DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA

RESOLUCION (HPLC)
FUENTES MAVIS 4-778-2106
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUI, FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS, ESCUELA DE QUÍMICA, CURSO DE QUÍMICA
ANALÍTICA (228).
RESUMEN:
Esta práctica tuvo como objetivo principal aprender a utilizar el equipo de HPLC de igual manera entender el
fundamento de la cromatografía líquida, donde se determinó el contenido de carbohidratos en muestras de
mieles nacionales. Se pesó 0.15g de la muestra de miel, esta se diluyo con H2O grado HPLC y se aforo en un
volumétrico de 100mL; es sumamente importante que las muestras y fase móvil a utilizar se filtren y
desgasifiquen, por lo tanto se filtró la disolución preparada con un filtro de jeringa 0.22µm y se colocó en el
vial HPLC para luego colocarla en el baño ultrasónico por 20 minutos. En la parte de inyección de la muestra
se lavó la jeringa con el agua HPLC y luego con la muestra tres veces, se inyecto 30µL de la muestra de miel
n○ 2 de igual manera se realizó para la muestra n○ 4. En la lectura de la muestra n○ 2 el área fue de
242679.0313 y 273853.5938, el tiempo de retención fue 15.256 para la glucosa y 16.280 de fructosa; el área
para la muestra n○ 4 fue de 281361.4688 y 378316.0625, el tiempo de retención 15.255 de glucosa y 16.277
de fructosa. De acuerdo a los resultados obtenidos se concluye que se logró entender el funcionamiento de
cada parte de equipo HPLC además se pudo desarrollar el análisis obteniendo el área y los tiempo de
retención de cada carbohidrato en las muestras de miel.

PALABRAS CLAVES:
Cromatografía liquida, carbohidratos, diluciones, contiene a la fase fija. La separación
curva de calibración, cromatograma. cromatográfica en HPLC es el resultado de las
interacciones específicas entre las moléculas de la
muestra en ambas fases, móvil y estacionaria.
OBJETIVOS: Los componentes básicos de un cromatógrafo de
 Entender el fundamento de la cromatografía liquidos son:
líquida. - Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba
 Aprender el manejo de un equipo HPLC. y dispositivo de mezclado de eluyentes).
 Determinar el contenido de carbohidratos - Dispositivo de inyección.
en muestras de mieles nacionales. - Conducciones y conexiones.
- Detector y registrador.
- Columna
MARCO TEÓRICO:
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y
La cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
especies iónicas, productos naturales lábiles,
es una técnica de análisis instrumental que
materiales poliméricos y una gran variedad de
introduce un grado de eficiencia y velocidad al
otros grupos polifuncionales de alto peso
concepto de cromatografía.
molecular. Con una fase móvil líquida interactiva,
La cromatografía es una técnica de separación
otro parámetro se encuentra disponible para la
que se basa en el reparto entre dos fases. La
selectividad, en adición a una fase estacionaria
separación se logra en base a la diferencia de
activa. La HPLC ofrece una mayor variedad de
velocidad de movilidad de los analitos entre una
fases estacionarias, lo que permite una mayor
fase inmóvil denominada fase estacionaria y una
gama de estas interacciones selectivas y más
fase móvil o eluyente. Esa movilidad va depender
posibilidades para la separación, según Harris,
del grado de afinidad que tenga el analito con la
D.C. (2008).
fase estacionaria y la fase móvil, según Harvey, P.
(2009).
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un
líquido que fluye a través de una columna que
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RESOLUCION (HPLC)
FUENTES MAVIS 4-778-2106
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUI, FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS, ESCUELA DE QUÍMICA, CURSO DE QUÍMICA
ANALÍTICA (228).
MATERIALES Y REACTIVOS: RESULTADOS:
Tabla 1. Muestra de miel n○2.
Material Capacidad Cantidad
Cromatógrafo - 1 Nmero Área Tiempo
liquido
1 242679.0313 15.256
Baño ultrasónico - 1
Vasos químicos 100 mL 3 2 273853.5938 16.280
volumétrico 100 mL 2
Filtro de jeringa 0,22 , 0.45µm 4
Agua grado - 450 mL Curva de calibración de glucosa:
HPLC y = 467775x - 4029.4, R² = 0.9973
Miel - 4g
Tiempo de retención: 15.256 min
242679.0313−4029.4
FASE EXPERIMENTAL: X= =0.51
467775
A. Diluciones de las muestras de miel y Curva de calibración de fructuosa:
preparación para analizar en el HPLC.
y = 470078x + 610.77, R² = 1
• Homogenizar la muestra Tiempo de retención: 16.280 min
1.
de miel, pesar 0.15 g.
273853.5938−610.77
• Diluir en 10 ml de H2O
x= =0.6
470078
2. grado HPLC y aforar en
un volumétrio de 100 ml
• Filtrar 2 ml de la dilucion Tabla 2. Muestra de miel n○4.
3. con un filtro de jeringa
0.22µm Numero Área Tiempo
• Colocar el filtrado en un
vial HPLC, El vial que 1 281361.4688 15.255
4. contiene la muestra 2 378316.0625 16.277
diluida y filtrada colocarla
en el baño ultrasónico
durante 20 minutos
Curva de calibración de glucosa:
y = 467775x - 4029.4, R² = 0.9973
B. Inyección de muestra en HPLC. Tiempo de retención: 15.255 min
• Lavar la jeringa de vidrio 281361.4688−4029.4
1.
con agua grado HPLC. X= =0.6
467775
Curva de calibración de fructuosa:
• Luego con la muestra tres
2.
veces y = 470078x + 610.77, R² = 1

• Cargar 30 ml de la Tiempo de retención: 16.280 min

muestra con la jeringa de 378316.0625−610.77
3. vidrio en el inyector x= =0.8
manual 470078

• Luego mover a la posición

4. inject
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ANALÍTICA (228).
DISCUSION:
La cromatografía líquida de alta resolución es una
de las técnicas de separación más ampliamente
utilizada debido a su versatilidad y amplio campo
de aplicación. Los componentes de la muestra,
previamente disueltos en un disolvente adecuado
(fase móvil), son forzados a atravesar la columna
cromatográfica gracias a la aplicación de altas
presiones. El material interno de la columna, fase
estacionaria, está constituido por un relleno capaz
de retener de forma selectiva los componentes de
la mezcla. La resolución de esta separación
depende de la interacción entre la fase estacionaria
y la fase móvil, pudiendo ser manipulada a través
de la elección de diferentes mezclas disolventes y
distintos tipo de relleno. Como resultado final los
componentes de la mezcla salen de la columna
separados en función de sus tiempos de retención
en lo que constituye el cromatograma. A través del
cromatograma se puede realizar la identificación
cualitativa y cuantitativa de las especies separadas
(Harvey, 2009).
Se utilizan diversos detectores acoplados a los
métodos cromatograficos, como por ejemplo, el
detector de índice de refracción (IR), detector de
ultra violeta/visible (UV/Vis), detector de
fluorescencia y detección de la dispersión de luz
por evaporación (ELSD), son los detectores más
comúnmente usados para HPLC. Para la
determinación de carbohidratos el sistema de
cromatografía liquida de alta resolución debe ser
acoplado a un detector de índice de refracción (IR),
este mide la diferencia de índice de refracción
entre el solvente puro y el solvente que contiene la
muestra. Según Borfitz, (2009).
Varios son los métodos que se han utilizado, para
determinar los contenidos de carbohidratos. Dentro
de estos, los métodos cromatograficos son en la
actualidad una herramienta imprescindible para la
determinación rápida y especifica de azucares.
Esto supone una notable mejora frente a los
análisis tradicionales donde las interferencias
presentes en la matriz y el consumo elevado de
tiempo suponen serios inconvenientes.
Hoy en día la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) ha llegado a ser una de las
técnicas de laboratorio más importantes como
herramienta analítica para separar y detectar
compuestos químicos. Esta técnica permite la
separación, identificación y cuantificación de los
azucares presente en muestras orgánicas.
Los carbohidratos de la miel son analizados en
muchos casos, para obtener información sobre
diferentes aspectos de su calidad, de esta forma se
tiene la determinación de azucares reductores, de
sacarosa, azúcar total, y glucosa comercial. Debido
a que la glucosa y la fructosa representan más del
90% de todos los azucares reductores, la
proporción fructosa/glucosa y las concentraciones
de sacarosa son buenos criterios para diferenciar
mieles monoflorales, según GIL, (2010).
Una de las matrices biológicas con altos
contenidos de carbohidratos es la miel, la cual es
definida por GIL, (2010) como la sustancia natural
dulce producida por la abeja Apis mellifera a partir
del néctar de las flores (miel de flores o de néctar).
CONCLUSIONES:
 Se logró entender el funcionamiento de
cada parte de equipo HPLC.
 Desarrollamos el análisis obteniendo el
área y los tiempos de retención de cada
carbohidrato en las muestras de miel.
 Obtuvimos resultados de alta resolución y
son fáciles de leer, y las pruebas se
reproducen con facilidad a través del
proceso automatizado.
BIBLIOGRAFÍA:
 Harvey, P. 2009. Química analítica
moderna, sexta edición. Editorial McGraw-
Hill, México.
 Harris, D.C. (2008). Análisis químico
cualitativo. Editorial Pearson, México.
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FUENTES MAVIS 4-778-2106
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUI, FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS, ESCUELA DE QUÍMICA, CURSO DE QUÍMICA
ANALÍTICA (228).
 Borfitz, V. (2009). Química analítica
descriptiva. Séptimas edición. Editorial
McGraw-Hill, España
 Ángeles Méndez (2011). “Cromatografía
liquida”. Obtenido en línea, el 23 de octubre
del 2017, en
http://quimica.laguia2000.com/general/crom
atografia-liquida
 Inmaculada Angurell, et al (2010).
“Cromatografía”. Obtenido en línea, el 23 de
octubre del 2017, en
http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/c
romatografia_fonament.html
 GIL, A. (2010).“Cromatografía liquida para
la composición y calidad nutritiva de los
alimentos”. Obtenido en línea, el 23 de
octubre del 2017, en
http://plinios.tripod.com/cromatografialiquida
.htm