y "desactivarlo" en forma de agua (Fig. 13.3). Esto está en consonancia con la demostración de Hi en la capa de aire próxima a los campos de tréboles. Muchos rizobios, entre ellos R. trifo- lii, no contienen ninguna hidrogenasa, por lo que no pueden activar el 1-{, y éste pasa a la célula vegetal y a la atmósfera. Es comprensible que a muchos rizobios les falte la hidrogenasa porque en ellos la protección frente al oxígeno se la proporciona la leghemoglobina y no existe ningu- na presión de selección para un segundo sistema de protección. Medidas de rendimientos en soja inoculadas con una cepa de Bradyrlzizabium japonicum formador de hidrogenasa (a) y con un mutante sin lzidrogena- sa de la misma cepa (b) indican que la reutilización del hidrógeno pro- ducido por el sistema de la nitrogenasa conlleva una ganancia energética en la célula y un aumento en el rendimiento. La presencia simultánea de nitrogenasa e hidrogenasa en todas las bacterias fijadoras de Ni (inclui- dos Jos rizobios) es de importancia secundaria desde el punto de vista de la eficiencia energética; lo esencial es la función protectora. Regulación de la fijación de Nz. La nitrogenasa es sintetizada en muchas bacterias únicamente en aquellas condiciones en las que es necesaria para el crecimiento, esto es, en ausencia de una fuente utilizable de nitrógeno
sustrato orgánico
Fig. 13.3 Fijación de nitrógeno en algunas células con respiración aeróbica.
Se indica el catabolismo del sustrato, la reacción catalizada por el s istema de la nitro· genasa (rojo), la transferencia del NH3 a un enlace orgánico y el papel del H2. El H2 incrementa el consumo del oxígeno que difunde al interior de la célula y contribuye a la protección de la nitrogenasa. 13.3 Bioquímica de la fijación de nitrógeno 451
combinado. Los iones amonio reprimen la síntesis de la nitrogenasa. En
algunas bacterias la actividad del enzima ya presente puede verse también disminuida por los iones amonio. En la regulación de la síntes is de ta nitrogenasa aporta aparentemente un papel importante la glutamina-sinte- rasa (apartado 7 .6). La glutamina-sintetasa y la glutamato-sintasa sirven a Ja bacteria para transferir iones amonio a un compuesto orgánico, cuan- do estos iones se encuentran en baja concentración. Este sistema tiene una ele vada afinidad por Jos iones amonio y determina que su concentración celular sea baja. A l elevarse la concentración de los iones amonio en el ento rno y por tanto también en el interior de la célula, tiene lugar una represión de la síntesis de Ja g/11tamina-sintetasa y como consecuencia de la 11itrogenasa. Transferencia genética de los genes nif. La capacidad de fijar Ni pudo transferirse de una bacteria a otra por contacto directo entre las células. Esa transferencia de los genes nif de Klebsiella pneumoniae a Escherichia coli por conjugación y la localización de los genes nif en un plásmido dan pie a la esperanza de que los genes nif puedan ser transferidos a otras espe- cies bacterianas y quizás incluso a organismos eucarióticos. Como para Ja fij ació n de N1 hacen falta además de la nitrogenasa otras proteínas sulfo- férricas específicas y se ha de asegurar la protección de la 11itrogenasa frente al oxígeno, estos experimentos están sometidos todavía a grandes dificultades.
