Bioquímica

Aula 1 – 01/03
Enzimologia

A enzimologia é a ciência que estuda as enzimas e todos os demais fatores relacionados à sua
ação.
As enzimas são moléculas ou proteínas (formada por aminoácidos) que atuam como catalisadores
de reações específicas e que atuam em condições amenas de temperatura num ambiente reacional
favorável (pH, temperatura, concentração das enzimas, concentração do substrato, concentração dos
agentes inibidores, concentração de cofatores e força iônica).
O substrato é aquela substância que terá interação específica com o sítio catalítico também
chamado de sítio ativo, que é o local presente na molécula de enzima, que tem a capacidade de levar a
reação a cabo.
As proteínas, neste caso as enzimas, são moléculas com alto peso molecular, ou seja, são
macromoléculas com o peso molecular que pode variar de 15000 Daltons até vários milhões de Daltons.
Como a maior parte das reações que ocorrem no interior das células é catalisada por enzimas, elas
são assim conhecidas por biocatalisadores. Comparadas com outras reações catalisadas por catalisadores
não protéicos ou inorgânicos e efetuadas na temperatura ambiente, as enzimas apresentam maiores
velocidades de reação.
O estudo das enzimas tem passado por grandes revoluções desde que Büncher, em 1897, extraiu
enzimas ativas a partir de células vivas e, mais importante ainda: mostrou que tais substâncias também
podiam catalisar reações fora de sistemas vivos. Em 1926, Summer isolou e purificou moléculas de
enzimas e se descobriu que eram moléculas de proteínas, uma propriedade estabelecida anteriormente.

Nomenclatura das Enzimas

Com relação à nomenclatura das enzimas, não há uma regra que se aplique a todas elas. Em
geral, adiciona-se o sufixo –ase ao substrato sobre o qual ela atua (por exemplo, a ureiase que catalisa a
decomposição da uréia; a amilase que atua sobre o amido) ou ao nome da reação que está sendo
catalisada (por exemplo, álcool desidrogenase que catalisa a desidrogenização do álcool) mas há várias
exceções como o pepsina e a triptina que são enzimas digestivas, arenina que é uma enzima utilizada no
preparo de queijos (ver tabela 3.1 do Shüler).

Classificação das Enzimas

Há seis classes principais de reações que as enzimas catalisam que formam a base do sistema de
classificação do Ensyme Comission ou EC de códigos e nomes oficiais das enzimas. Vide tabela 3.1
Página 59 do Shüler.
 A classificação é:
a) OXIREDUTASES: são reações de oxidação/redução;
b) TRANSFERASES: transformação de grupos funcionais;
c) HIDROLASES: provocam reação de hidrólise;
d) LIASES: reação de adição nas duplas ligações;
e) ISOMERASES: reações de isomerização;
f) LIGASES: formação de ligações com quebra do ATP.
Uma outra característica das enzimas é que geralmente elas necessitam de cofatores para se tornarem
ativas. Os cofatores são substâncias não protéicas que se combinam com a molécula inativa (apoenzimas)
para formar o complexo cataliticamente ativo (holoenzimas ou enzimas).
Há duas variedades distintas de cofatores:
a) ÍONS METÁLICOS: cálcio 2+, magnésio, zinco, etc;
b) MOLÉCULAS ORGÂNICAS COMPLEXAS: ou coenzimas.
Em geral, os cofatores estão ligados por forças fracas em sítios específicos presentes na molécula de
enzima (ver tabela 3.2 Shüler).
Aula 02 – 03/03
A Ação das enzimas
As enzimas diminuem a energia de ativação da reação catalisada ao se ligarem ao substrato
formando o complexo enzima-substrato
substrato sem afetar a constante de equilíbrio. Os aspectos moleculares da
interação entre enzima e substrato ainda não estão completamente esclarecidos. Normalmente a interação
entre
tre enzima e substrato se dá por forças fracas como as de van der Waals e pontes de hidrogênio na
formação do complexo enzima-substrato.
substrato.

O substrato se liga em pontos específicos da enzima chamados de sítios ativos. O sítio ativo
apresenta uma configuração
ção tridimensional de tal modo que há uma perfeita (ou específica) com a
molécula de substrato. Então, podemos dizer que há um encaixe da molécula de substrato dentro do sítio
catalítico da enzima. Tal modelo é conhecido como chave-fechadura,
chave fechadura, sendo a enzima
enzim a fechadura e o
substrato a chave.
 As enzimas podem manter o substrato em certas posições e ângulos de tal modo a melhorar as
taxas da reação (ou velocidade). Isto é conhecido como “efeito de orientação”. Em algumas enzimas
informação do complexo enzima-substrato provoca uma pequena mudança na forma tridimensional da
enzima que também contribui positivamente na atividade catalítica. Exemplos: lisozima (lágrimas com
função bactericida) e carboxipeptidase. Assim, a catálise enzimática depende não somente da estrutura
primária da enzima (sequência de aminoácidos), mas também das estruturas secundárias, terciárias ou
quaternárias.
Logo, fatores que afetam essas estruturas: o pH, temperatura, concentração de sais (força iônica),
presença de solventes alteram a atividade catalítica da enzima pois promovem alterações no sítio catalítico
(sítio ativo). Normalmente, as enzimas atuam em condições amenas de temperatura e podem sofrer
desnaturação nas temperaturas mais elevadas e até mesmo nas temperaturas de congelamento. Por
desnaturação, entende-se pela perda das características originais da molécula ativa.
A velocidade de uma reação catalisada por uma enzima sofre um aumento com o aumento da
temperatura até um certo ponto e depois a velocidade diminui devido principalmente a desnaturação da
molécula com a perda progressiva dos sítios ativos, ou seja, há uma temperatura na qual a atividade
enzimática é máxima ou ótima para aquelas condições. A figura abaixo ilustra esquematicamente o efeito
da temperatura sobre a atividade enzimática.

Aula 03 – 08/03
Ação das Enzimas: Efeito do pH
O efeito da temperatura pode ser encontrado no item 3.3.5.2. No Shüler.
As enzimas como todas as proteínas são formadas por uma sequência de aminoácidos que
caracterizam a estrutura primária. Tais aminoácidos podem apresentar grupos iônicos que podem estar
carregados positivamente ou negativamente dependendo do pH em que a molécula de enzima encontra-se
dissolvida. Assim, o pH afeta os grupos presentes no sítio ativo e alteram a atividade enzimática pois
haverá uma alteração na configuração tridimensional do sítio ativo, o que irá interferir na atividade
enzimática. Logo, as enzimas são ativas apenas em faixas estreitas de pH e haverá um pH ótimo no qual a
atividade é máxima nas condições determinadas.
 Figura 1 - efeito do pH sobre a atividade enzimática: comportamento típico
Ver seção 5.6.1 Biotecnologia Industrial Volume 1;
Ver seção 3.3.5 Shüler.
Existe uma distribuição de carga elétrica na molécula. Temperatura e pH alteram a estrutura da
molécula.
Cabe lembrar que o pH do meio também pode alterar as características do substrato
s se este
possuir grupos ionizáveis.
Outros Fatores que Afetam a Ação das Enzimas
Vimos duas importantes variáveis que afetam a atividade enzimática, porém, além da temperatura e
do pH, outras variáveis devem ser observadas, pois podem provocar alterações
alterações na estrutura da molécula
de enzima e consequentemente alterar a interação enzima-substrato.
enzima substrato. Esses outros fatores são:
a) Forças fluidas como hidrodinâmicas, pressão hidrostática e tensões interfaciais.
b) Presença de agentes químicos.
c) Radiações (ultravioleta, ionizantes, infravermelhos, ultrasônica).
d) Presença de inibidores.

Cinética Enzimática
A cinética das reações enzimáticas é afetada por diversos fatores como pH, temperatura, presença
de substâncias químicas (agentes químicos), etc.
etc. Em termos cinéticos, as enzimas são classificadas em:
a) Enzimas clássicas: é quando a velocidade da reação apresenta uma relação assintótica com a
concentração de substrato, ou seja, obedecem o modelo cinético proposto por Michaelis-Menten.
Michaelis

 ∙ 

=
 + 
b) Enzimas regulatórias: são as demais enzimas que não obedecem a cinética clássica de Michaelis-
Menten. As enzimas regulatórias possuem dois tipos diferentes de sítios: um sítio catalítico (ou sítio ativo)
onde o substrato se liga e um sítio regulatório (não catalítico) onde se liga um regulador. Quando o
regulador se liga na molécula, provoca uma alteração no sítio catalítico o que altera as suas propriedades
cinéticas. Neste caso, o comportamento da velocidade versus a concentração do substrato é sigmoidal
(“S”).
Aula 04 – 10/03
Cinética Enzimática: Modelo Matemático
Um modelo matemático da cinética das reações enzimáticas com um único substrato foi primeiro
desenvolvido por V. C. R. Henri em 1902, e depois por L. Michaelis e M. L. Menten em 1913. A cinética
catalisada por uma enzima e um substrato com um comportamento clássico é conhecida como cinética de
Michaelis-Menten. O desenvolvimento do modelo se baseia no fato de que a solução de enzima tem um
número determinado de sítios ativos (finito) nos quais o substrato poderá se ligar. Nas altas concentrações
de substrato todos os sítios ativos estarão ocupados e dizemos que a enzima está saturada. O modelo
clássico descreve uma cinética de saturação que pode ser obtida a partir de um esquema reacional
simples que envolve a etapa reversível para a formação do complexo enzima-substrato (E.S) e a etapa
dissociativa do complexo E.S.
 / 
 +   .    + 
Assume-se que a formação do complexo E.S é rápida e que a formação do produto é irreversível. A
taxa de formação do produto P pode ser dada por:


= = 3. 

A variação na concentração do complexo E.S pode ser escrita como:
 . 
= 1 − 2!.  − 3. 

Como a enzima não é consumida na reação (catalisador), temos:
0 =  + . 
Michaelis e Menten, considerando um equilíbrio rápido entre enzima e substrato, definiram:
2 
= = $
1 . 
Como:
 = 0 − 
Logo:
0
.  =
$ + 
Km é a constante de dissociação do complexo E.S. Como:


= = 3. 

Logo:
0

=
$ + 
Foi definido que:

$%& = 30
Logo:

$%& '$. 

= =
$ +  $ + 
v= velocidade da reação
S=concentração do substrato
Vm=velocidade máxima da reação
Km=constante de Michaelis-Menten
A última equação descrita é conhecida como modelo clássico ou modelo de Michaelis-Menten e
ilustra a influência da concentração do substrato sobre a velocidade da reação. Graficamente, o modelo de
Michaelis-Menten pode ser representado:
 Figura 2 - Representação gráfica do modelo clássico (M.M) que mostra o efeito da [S] na velocidade da
reação enzimática

Análise do Modelo
Podemos fazer esta análise considerando dois casos:
a) Altas concentrações de substrato. Neste caso, pode-se observar:

≅
$%&
Ou seja, a reação enzimática se comporta como se fosse de ordem zero;
b) Concentrações muito baixas de substrato. Neste caso, a reação se processa como se fosse de
primeira ordem. Ou seja:

≅ 
Observação 01: a concentração de enzima afeta a velocidade da reação e aumentando-se a
concentração da enzima, aumenta-se proporcionalmente a velocidade máxima da reação.
Observação 02: Km, conhecida como constante de Michaelis-Menten, é um indicativo da afinidade da
enzima pelo substrato, ou seja, quanto menor o Km, menor a afinidade (maiores taxas).
Observação 03: Km corresponde a concentração de substrato na qual a velocidade de reação é metade
da velocidade máxima.
 Determinação dos Parâmetros Cinéticos Vmax (Vm) e Km
O modelo obtido é um modelo geral com dois parâmetros cinéticos importantes que são a
velocidade máxima da reação (Vm) e a contante de Michaelis-Menten (Km). Cada enzima e seu substrato
possui valores distintos de Vm e Km. Para que esse modelo tenha utilidade prática e que possa ser
aplicado numa reação particular, torna-se necessário o conhecimento dos mesmos para se resolver a
equação de projeto do reator.
Para se obter estes parâmetros, devemos ter dados experimentais, por exemplo a partir de um
pequeno reator batelada, no qual se adiciona uma quantidade conhecida de substrato [S0] e de enzima
[E0]. A partir do tempo inicial, se acompanha a concentração do produto ou a concentração do substrato
com o transcorrer do tempo, assim, obtém-se a curva P versus t, ou S versus t.

Determina-se as velocidades em t=0 por:



= | = 0



= − | = 0

Este valor para as velocidades corresponde ao valor de E0 e S0. Desta forma, é possível gerar vários
pares de V e S que são pontos do gráfico v versus S.
Esses pares de V e S convenientemente arranjados e ajustados ao modelo nos permitirá a
determinação dos parâmetros

Aula 05 – 15/03
Determinação de Vm e Km
Método 1 – método de Lineweaver-Burk (duplo recíproco)
Neste método toma-se o recíproco de ambos os membros da eq. De Michaelis-Menten de tal modo que
: 1/v versus 1/s apresenta uma relação linear do tipo y=ax+b com coeficiente angular “a=Km/Vm” e
coeficiente linear “b=1/Vm” ou seja:
1  Km  1 1 (01)
=  +
v  Vm  S Vm
 Logo com os pares 1/v e 1/s fazemos uma regressão linear e daí tira-se
tira se o coeficiente linear e calcula-se
calcula
Vm e então determina-se Km pois o coeficiente angular obtido na regressão linear também é conhecido.

Figura 3. Gráfico do modelo de Linewaver-Burk

Esse método 1 deixa as variáveis dependente (v) e independente (S) bem separadas. Os melhores
valores dos dados experimentais nas concentrações mais altas de substrato ou próximos a Vm ficam então
aglomerados próximoss à origem enquanto que os dados com medições menos precisas ficarão dispersos
mais longe da origem e terão um grande peso no cálculo do coeficiente angular. Sendo assim, neste
método Km tem baixa precisão, já Vm tem boa estimativa neste método.
Devido a este fato, outros métodos foram desenvolvidos para se determinar Vm e Km.

Método 2 – Método de Eadie-Hoftee

Hoftee
Este método torna linear a relação entre v x v/s partindo da eq. De Michaelis-menten,
Michaelis sendo –Km o
coeficiente angular e Vm o coeficiente linear.
v (02)
v = Vm − Km
S

Figura 4. Gráfico do método de Eadie-Hofstee

 Neste método, ambas as coordenadas contem a variável “v” que está sujeita a grandes erros
experimentais.

Método 3 – Método de Hanes-Woolf

Woolf
Relaciona (S/v x v):

S  1  Km (03)
= S +
v  Vm  Vm

Graficamente:

Figura 5. Gráfico do modelo de Hanes-Woolf

Cada um desses métodos possuem “pontos fracos” seja no cálculo de Vm ou de Km.

Método 4 – Método Gráfico ou direto de determinação de Vm e Km

Existe também o chamado método gráfico ou direto. Neste caso os pares v e S são colocados
diretamente num gráfico :

Figura 6. Gráfico do método gráfico

 Exemplo (7.7 – Fogler)
Determine os parâmetros de Michaelis-Menten Vm e Km para a reação de decomposição da ureia pela
uréase. Sabendo que os dados cinéticos são conhecidos e mostrados na tabela abaixo:
S
0,2 0,02 0,01 0,005 0,002
(kmol/m³)
V
1,08 0,55 0,38 0,2 0,09
(kmol/m³.s)

Usar os 3 métodos e comparar.

1) Y=0,75+2,07.10-2X

1/Vm=0,78 Vm=1,33
Km/Vm=2,07.10-2 km=2,76.10-2

2)y=1,2216+2,44.10-2X
Km=2,44E-2
Vm=1,2216

3)1,9846E-2+0,826X=y

Vm= 1,2106
Km=1,40E-2
Aula 06 – 17/03
Cinética Enzimática (continuação)
Obs: (cap. 5 do Fogler – método numérico-pg216-derivada no ponto inicial)

Reações enzimáticas na presença de inibidores

Quando certas substâncias estão presentes numa reação enzimática e provocam uma diminuição nas
taxas da reação nós dizemos que tais substâncias inibem a reação enzimática. Essas substâncias são
chamadas inibidores e geralmente sua presença deve ser evitada no meio reacional. Temos inibidores que
se ligam irreversivelmente à molécula de enzima e anulam a atividade enzimática, ou seja, a enzima perde
sua função catalítica. Dentre esses inibidores temos os íons de metais pesados tais como chumbo,
mercúrio, cádmio, etc. Cabe lembrar que esses íons podem ser removidos com o uso de agentes
quelantes tais como o EDTA e Citrato. Outros tipos de inibidores são ditos reversíveis, pois se dissociam
mais facilmente após se ligarem a enzima. Dentre esses inibidores nós temos:
 1 – Inibidores Competitivos
2 – Inibidores Não competitivos
Obs: Tabela 3.7 (Bailey Ollis – pg. 122) Classificação de inibidores
Além desses inibidores temos outros que se ligam ou ao substrato ou ao complexo ES e que também
irão interferir negativamente sobre a atividade enzimática.
Definição - Atividade Enzimática: Unidades de atividade enzimática designa a quantidade de enzima
que fornece certa quantidade de atividade catalítica sob determinadas condições padronizadas (pH,
Temperatura, Concentração de substrato e força iônica) para aquela enzima em particular. Por exemplo
uma unidade de atividade de glicoamilase é definida como a quantidade de enzima a qual produz um
micromol de glicose por minuto numa solução de amido a 4% , pH 4,5 e 60°C.
1) Cinética enzimática na presença de inibidores competitivos
Um inibidor competitivo compete com o substrato para se ligar ao sítio catalítico da enzima. Geralmente
são substâncias que possuem semelhança com o substrato. Um mecanismo proposto para cinética
competitiva é:
E+S↔ES→E+P (01)

E+I↔EI (02)

A partir desse mecanismo pode-se chegar na seguinte expressão que descreve a reação enzimática
quando um inibidor competitivo está presente no meio reacional.
V mS (03)
v=
 I 
K m 1 + +S
 K i 

 I  (04)
K mAp = K m 1 + 
 Ki 
Vm S (05)
v=
K mAp + S

Graficamente:
 Figura 1. Curva com e sem inibidor Michaelis Menten(Sem inibidor I=0(azul);Com inibidor I>0(vermelha))
Nota-se que o inibidor competitivo não altera a velocidade máxima da reação quando comparada
aquela sem inibidor competitivo (I=0).

Figura 2. Gráfico Lineweaver-Burk com e sem inibidor

Um exemplo prático de inibição competitiva pode ser observado no caso do antibiótico sulfanilamida. A
sulfanilamida tem estrutura molecular similar ao ácido p-aminobenzóico que é utilizado pela célula para
produzir um composto vital chamado ácido fólico. A sulfanilamida bloqueia esta rota bioquímica da bactéria
e acaba por mata-la.
Obs: Os efeitos negativos do inibidor competitivo sobre a cinética enzimática podem ser atenuados
promovendo-se a reação em altas concentrações de substrato visto que nas altas concentrações de
substrato as taxas se aproximam da velocidade máxima que não é alterada na presença do inibidor
competitivo.
2) Cinética enzimática na presença de inibidor não competitivo
 Os inibidores não competitivos podem se ligar ou a enzima ou ao complexo ES o que prejudicará a
formação do produto, neste caso o mecanismo proposto é:
E+S↔ES→E+P (06)

E+I↔EI↔EIS (07)

ES+I↔EIS (08)

Vmap S Vm (09)
v= onde, Vm =
ap

Km + S  I 
1 + 
 Ki 

Neste caso Km não é afetada porem a uma diminuição em Vm e consequentemente na velocidade da

reação.
Graficamente:

Figura 3. Curvas com inibidores não competitivos (a)Michaelis-Menten (b) Lineweaver-Burk

Observando o modelo, nota-se que, o inibidor não competitivo diminui a velocidade máxima da reação e
assim a sua presença no meio reacional sempre dará menores taxas para reação, quando comparada com
a reação sem o inibidor não competitivo.

Inibição pelo substrato

Muitas reações enzimáticas são inibidas quando a concentração de substrato é elevada, ou seja, a
partir de uma concentração crítica de um substrato, um aumento na concentração do substrato provoca
uma diminuição nas taxas, neste caso o mecanismo proposto é:
 E+S↔ES→E+P (10)

ES+S↔ES2 (11)

Vm S (12)
v=
S²
K map + S +
K si

Graficamente:

A inibição é dominante nas altas concentrações de substrato e pode-se mostrar que Scritico que é a
concentração de substrato a partir da qual a velocidade começa a diminuir.

Aula 07 – 22/03
(3.34 Shuler – inibição pelo substrato)

Determinação de Kmap, Ksi e vm

Neste modelo, para se determinar tais parâmetros, devemos fazer algumas considerações:
1- Faz-se a reação com baixas concentrações de substrato. Nessa situação S2/Ksi«1 e o efeito
inibitório do substrato praticamente não é observado, e a equação da taxa pode ser escrita como:



= +,

*1 +  -

Logo, podemos usar um dos métodos de linearização (L.B, H.W. e E.H) e assim se obtém Kmap e vm
2- Para se obter o Ksi, obtém-se dados cinéticos com elevadas concentrações de substrato onde a
inibição é predominante. Neste caso Kmap/S2«1



=

.1 +  1
/0

Assim, linearizando a equação a cima por um dos métodos vistos, e com os pares v e S (S>critico),
obtém-se
Ksi e vm.
Exemplo 1: a hidrólise da uréia pela uréase sofre com um tipo de inibição. Os seguintes dados foram
obtidos para esta reação de hidrólise:

S=0,2M 12
1.v-1 I 0,51 0,00
0,22 0 27
0,33 0,00 0,76 0,00
 44
0,88 0,00
61
1,10 0,00
8
1,15 0,00
93

S=0,0
2M
1.v-1 I
0,68 0
1,02 0,0
013
1,5 0,0
022
1,83 0,0
032
2,04 0,0
037
2,72 0,0
044
3,46 0,0
057
 a- Determine a constante de MM:
b- Qual tipo de inibidor esta presente?
c- Qual a constante de inibição?
Ex: foram obtidos os seguintes dados cinéticos para uma reação enzimática:
V(E0=0,015 S(g.L- V(E0=0,00875
-1 1)
g.L ) g.L-1)
1,14 20
0,87 10
0,7 6,7
0,59 5
0,50 4,0
0,44 3,3
0,39 2,9
0,35 2,5

Aula 08 – 24/03
Gráfico de LB com inibição de substrato ****** fazer
Projeto de reatores enzimáticos
Como vimos, o modelo mais utilizado para representar a velocidade de uma reação enzimática é o
modelo clássico (ou modelo de MM) ou outros modelos que se baseiam no modelo clássico e que
descrevem situações particulares, como por exemplo fenômenos de inibição.
Assim,basta aplicar a equação da velocidade na equação de projeto do reator e assim resolvendo a
equação de projeto juntamente com a equação da velocidade, nós podemos determinar por exemplo o
tempo para que a reação atinja uma dada conversão ou o volume do reator necessário para produzir uma
certa quantidade de produto.

1- Reatores batelada ou descontínuos

[ENTRA] - [SAI] + [REAGE] = [ACÚMULO]

−
=

2 ./
Vamos considerar
=  34/ na equação acima, e as condições iniciais S(t=0)=S0 e S(t)=S, integrando
3

obtemos:
7
 . ln + 87 − 9 =
 . 

Logo, a equação acima nos permite calcular implicitamente o tmepo necessário para que S0 diminua até
um valor de S qualquer. Pode-se escrever em termos de conversão:
 1
 . ln + 7 & =
 . 
1−&
2- Reatores contínuos agitados (CSTR)
Q=vazão volumétrica(Qe=Q=cte)
Se=[S] na alimentação
Pe=[P] na alimentação (Pe=0)
V=volume reacional (cte)

[ENTRA] - [SAI] + [REAGE] = [ACÚMULO]


:. ; − :.  −
. ' =
.

 :

. = 8 − 9
 ' ;
Definindo D=Q/V=tava de diluição temos:

= <8; − 9 −


No estado estacionário:

= <8; − 9
Considerando a equação da taxa de MM obtemos:

 &
=  . 1 + ; &
< 1−&

Aula 09 – 29/03
Reatores enzimáticos (continuação)

-Reatores batelada
1
$. ln = > + ?. @ = '$. A
1−&
-Reatores CSTR
'$ @
= $. = > + !. @
< 1−@

-Reatores PBR (com enzimas imobilizadas)

'B. C
!. @ = $. ln81 − @9 + '$.
:
Onde x=conversão
Se= [S] na alimentação
C= porosidade do leito = '!D/'B
Q é a vazão volumétrica
 'B⁄:= tempo de residência
*Referência: Gacesa e Hubble-Tecnologia de enzimas capítulo 4.

Determinação dos parâmetros cinéticos Vm e Km utilizando os dados obtidos do reator

1- Reatores batelada
Neste caso a Equação 1 pode ser reescrita como:

1 1 '$ ?@
. ln = >= −
 1−@ $ $. 

/I
Esta é uma Equação da reta do tipo y=b-ax, onde y é dado por F . ln . GH1 e x é , logo . F . ln . GH1 X
.F
/I J
é uma reta com coeficiente angular -1/km e com coleficiente linear . Assim, com uma regressão linear,
.F

calculamos o km e conhecendo km e o coef, linear determinamos o Vm.

-Reatores CSTR
A Equação 2 pode ser reescrita como
'$ @
!.  = − $ = >
< 1−@
Novamente temos uma equação da reta (S/X) vs. (X/1-X), logo, faz-se vários experimentos com
diferentes vazões que na alimentação e coleta-se os dados no regime estacionário para uma dada vazão,
reorganiza-se os dados na forma linear acima e faz-se a regressão linear e determina-se Km e Vm.
Exercício 1- 7.8 do Fogler) Considere a reação de decomposição da uréia pelo ureiase vista
anteriormente. Considere essa reação efetuada em um reator batelada sobre as mesmas condições para
uma dada concentração de enzima utilizada para obter os dados vistos no exemplo.
Pergunta-se:
a) Determine o tempo necessário para atingir uma conversão de 90 % quando a concentração inicial da
uréia for Cao=0,02 mol/L.
b) Determine o tempo necessário para atingir esta mesma conversão no caso de a concentração da
enzima ser o dobro da utilizada anteriormente.

Exercício 2) Fazer o exercício 7-11 do Fogler.

Cinética da desativação enzimática

Como vimos, as enzimas são moléculas protéicas de configuração complexa que atuam como
catalisadores que são sensíveis as condições físico-quimicas ambientais, ou seja, podem sofrer
desnaturação. No decorrer das reações enzimáticas a desativação ou desnaturação da enzima ocorre com
uma dada velocidade (taxa) que dependera da estrutura da molécula e das condições do processo. Logo,
a quantidade de enzima ativa responsável pela transformação do substrato em produto pode diminuir
consideravelmente durante a reação. Assim, torna-se importante conhecer a cinética da desativação
enzimática.
Um modelo proposto de desativação enzimática é o da desativação irreversível de primeira ordem
com relação à enzima ativa (Ea), ou seja:
K
%  L
Onde kd é a constante de desativação. Como é uma desativação de primeira ordem, temos:
−%
= . %

Com
%|FM7 = I
Logo:
%89 = %?! GNK.F (2)
A Equação 2 mostra que a concentração da enzima ativa diminui exponencialmente com o tempo.
Logo este fenômeno de desativação pode ser levado em conta nos modelos cinéticos.
Na obtenção de MM, vimos que logo quando a concentração de enzima ativa diminui, devido à
desnaturação irreversível é de se esperar que a velocidade máxima também diminua.
'$ = %89
'$ = I ! GNK.F
'$89 = '$. ! GNK.F (3)
A estabilidade das enzimas pode ser dada pelo tempo de meia vida  / , ou seja, o tempo necessário
para que a atividade enzimática seja reduzida para a metade, ou seja, o tempo de meia vida é dado por:
OP 89
 / = NK
(4)

Exercício 3) Utilizando um reator batelada, obter uma equação considerando a desativação enzimática
de primeira ordem.

Aula 10 – 31/03
Modelo cinético para enzimas regulatórias
SE APLICA A DADOS QUE SE COMPORTEM DE FORMA SIGMOIDAL
J /Q K/

=  34/ Q = − KF (1)
3

n= coeficiente de cooperatividade
n>1 cooperatividade positiva
n<1 Cooperatividade negativa
Representação gráfica do modelo (1)
 J /Q
Determinação de n: temos
=  34/ Q
3

2 /Q
Logo: J = 
3 4/
Q
3

Assim:


ln = > = R SR89 − SR8 9
' −

2
Obtêm-se o gráfico linearizado de ln .J 1 versus SR89, obtendo por regressão os parâmetros n e Km.
3 G2

IMOBILIZACAO DE ENZIMAS (REF SHULER 3.4)

Vimos até o momento a reação enzimática com as enzimas livre, isto é, tais moléculas tinham a
liberdade de se movimentar por todo o volume reacional o que traz algumas desvantagens como por
exemplo a instabilidade, rápida perda da atividade catalítica e também a reutilização já que separá-las do
meio após a reação teria altos custos, logo também teremos a contaminação do produto com as enzimas.
A imobilização de enzimas refere-se a restrição da mobilidade da molécula num dado espaço. A
imobilização de enzimas traz inúmeras vantagens tais como a sua reutilização e eliminação dos processos
de recuperação e purificação da enzima. Também, a imobilização pode fornecer um ambiente melhor para
a atividade enzimática o que pode conferir uma maior estabilidade e faixas mais amplas de pH e
temperatura de ação. Como, as enzimas são caras a reutilização do catalisador será vital em muitos
processos. Com a imobilização a pureza do produto é melhorada e também diminui os problemas com
tratamentos de efluentes, ainda as enzimas imobilizadas poderão sofrer menores interferências de
inibidores ou ativadores.
A enzima livre normalmente é imobilizada em um suporte inerte, como por exemplo vidro poroso, sílica,
entre outros que veremos a seguir. O suporte pode ser também ser chamado de matriz e é onde as
enzimas ficaram “grudadas”. Alem de inerte, ou seja, não podem sofrer decomposição física, química ou
bioquímica nas condições do processo, também devera ser obviamente um suporte insolúvel.
 O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um bio catalisador com atividade e estabilidade
que não sejam afetadas durante o processo( não apenas a reação em si mas o bombeamento em si entre
outros) em comparação com sua forma livre. As enzimas também podem ser imobilizadas entre
membranas semipermeáveis, neste caso haverá um processo a aquele que ocorre para as enzimas intra
celulares.
Métodos de imobilização
Os principais métodos de imobilização são ilustrados na figura abaixo, onde temos os dois principais
que são o aprisionamento das moléculas ou a imobilização em superfícies, seja por adsorção das enzimas
ou a imobilização por ligação covalente das moléculas.
Figura(3.16 Shuler, pg 79)
Método de Aprisionamento de Enzimas
O aprisionamento de enzimas consiste no enclausuramento de moléculas de enzima em um pequeno
volume. Neste caso nos temos o aprisionamento em géis ou polímeros e também as moléculas poderão
ficar aprisionadas entre membranas incluindo a micro encapsulação. A imobilização por aprisionamento
pode ser efetuada utilizando materiais poliméricos como por exemplo o alginato de cálcio (cálcio o sódio) o
Agar, k-carragena, géis de poli-acril-amida e colágeno. Neste caso mistura-se uma solução com enzimas
livres e polímero antes que a reação de polimerização seja efetuada, garantindo que as moléculas de
enzimas fiquem aprisionadas na rede polimérica após a reação de polimerização. Também para o
aprisionamento podem ser utilizadas membranas como as de nylon, celulose, polisulfonas e poliacrilatos. É
importante que os poros da membrana sejam capazes de reter as moléculas de enzima que possuem alto
peso molecular, mas que permitam a passagem de compostos com baixo peso molecular como do seu
substrato e produto.
O aprisionamento entre membranas embora possua algumas vantagens da imobilização já
mencionadas também apresenta algumas limitações como por exemplo limitações difusionais e surgimento
de um micro ambiente desfavorável e também muitas das moléculas aprisionadas podem “escapar” para o
ambiente externo contaminando o produto. Para o caso das limitações difusionais (fenômenos intrínsecos
da transferência de massa) deve-se trabalhar o diâmetro da partícula ou o diâmetro do poro.
Aula 11 – 05/04
Imobilização Superficial
As moléculas de enzima podem ser imobilizadas sobre a superfície de materiais que são chamados
de suportes ou matrizes. Temos dois tipos principais de imobilização superficial.
a) Imobilização por adsorção
b) Imobilização por ligações covalentes
Imobilização por Adsorção
A adsorção refere-se á ligação de moléculas de enzimas sobre a superfície de um suporte por
forças fracas, por exemplo, as de Wan der Waals. O sítio ativo da enzima neste caso, da molécula
adsorvida, normalmente não é afetado e a molécula retém a atividade após a adsorção. Uma desvantagem
da imobilização por adsorção é o fenômeno da dessorção das moléculas, principalmente na presença de
forças hidrodinâmicas elevadas ou por alterações no microambiente. Quando o fenômeno da dessorção
das moléculas torna-se um problema, resolve-se promovendo um conjunto de ligações cruzadas (cross-
linking) das moléculas adsorvidas, o que pode estabiliza-las e aprisiona-las sobre a superfície do suporte.
O cross-linking das moléculas pode ser efetuado utilizando-se glutaraldeído. Entretanto, o so do
glutaraldeído poderá desnaturar algumas moléculas.
Dentre os suportes ou matrizes utilizados para adsorver as enzimas temos materiais inorgânicos
como: alumínio, sílica, vidro poroso (CPG), cerâmicas, terra diatomácea, argilas, entre outros. Também
existem matrizes orgânicas formadas por celulose, por exemplo, CMC (carboximetilcelulose) e DEAE
celulose (dietilaminoetil), amido, carvão ativado e resinas de troca iônica comerciais (que foram
otimizadas) como a amberlite, Sephadex e Dowex.
As superfícies destes materiais normalmente precisam passar por um pré tratamento (ativação) que
pode ser químico ou físico para que a mobilização por absorção seja efetuada.
Imobilização por Ligação Covalente
É quando se promove a retenção das moléculas sobre a superfície de um suporte por ligações
covalentes. Isto é efetuado quando certos grupos funcionais tais como grupos amino, carboxílicos,
hidroxilas e sulfidrilas interagem covalentemente com o suporte. Obviamente, tais grupos não podem ser
do sítio ativo.
Para se evitar a perda do sítio ativo da enzima na imobilização covalente promove-se o bloqueio do
sítio ativo utilizando, por exemplo, um inibidor competitivo, que garante proteção ao sítio ativo. O inibidor é
descartável após a inibição covalente. Os grupos funcionais do material suporte são normalmente ativados
utilizando-se reagentes químicos como por exemplo, brometo de cianogênio (ativa grupos hidroxilas), (...).
Os grupos ligantes presentes na molécula de enzima são normalmente os grupos ou resíduos laterais dos
aminoácidos (...) os grupos amino e carboxílico presentes em ambas as extremidades da cadeia
polipeptídica.
Aula 12 – 07/04

(CONT.) imobilização enzimas

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Tabela 3.3 do shuler: “isso não cai na prova, despenca!” (piadinha idiota do Lucenae Cerevisae)
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Estudar:

Suportes para imobilização de enzimas?

Como é feita a imobilização por adsorção?

Cap. 6 –Tecnologia de lãs enzimas – Gacesa e Hubble
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
 Além do glutaraldeído podemos efetuar as ligações cruzadas entre as moléculas de enzima (cross-link)
utilizando a bis-diazobenzidina e o ácido 2,2-dissufônico. Quando as moléculas em solução são
submetidas a esses agentes formar-se-á um agregado de moléculas insolúvel. Para se fazer o cross-
linking de moléculas de enzima adsorvidas, o suporte (adsorvente) deverá ser impregnado com solução da
enzima de tal modo a preencher todos os poros, em seguida deverá ser submetido aos agentes cross-
linking (normalmente glutaraldeído). Mas uma vez quando se faz as ligações cruzadas entre enzimas
haverá uma perda significativa da atividade bem como severas limitações difusionais (molécula tem
dificuldade de passar pela rede e reagir).
Características desejáveis para o suporte ou matriz visando à imobilização

O tipo de material suporte mais indicado para uma dada imobilização vai depender da enzima e da
aplicação particular. Os dois principais critérios usados na seleção de um material suporte são:
1. A capacidade ligante do suporte, ou seja, o número de grupos funcionais, a densidade de carga, a
porosidade e hidrofobicidade do suporte.
2. A estabilidade e retenção da atividade enzimática, o qual dependerá dos grupos funcionais do
suporte e das condições microambientais. Se a imobilização provocar alterações conformacionais na
enzima ou se grupos reativos envolvidos na imobilização estiverem no sítio ativo com certeza haverá perda
de atividade. Cabe lembrar que normalmente as moléculas imobilizadas ganham maior estabilidade ou até
mesmo aumento de atividade. Também durante a imobilização a molécula de enzima poderá ter seu sítio
ativo orientado de tal forma que impedirá o acesso do substrato (efeito estéril).
A figura abaixo ilustra algumas consequências da imobilização das enzimas

Figura 7. Imobilização de enzimas

 Normalmente enzimas cujo substrato seja de alta massa molecular terá sua atividade reduzida
após a imobilização o que ocorre em menor extensão para as enzimas cujo substrato possui baixa massa
molecular. Isto ocorre principalmente devido a impedimentos estéricos. Por exemplo, substrato de alto
peso molecular como a caseína e o amido, cujo peso molecular é comparável ao das enzimas podem não
ser capazes de atingir o sítio ativo da molécula da enzima imobilizada.
A imobilização normalmente afeta a estabilidade térmica das enzimas, em geral a estabilidade
térmica melhora já que haverá a presença de barreiras difusionais térmicas e menor agitação e
deformação das moléculas que se encontram imobilizadas.

Também a estabilidade com relação ao pH normalmente aumenta após a imobilização.

 Resumindo: Quando a enzima é imobilizada haverá mudanças na atividade comparadas com a enzima
livre. Isto pode ser devido a diversos fatores como, por exemplo, mudanças conformacionais da molécula
após a imobilização e também a imobilização poderá dificultar o acesso do substrato ao sítio ativo da
enzima. Também poderemos ter efeitos de partição que nada mais é que as diferenças de concentração
(de enzima, substrato, cofatores, etc) entre o seio do meio reacional e a película ou filme estagnado que se
encontra ao redor da partícula. E assim, essas diferenças implicarão em diferentes atividades.
Também, a imobilização promoverá o surgimento de efeitos difusionais de Transferência de massa, que
pode ser de 2 tipos: os internos referentes aos poros do suporte e os externos referentes a presença da
película estagnada ao redor da partícula. Assim, se a velocidade da reação for maior que a velocidade de
difusão do substrato na película, a concentração do substrato na superfície será menor que na solução. A
espessura desta película poderá depender das condições de fluxo hidrodinâmico ao redor da partícula.
A resistência interna à T.M. também aparece para as enzimas imobilizadas em partículas porosas.
Novamente a velocidade da reação poderá fazer com que a concentração do substrato diminua já que a
difusão poderá ser mais lenta. A velocidade observada dependerá da difusividade do substrato, da
porosidade da partícula, da concentração de substrato no seio do líquido e da cinética enzimática.
Aula 13 – 12/04
Aplicações da catálise enzimática (= uso das enzimas)
As enzimas utilizadas pelas indústrias químicas e farmacêuticas provem em sua grande maioria de
processos fermentativos onde se cultiva um determinado micro-organismo num processo fermentativo que
conduz a enzima de interesse. Também algumas enzimas podem ser obtidas de tecidos de plantas e/ou
animais.
Dentre as de utilização industrial as proteases são as mais utilizadas pela indústria representando cerca
de 60% do mercado de enzimas. As proteases podem ser utilizadas pelas indústrias de alimentos,
panificação, fabrico de queijos em amaciantes de carne e também nas indústrias de detergentes, pois sua
adição melhora a eficiência na remoção de manchas proteicas.
As lípases também são importantes pois hidrolisam lipídios produzindo ácidos graxos e glicerina e são
utilizadas também na industria de detergentes, de processamento de óleos vegetais, em laticínios, e na
produção de biodiesel.
As amilases são utilizadas na hidrólise do amido sendo as mais importantes a α-amilase, a β-amilase e
a glico-amilases. São utilizadas na formação de detergentes, na indústria têxtil para desengomação de
tecidos, na produção de açucares pela sacarificação de amidos.
Outras enzimas importantes são as pectinases utilizadas nas indústrias de suco de frutas e indústrias
de vinhos, pois melhoram o rendimento, reduzem a viscosidade e a turbidez.
As celulases (na verdade um complexo enzimático) são usadas na hidrólise da celulose e são utilizadas
por algumas indústrias de processamento de cereais, produção de álcool a partir de resíduos ligno-
celulósicos como palhas e cascas de cereais cuja tecnologia está em desenvolvimento.
 Dentre o uso médico, as enzimas podem ser utilizadas em diagnósticos como, por exemplo, o uso da
glicose oxidase na determinação no nível de glicose do sangue na urina. Também podem ser utilizadas em
terapias, como por exemplo a tripsina, uma enzima digestiva que pode ser utilizada pro pessoas que
tiveram o estômago removido(por câncer). Também a lisozima que é utilizada como bactericida, pois
hidrolisa a parede celular de bactérias gram-positivas.
Outra importante aplicação da catalise enzimática no campo médico e que tem salvo milhares de vidas
no mundo é o uso da estreptoquinase em conjunto com o TPA (Tissue Plasminogen Activatar) utilizada na
dissolução de coágulos presentes nas artérias de recém infartados.
Outra importante aplicação industrial das enzimas é a conversão do fumarato para aspartato utilizando
a aspartase. O aspartato é utilizado para produzir o aspartame um adoçante (edulcorante) de baixa caloria.
Também, outra aplicação é a conversão da glicose para frutose pela enzima glicose isomerase. A frutose é
cerca de 1,5 vezes mais doce que a glicose, sendo bastante utilizada na industria de refrigerantes e sucos.
Enfim, as enzimas tem inúmeras aplicações incluindo o desenvolvimento de bio-sensores capazes de
monitorar substâncias esprecificas em um meio complexo.
TABELA 3.5 shuler – enzimas de importância industrial.
Cap. 7 do Gacesa
Xerox
Considerações sobre a utilização das enzimas

O critério de viabilidade econômica de um processo está estritamente relacionado com as normas

legais tanto para as operações que fazem parte do processo, como para a pureza do produto final. Muitas
das restrições legais se referem a assuntos de segurança que afetam os equipamentos usados no
processo bem como o direcionamento do produto final. No caso de materiais biológicos e bioprodutos a
diversas áreas que apresentam risco potencial com efeitos nocivos:
1. Microbiológica
2. Toxidade química
3. Toxidade relacionada com a atividade enzimática
4. Reações alérgicas;
Os problemas oriundos da atividade microbiológica dependerão do micro-organismo selecionado como
agente produtor e deverão refletir-se nas medidas de segurança incorporadas no processo de produção.
Os produtos destinados ao consumo humano necessitam cumprir todos os critérios de pureza que
assegurem nenhum risco de contaminação química ou microbiológica.
A toxidade química geralmente advém de substâncias produzidas no metabolismo secundário dos
micro-organismos, como por exemplo, as mico toxinas e as aflo toxinas, a produção de metanol na
fermentação alcoólica, etc.
A toxidade relacionada com a atividade enzimática pode ser vista, por exemplo, no caso das enzimas
proteolíticas utilizadas na produção de detergentes. A inalação do pó pelos operadores pode provocar
lesões nos brônquios pulmonares com graves consequências. Logo, deve-se tomar todo cuidado na
manipulação destas substâncias especialmente as que se encontram na forma de pó, que podem ser
inalados, ou de líquidos concentrados que podem causar lesões tipo cáusticas na pele e mucosas. Logo o
contato deve ser evitado. Também o contato com material biológico estranhos pode causar uma resposta
imunológica que pode se agravar ao longo do tempo provocando uma resposta alérgica que poderá ser
grave e em alguns casos fatal dependendo do organismo.

Aula 14 – 14/04
Processos fermentativos

Figura 8. Processo Fermentativo genérico

Um processo fermentativo envolve um conjunto de operações e técnicas envolvidas na

transformação de um dado substrato num produto de interesse econômico e estas transformações serão
efetuadas por um micro-organismo especialmente selecionado para aquela transformação em particular a
nível industrial. Denominamos fermentação estas transformações efetuadas sob determinadas condições
controladas de pH, temperatura, de nutrientes, de aeração, etc. Isso se processa dentro de um bio-reator
também conhecido como fermentador ou dorna de fermentação. A nível industrial esses fermentadores
apresentam de dezenas a milhares de litros.
 O sucesso de um dado processo fermentativo depende muito da correta definição de quatro pontos
básicos:
1. A escolha do micro-organismo;
2. A formulação do meio de cultura;
3. A forma de condução do processo fermentativo (contínuo, batelada, etc);
4. As etapas de recuperação do produto.
Na verdade esses 4 pilares de um processo fermentativo interagem enormemente sendo necessário
defini-los de forma conjunta levando em consideração os aspectos bioquímicos e econômicos o que pode
ser complexo.
Os micro-organismos devem reunir um conjunto de características de forma a serem indicados para
uma aplicação industrial. Tais características desejáveis veremos adiante.
O meio de cultura e a matéria prima utilizada para obtê-lo também deve possuir características para ser
utilizado numa aplicação industrial como, por exemplo, ser de fácil obtenção e exigir o mínimo de
tratamentos prévios e obviamente conter o substrato que será transformado no produto.
Com relação às formas de condução do processo fermentativo estas podem ser dimensionadas para
operação contínua ou descontínua (batelada), cada uma com suas características próprias de controles
físico-químicos. Cabe lembrar que cada uma delas apresenta vantagens e desvantagens que veremos
mais adiante.
Com relação a recuperação do produto vai depender das características deste produto, a elaboração de
estratégias com a seleção de um conjunto de operações unitárias a serem utilizadas numa sequencia até a
obtenção do produto final na forma desejada, que deverá obedecer normas legais dependendo de sua
aplicação, por exemplo, consumo humano ou animal. Além disso, não se pode esquecer dos tratamentos
dos efluentes produzidos de tal modo que a produção tenha maior impacto possível.
Todas as etapas que se seguem após a fermentação são denominadas de tratamentos downstream, e
são da mais alta importância para o rendimento final do produto. Em geral deve-se estabelecer o menor
número de operações downstream para maximizar o rendimento do produto. Além dos aspectos
econômicos envolvidos.

Substratos e matérias primas para o processo de fermentação industrial

A maioria dos substratos utilizados nas fermentações industriais é direta ou indiretamente originado de
produtos agrícolas, em geral, os processos de fermentação tem a vantagem de serem versáteis com
relação a matéria prima, adaptando-se como seja conveniente de acordo com a disponibilidade e custo da
matéria prima.
Em geral, a matéria prima para uso industrial deve possuir maior número das seguintes características
desejáveis:
 1. Ser o mais barato possível, ou seja, ser de fácil obtenção e exigir pouco o nenhum tratamento
prévio;
2. A matéria prima deve conter o substrato e atender as necessidades nutricionais do micro-
organismo, para que este se desenvolva e produza o produto desejado;
3. Deve auxiliar no controle do processo, ou seja, não causar dificuldades como variações drásticas
no pH ou produção de espuma excessiva;
4. Não provocar problemas na recuperação do produto, por exemplo, possuir alta viscosidade o que
aumenta custos com energia para filtração;
5. A matéria prima deve ser de fácil estocagem e permitir algum tempo de armazenamento a fim de
estarem sempre disponíveis ;
6. Deve ter composição razoavelmente fixa;
7. Não causar dificuldades no tratamento final dos efluentes.

Tipos de matérias primas

1. Matérias primas amiláceas: o substrato principal é o amido que é um polissacarídeo formado por
moléculas de glicose unidas através de ligações glicosídicas α-1,4. O amido está presente em cereais
como trigo, milho, cevada e arroz, e também em batatas, mandiocas, e outros tubérculos. Todas as
metérias primas amiláceas podem ser utilizadas na obtenção de álcool etílico de qualidade destinado as
indústrias de perfumes e cosméticos, de licores, cervejas, saquês, etc.
2. Matérias primas celulósicas: Neste caso o substrato principal é a celulose, e também é um
polissacarídeo formado por moléculas de glicose unidas por ligação β-1,4. As matérias primas celulósicas
são obtidas dos resíduos agrícolas como cascas de cereais e suas palhas, bagaços de frutas, sabugo de
milho, serragens, e outros resíduos das indústrias madeireiras e de móveis. Também são chamadas
matérias primas lignocelolósicas. Tais matérias primas apresentam baixo teor de nitrogênio e sais
minerais, podem ser utilizadas na produção de proteína unicelular (SCP – Single cell protein) e também na
produção de etanol celulósico que tem ganhado importância nos últimos anos, visto que os resíduos
lignocelulósicos são os mais abundantes no mundo (matéria prima barata).
3. Matéria prima proteica: Neste caso o substrato principal são as proteínas solúveis. Por exemplo, o
sub produto da industrialização do milho, conhecido como milhocina ou água de milho, contém proteínas
solúveis e sais minerais que podem ser utilizados na produção de antibióticos por fermentação , também o
soro do leite é uma matéria prima proteica que além das proteínas solúveis contem a lactose que é um
dissacarídeo composto por glicose mais galactose, que pode ser também um substrato dessa matéria
prima.
4. Matérias primas diversas: Além das anteriores, outras podem ter importância, como por exemplo os
hidrocarbonetos, tanto alifáticos como aromáticos, que podem ser utilizados na produção de compostos
orgânicos oxigenados como gorduras, ésteres, ácido salicílico, álcool, e proteína unicelular, também as
algas e plantas marinhas, que são ricas em glicídios e proteínas podem ser utilizadas na produção de
acetona; também os esteróis encontrados em vegetais superiores, podem ser utilizados na produção de
hormônios, etc.

Tratamentos da matéria prima

1. O amido deve ser sacarificado previamente, caso os micro-organismos a serem utilizados não
produzam enzimas, do tipo amilases. A sacarificação do amido consiste na sua hidrólise, liberando
açucares como glicose e maltose. A sacarificação pode ser efetuada por métodos químicos (hidrólise ácida
ou básica) ou por via bioquímica (utilização de enzimas, as amilases). A hidrólise enzimática é a preferida
pois é feita de forma branda e conduz a uma sacarificação limpa do amido evitando problemas de
corrosão comuns na hidrólise ácida e também produz um mosto ruim (mosto é o caldo que será
fermentado). As enzimas amilases existem naturalmente em alguns grãos maltados e também são
produzidas por alguns fungos e bactérias. A amilases de origem vegetal são uma combinação de α e β
amilase, um exemplo é a fabricação da cerveja na qual a cevada germinada (o malte) contem amilases em
grandes proporções que sacarificam o amido do grão liberando açucares utilizados pela levedura na
produção da bebida alcoólica. Dentre os micro-organismos que produzem amilases podem citar o
Aspergilus Níger. Para que o amido seja sacarificado pela enzima é necessário estar disperso numa
solução (amido solúvel), consegue-se isso fazendo o cozimento do amido.
2. Celulose: Os resíduos lignocelulósicos quando hidrolisados fornecem aproximadamente 70% de
monossacarídeos como glicose, frutose, xilose. E aproximadamente 30% de lignina. A lignina atua como
uma barreira para o acesso da enzima a cadeia de celulose, logo, tais resíduos precisam de tratamentos
prévios para remoção da maior parte da lignina, dentre estes temos: o alcalino quando se utiliza NaOH a
cerca de 4% em temperatura elevada ou solução de peróxido de hidrogênio(H2O2) conhecido como
tratamento oxidativo. Também existe o método de explosão por vapor, quando o matéria é submetido a
vapor e altas temperaturas e uma redução rápida na pressão promove uma explosão na cadeia
lignocelulósica, todos estes métodos objetivam expor a cadeia de celulose, tornando-a suscetível ao
ataque enzimático.
Aula 15 – 19/04
Micro-organismos de interesse industrial

Fontes de micro-organismos de interesse

Os micro-organismos para uso industrial podem ser obtidos das seguintes formas principalmente:
1. Isolamento a partir de recursos naturais: os micro-organismos estão presentes no solo, na água,
nas plantas, em resíduos em decomposição, etc. Porém a obtenção de micro-organismos a partir destes
recursos exigirá muito trabalho experimental e custos altos devido a enorme flora microbiana a ser
pesquisada. No entanto o trabalho de pesquisa tem enorme importância na obtenção de novas linhagens
de interesse industrial, ou seja, espécies bastante eficientes na transformação do substrato no produto de
interesse. O isolamento de novas linhagens deve ter inicio com certas premissas e objetivos bem
definidos, visto que há uma disponibilidade muito grande de espécies até que haja convergência para o
processo ou produto que se deseja produzir.
2. Compra em coleções de culturas: muitas espécies podem ser adquiridas em coleções de cultura,
como por exemplo, o Centro de Culturas Tropicais (CCT). Neste caso é preciso saber qual espécie de
micro-organismo é de interesse e então faz-se a compra. Normalmente os micro-organismos são
disponibilizados na forma de pó liofilizado contido em pequenas ampolas e no laboratório da indústria
promove-se a preparação do inoculo em volumes crescentes até se atingir um volume suficiente para
inocular o bio-reator.
3. Obtenção de mutantes naturais: Devido a sua alta taxa de crescimento poderão surgir espécies
mutantes dentro da população original. Tais mutações espontâneas poderão conduzir a espécies
interessantes para uso industrial, por exemplo, maior eficiência na transformação de substrato em produto.
Tais mutações naturais são aleatórias e imprevisíveis, o que pode não ser interessante aguardar as
linhagens.
4. Obtenção de mutantes induzidos: Como vimos anteriormente pode ser dispendioso aguardar o
surgimento de linhagens mutantes, para isso, lança-se mão de técnicas próprias capazes de induzir a
mutação numa dada população, por exemplo, pode-se submeter uma dada população de micro-
organismos de interesse à ação de agentes mutagênicos, como raios ultravioletas, ou substâncias
químicas (como a nitrosoguanidina). Todo esse processo de seleção de mutantes é caro, mas todo esforço
pode ser recompensado como, por exemplo, o que houve com a indústria de antibióticos, quando
linhagens de Penicillium chrysogenum que produz a penicilina, cujo processo sofreu significativas
melhoras desde a descoberta.
5. Obtenção de micro-organismos recombinantes: Neste caso a engenharia genética e seus avanços
possibilitam a criação de espécies capazes de produzir substâncias que originalmente não eram capazes,
para isso, genes específicos de espécies diferentes são combinados na cadeia genética do micro-
organismo, que então se desenvolve com as novas características genéticas, por exemplo, o micro-
organismo receptor é uma espécie bem conhecida fisiologicamente como a levedura Sacaromices
cerevisiae e a bactéria Escherichia coli.
Características desejáveis de micro-organismos de interesse industrial

Os micro-organismos também devem reunir um conjunto de características, para que seja utilizado
em um processo larga escala. Dentre as características desejadas, temos:
1. Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto: a matéria prima pode pesar
significativamente no custo final do produto, logo, o micro-organismo a ser utilizado deverá ser capaz de
converter o substrato no produto de forma eficiente.
 2. Permitir o acúmulo do produto no meio: ao transformar o substrato no produto o micro-organismo
deve ter a capacidade de tolerar as mais elevadas concentrações de tal forma a reduzir os custos nas
operações de recuperação, separação e purificação do produto, ou seja, o micro-organismo deverá sofrer
o menos possível com os fenômenos de inibição pelo produto.
3. Não produzir substâncias incompatíveis com o produto: durante o seu crescimento, os micro-
organismos produzem diversas outras substâncias além do desejado e tais substâncias não poderão
interferir negativamente com o produto de interesse, por exemplo, é a produção da glico-amilase por
aspergillus. A glico-amilase é a enzima que hidrolisa o amido, produzindo glicose muito utilizada na
industria de alimentos. Ocorre que alguns micro-organismos produtores de glico-amilase também
produzem a trans-glocosidase, uma enzima que promove a polimerização da glicose, e que não pode mais
se hidrolisada pela glico-amilase.
4. Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico: neste caso, não basta apenas o micro-
organismo ser bom produtor da substância desejada, caso ele não tenha constância desejada, que deverá
se manter durante todas as etapas do processo, ou seja, o micro-organismo deverá ter comportamento
previsível em todas as etapas do processo fermentativo.
5. Não ser patogênico: por razões óbvias os micro-organismos não poderão ser causadores de
doenças exceto nos casos específicos, como vacinas, etc. Neste caso todos os cuidados de manipulação
e isolamento da produção deverão ser observados com critérios rígidos.
6. Não exigir condições de processo muito complexas: a operação de bio-reatores e os controles de
processo desempenham um papel fundamental, logo, os micro-organismos deverão suportar condições de
operação de tais reatores reais, e todos problemas envolvidos com a transferência de massa (de
nutrientes, de oxigênio, etc.), e de transferência de calor.
7. Não exigir meios de culturas caros: Neste caso, a matéria prima deverá sofrer o mínimo de pré-
tratamentos, seja de tratamentos físicos ou químicos, como adição de suplementos e nutrientes.
8. Permitir uma rápida liberação do produto para o meio, obviamente estamos lidando com a cinética
da produção e quanto mais rápida, melhor visto que as operações subsequentes dependem da liberação
do caldo fermentado.