UNIDAD IIT Examenes bacterioldgicos y calidad del aguaCONTENIDO 1. Indicadores microbiolégicos de la calidad del agua. 1.1. Grupo coliforme 1.2, Recuento en placas ba as. 2. Procedimientos previos al examen bacteriolégico. 2.1. Toma de muestras. Informacion necesaria en la toma de muestras de aguz Envio de muestras al laboratorio ica de nimero mas probable por tubo multiples. Determinacion de oliformes totales y termotolerantes .. de bacterias heterotréficas aerobias mesofilas viables, 3.3.1. Procedimiento 3.3.2. Lectura. Frecuencia de los exémenes bacterioldgicos en el laboratorio de una planta tratamiento de agua 4.INTRODUCCION Las Guias para la calidad del agua potable de la Organizacién Mundial de la Salud (OMS) indican que no es practico monitorear los agentes patégenos presentes en el agua y que lo mejor es Getectar organismos que nos alerten del riesgo de contaminacién fecal. Numerosas investigaciones han estado dirigidas a buscar indicadores éptimos para determinar si el agua potable es segura. Un buen indicador debe ser capaz de evaluar la probabilidad de que existan patégenos en el agua potable; ademas, debe ser barato y facil de analizar. También debe Proporcionar resultados definitivos en corto tiempo. En los valores guia de la OMS se mencionan dos tipos de indicadores microbiolégicos: * Los coliformes termotolerantes y Escherichia coli como organismos indicadores de contaminacién fecal. ‘* Los coliformes totales. La vigilancia de la calidad del agua, a partir de estos indicadores, garantiza que el agua es segura. Estos mismos indicadores son utiles para efectuar el contro! de las plantas de tratamiento de agua.1. INDICADORES MICROBIOLOGICOS DE LA CALIDAD DEL AGUA La evaluacién de la calidad microbiolégica del agua de abastecimiento estd basada en la determinacién de indicadores bacterianos, que permiten medir el grado de contaminacién fecal. Estos indicadores deben ser sensibles, econémicos y sencillos. Los indicadores bacterianos mas usados son: @) Grupo coliforme: ‘* Coliformes termotolerantes (fecales) y Escherichia coli. * Coliformes totales. b) Recuento en placa de bacterias heterotréficas. GRUPO COLIFORME El grupo coliforme esté conformado por los siguientes géneros: Klebsiella, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, \os cuales utllizan la lactosa para producir acido y gas. Coliformes termotolerantes (fecales). Se denomina coliformes termotolerantes a ciertos miembros del grupo de bacterias coliformes totales que estén mas estrechamente relacionados con la contaminacién fecal. Los coliformes termotolerantes generalmente no se multiplican en los ambientes acuaticos. También se los conoce como bacterias coliformes fecales. Los coliformes termotolerantes crecen con una temperatura de incubacién de 44,5 °C. Esta temperatura inhibe el crecimiento de los coliformes no tolerantes. Se miden con pruebas sencillas, de bajo costo y ampliamente usadas en los programas de vigilancia de la calidad del agua. Los métodos de andlisis son la prueba de tubos multiples y la de filtracién con membrana. Escherichia coll. Es el principal indicador bacteriano de contaminacién fecal en el agua. Estudios efectuados han demostrado que la E. coli esta presente en las heces de humanos y animales de sangre caliente entre 10° y 10” por gramo de heces. Coliformes totales Los coliformes totales se emplean para la evaluacién sanitaria de los efluentes finales de la planta de tratamiento. En su determinacién se utilizan los mismos métodos Propuestos para la determinacidn de coliformes termotolerables. Unidad OT PagtRECUENTO EN PLACA DE BACTERIAS HETEROTROFICAS, El recuento en placa de bacterias heterotréficas detecta una amplia variedad de microorganismos, principalmente bacterias que son indicadoras de la calidad microbiolégica general de! agua. Se ha comprobado que el conteo total es uno de los indicadores més confiables y sensibles de fa desinfeccién del agua. Para su determinacién, se emplea una prueba sencilla y de bajo costo. Los métodos son: * El vertido en placa. * La difusién en superficie. + La filtracién con membrana. Como se puede apreciar, la evaluacién de la calidad microbialdgica de! agua se basa en la determinacién de indicadores bacterianos —coliformes totales y coliformes termotolerantes—, los cuales son removidos con mayor facilidad que los quistes de protozoarios, por lo cual la ausencia de coliformes no indica en forma absoluta la ausencia de quistes. Ante un brote epidémico de enteropardsitos, no bastaria la determinacién de coliformes en el agua, sobre todo cuando ésta es de origen superficial y ha sido Gnicamente sometida a desinfeccién. Estudios efectuados han demostrado que en el agua superficial sin tratamiento existe una mediana correlacién entre la presencia de algas y protozoarios enteroparésitos. En el agua tratada se presenta una buena correlacién entre la presencia de protozoarios y niveles de turbiedad, como también con el conteo de particulas de cinco micras. PROCEDIMIENTOS PREVIOS AL EXAMEN BACTERIOLOGICO 24. ‘TOMA DE MUESTRAS Es necesario usar frascos de vidrio no corrosivo 0 de plastico de boca ancha, estériles y con capacidad minima de 250 mililitros (un cuarto de litro). E] método de muestreo se determina de acuerdo con el objetivo de estudio. ‘Agua de los grifos: deje correr el agua durante un lapso de uno a dos minutos. Destape el frasco esterilizado con todos los cuidados necesarios. Liénelo hasta 4/5 de su capacidad y ciérrelo sin contaminar el material. ‘Nota: si el agua estuviera clorada, el frasco con el que se tomard una muestra de 100 mililitros debera contener 0,1 millitros de solucién de tiosulfato de sodio al 3% para ‘neutralizar el cloro residual. Pozos: cuando no hay grifos u otro tipo de conduccién, amarre una cuerda esterilizada al frasco de toma de muestras y recolecte la muestra. Observacién: el frasco debe estar lleno hasta 4/5 de su volumen. Unidad ir2.2. Agua de superficie: recolecte la muestra contra la corriente, lo més distante de la orilla y siempre bajo la superficie (mas 0 menos a 30 centimetros de profundidad). INFORMACION NECESARIA EN LA TOMA DE MUESTRAS DE AGUA Identificacién (numeracién) y datos complementarios: Lugar de toma de la muestra Fecha y hora de la toma ...... Fecha de ingreso en el laboratoro ... Temperatura ambiente ‘Temperatura del agua Uuvia (en las 24 horas previas) Cuando las muestras provienen de un pozo, se debe indicar: Profundidad .. ‘Antiguedad del pozo. 7 Condiciones higiénicas del lugar... Tipo de pozo. Capacidad del pozo.. éExisten fosas negras en las cercanias? Cuando las muestras son de origen superficial, se debe indicar: Origen (rio, riachuelo, arroyo, etcétera) ... Caudal (cuando sea posible) éHay vertimiento de desagiies aguas arriba? éA qué distancia? .... Cuando la muestra proviene de una planta de tratamiento de agua, se debe indicar lo siguiente: Fuente 7 Sistema de purificacién: sulfato de aluminio, sulfato de cobre, carbén activado, ozono, cloro, etcétera .. Sistema de filtracién (lento, rapido, bajo presién) Cloro residual en el agua de consumo Condiciones higiénicas del depésito de distribucién éHay quejas sobre Ia calidad de! agua? . ¢Hay enfermedades de origen hidrico en fas localidades vecinas? Observaciones .. Nombre del colector.. Unidad IT23, ENViO DE MUESTRAS AL LABORATORIO Una vez tomada la muestra, ésta debe enviarse al laboratorio lo més rapido posible. Agua muy contaminada: las muestras deben llegar al laboratorio antes que transcurran 6 horas desde la toma, aunque se puede aceptar 8 horas como plazo maximo. Agua tratada o libre de contaminacién: las muestras deben llegar al laboratorio antes que pasen 24 horas desde la toma, aunque se puede aceptar 30 horas como plazo maximo, Conservacién de la muestra: la muestra debe conservarse en refrigeradoras portatiles hasta que se haga el andlisis. 3. METODOS DE ANALISIS 3.1. TECNICA DE FILTRACION CON MEMBRANA Método 9222 A, B Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 1995. Edicién 19. Este es un método estndar para el examen del agua y lds aguas residuales, muy usado en los laboratorios de las plantas de tratamiento de agua para medir la presencia de coliformes totales. 1.1. PROCEDIMIENTO Antes de iniciar el examen, desinfecte la mesa de trabajo. Para ello, use un desinfectante que no deje residuos. Disponga sobre la mesa de trabajo el material necesario para ejecutar el anélisis: ‘+ Equipo de filtracién, con los portafiltros previamente esterilizados. + Placas Petri (de 48 milimetros x 8,5 milimetros), con un medio M-Endo- ‘Agar LES. Las placas deben estar identificadas con el numero de muestra que deberdn contener, El volumen por filtrarse se emplea como. dato. * Probetas graduadas estériles, con la abertura recubierta con papel aluminio, identificadas con el numero de la muestra. * Agua de dilucién estéril. © Pipetas estériles de 10 y un mililtro. Pag. 4 Unidad HT‘+ Frasco de boca ancha para colocar las pipetas que se utilicen. ‘*Pinzas sumergidas en alcohol. + Membranas filtrantes estériles con 47 milimetros de diémetro y una porosidad de 0,45 micrémetros. + Mecheros de Bunsen, para mantener el ambiente aséptico y efectuar la desinfeccién de las pinzas utilizadas, Preparacion del portafiltro + Retire la parte superior del portafiltro y, con una pinza flameada y enfriada, coloque una membrana filtrante estéril, con la cara ‘cuadriculada volteada para arriba, sobre la parte superior del portafiltro. * Acople la parte superior del portafiltro; tenga cuidado de no dafiar la membrana. Preparacion de la muestra para la filtracién Volimenes iguales o superiores a 20 millitros. * Homogenice la muestra. Agite un numero no menor de 25 veces, inclinando el frasco y formando un dngulo de 45 grados entre el brazo y el antebrazo, + Distribuya los voltimenes requeridos de muestra en probetas estériles y proceda a la filtracion. Volimenes inferiores a 20 mililitros. + Adicione al portafiltro aproximadamente 20 mililitros de agua de dilucién estéril. (No es necesario medir el volumen, pues éste servird de soporte ara que las bacterias existentes en la muestra se distribuyan de manera uniforme en la superficie-de la membrana, al ser efectuada la filtracién). + Homogenice la muestra con el auxilio de una pipeta estéril, Retire el volumen deseado y praceda a la filtracién. Volimenes decimales (dilucién de muestras) Efectue las diluciones decimales de la muestra asi: + Proceda a marcar cada frasco de agua de dilucién estéril; anote el ndmero de muestra y la dilucién que debera contener. Unidad i‘+ Homogenice la muestra y —con una pipeta estéril de 10 mililitros, conforme a los cuidados de la asepsia— transfiera 10 millitros de muestra a un frasco apropiadamente identificado, que contenga 90 + 2 miliitros de agua de dilucién estéril. Prepare la primera dilucién decimal (1074), sabiendo que un millitro de ella corresponde a 0,1 millitros de la muestra. © Repita la operacién anterior con un frasco que contenga la dilucién hecha anteriormente (107+), Transfiera de ésta, con una nueva pipeta estéril de 10 mililitros, 10 mililitros a un nuevo frasco, previamente identificado, con 90 + 2 millitros de agua de dilucidn estéril. Se prepara asi la segunda dilucién decimal (10°), sabiendo que un mililitro de ella corresponde a un volumen de 0,01 mililitros de la muestra. + Proceda de la misma manera con la secuencia de los decimales deseados (1073, 1074, ...). Después de preparar las diluciones, prepare el portafiltro y, luego de homogeneizar las diluciones seleccionadas para la filtracién, retire el volumen deseado con una pipeta estéril y proceda a la filtracién. Filtracin de volimenes de muestra ‘+ Vierta cuidadosamente en el portafiltro el volumen de muestra que va a ser examinado. Evite que el agua sobrepase los bordes superiores. ‘* Active la bomba de vacio para proceder a la filtracién. ‘+ Después de Ia filtracién, enjuague el portafiltro tres veces con porciones de 20-30 millitros de agua de dilucién estéril, para evitar la retencién de alguna bacteria en las paredes internas del aparato. * Apague la bomba de vacio al finalizar la operacién. Evite el secado excesivo de la membrana filtrante. Coloque la placa Petri correspondiente, con el M-Endo Agar LES, frente al equipo de filtracién y entreabra la placa con el auxilio de una pinza. ‘Separe la parte superior del portafiltro y, con una pinza cuyas extremidades se flamearan, retire la membrana con cuidado para que la pinza toque apenas su parte periférica con culdado, fuera del area de filtracién. Acople nuevamente la parte superior del portafiltro a la parte inferior. Obedeciendo los cuidados de la asepsia, coloque la membrana, con la superficie cuadriculada volteada hacia arriba, en la superficie del medio de cultivo MEndo Agar LES en la placa Petri. Unidad IIT3.1.2. Verifique si se formaron bolsas de aire entre a membrana y el medio de cultivo. Si esto ocurre, levante uno de los bordes de la membrana con una pinza estéril y, mediante movimientos circulares, deslicela para eliminar las bolsas de aire, pues éstas impiden el contacto de las bacterias con el medio de cultivo y dificultan o impiden su crecimiento. Lave nuevamente el filtro con agua de dilucién estéril y proceda a la proxima filtracién. Los portafiltros deben estar estériles en el inicio de cada serie de filtraciones. Estas series no deben usarse para mas de 30 muestras. Si hubo un intervalo de 30 minutos entre una filtracién y otra, los portafiltros deben esterilizarse Nuevamente para evitar una contaminacién accidental, La rapida esterilizacién de los portafiltros puede efectuarse mediante los siguientes procedimientos: © Exposicién a radiacién ultravioleta durante 2 minutos. * Sumersién en agua hirviendo por no mas de 30 minutos. Controle ta esterilidad de cada portafiltro usado para una serie de filtraciones. Para ello, es necesario efectuar la filtracién de una muestra de 100 miililitros de agua de dilucién estéril, antes de iniciar la filtracién de las muestras en prueba (cada 10 muestras). También intercale Ia filtracién de una muestra de agua de dilucién estéril entre cada serie de muestras filtradas en el portafiltro (cada 30 muestras). Después de Ia filtracién de las muestras y posterior transferencia de las membranas filtrantes a las placas Petri, coléquelas en posicién invertida en bandejas forradas con léminas humedecidas de papel toalla, Lieve las bandejas con las placas Petri a la incubadora a 35 + 0,5 °C durante 22-24 horas. LECTURA Después de un periodo determinado de incubacién, seleccione para lectura los volumenes filtrados que presenten entre 20 y 80 colonias tipicas de Coliformes y un total de bacterias (tipicas y atipicas de coliformes) inferior a 200. En el M-Endo Agar LES las colonias tipicas de coliformes presentan una coloracién que va de rosado a rojo oscuro con brillo metilico verde dorado superficial y recubren toda la superficie de la colonia o parte de ella. Las colonias atipicas varian en apariencia (desde incoloras hasta de color rojo ‘oscuro) y se observa un brillo metélico en su superficie. las aguas de buena calidad microbiolégica normaimente presentan cantidades inferiores a 20 colonias tipicas. La lectura se efectia en todas las placas, Pag.7 Unidad TIT3.1.3. Con ayuda de un microscopio estereoscépico y con iluminacién fluorescente 'o mas prdxima posible a la perpendicular en relacién con el plano de membrana, efectle el recuento de las colonias tipicas de las placas seleccionadas para lectura. Método 9222 D Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 1995, Edicién 19 La filtracién con membrana para coliformes fecales 0 termotolerantes es un ‘método usado en el laboratorio que permite determinar la densidad de estos coliformes. En la filtracién con membrana se utilizan un medio de lactosa enriquecido y una temperatura de incubacién de 44,5 + 0,2 °C, que permiten diferenciar, con una exactitud de 93%, los coliformes que se encuentran en las heces de los animales de sangre caliente y los procedentes de otras fuentes. Si se utiliza este método para efluentes clorados, es necesario saber que suministra informacién comparable a la que se obtiene por el andlisis de tubos multiples, otra forma de medir la densidad de coliformes fecales 0 termotolerables. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO @) Medio M-FC: es necesario usar medios deshidratados y para su rehidratacién deben seguirse las instrucciones de los fabricantes. También pueden utilizarse medios comerciales en forma liquida {ampolias estériles u otros), siempre que se sepa que sus resultados son equivalentes. El pH final debe ser de 7,4 y el medio debe conservarse preparado a 2- 10 °C. Si el medio no se usa en un lapso de 15 dias, deberé eliminarse. b) Placas de cultivo: utilice placas de plastico que cierren bien, ya que es preciso incubar los cultivos de filtracién con membrana, sumergiéndolas en un bafio de agua. Para evitar la filtracién durante la inmersién, selle las placas individuales con una cinta a prueba de agua o introduzca grupos de cultivos de coliformes fecales en bolsas de plastico. ©) Incubacién: el control de la temperatura es indispensable para el buen desarrollo de esta prueba, debido a que la especificidad de la prueba de coliformes fecales o termotolerantes es directamente proporcional a la temperatura de incubacién: mientras més se controle la temperatura, mas precisa serd la prueba. Pag. 8 Unidad TirLa temperatura de incubacién debe ser de 44,5 + 0,2 °C, lo cual se logra con la mayoria de los bafios de agua provistos de una tapa para reducir las pérdidas de agua y calor. Un bafio de agua circulante es excelente para este tipo de prueba, pero no esencial si la variacién maxima permisible de 0,2 °C puede conseguirse con otro equipo mas sencillo. 3.1.4, PROCEDIMIENTO Eleccién del volumen de la muestra El volumen de muestra que se va a estudiar se selecciona de acuerdo con la informacién del cuadro 1. Se utilizarén volmenes que produzcan recuentos de 20 - 60 colonias de coliformes fecales por membrana. Cuadro 1 Volimenes de muestra recomendados para la prueba de filtro de membrana en coliformes fecales. ‘VOLUMEN (X) POR FILTRAR (ml, ORIGEN DEL AGUA 100] 50 | 30 | 2 | 0,1 [0,01 0,003 Lagos, pantanos x Tx Poros, manantiales ix [x Toma de suministro de agua ae eRe ‘Aguas naturales de baiio xx [x Plantas de tratamiento de aguas cease (ex residuales, efluente secundario. { ‘Charcas de granjas, rios x [x |x Torrenteras, ECE cca) eT ‘Alcantarillado municipal no tratado Pees] eee EEX Desaguie de establos mee eiKte pox. Cuando no se conozca la densidad bacteriana de una muestra, se filtrarén varios volimenes decimales para establecerla. Calcule el volumen que se espera de una membrana contable y elija dos cantidades adicionales que representen una décima parte y diez veces el volumen sefialado, Filtracion de la muestra Siga el mismo procedimiento e idénticas precauciones que las descritas en la técnica de filtracién con membrana en esta misma unidad (paginas 4-7). Preparacién de la placa de cultivo © Coloque una compresa estéril absorbente en cada placa de cultivo y lleve con la pipeta alrededor de 2 miliitros de medio M-FC hasta saturar la compresa. + Elimine culdadosamente de la placa de cultivo el posible exceso de liquido. Pag. 9 Unidad I+ Coloque el filtro preparado en la compresa impregnada de medio. + Como sustituto del sustrato de la compresa absorbente saturada de Rutriente, afiddase agar al 1,5 por ciento al medio liquido M-FC. Incubacién + Coloque los cultivos ya preparados en bolsas de plastico impermeables 0 selle las placas de Petri y sumérjalas en un bafio de agua, donde se incubarén a 44,5 + 0,2 °C durante 24 + 2 horas. * Los discos se fijan bajo la superficie del agua para mantener la temperatura necesaria. ‘+ Coloque los cultivos preparados en el bafio de agua antes de transcurridos 30 minutos de la filtracién. También puede utilizarse un incubador de disipacién térmica sdlido, adecuado y exacto. Recuento Las colonias se cuentan por medio de una lupa estereoscépica binocular de ‘campo amplio y pocos aumentos (10 a 15) 0 mediante dispositivos dpticos similares. * Las colonias producidas por bacterias coliformes fecales en el medio M-FC presentaran distintos matices de azul. * Las colonias de color amarillo palido pueden ser de £. coli y hay que comprobar si producen gas en manito! a 44,5 °C, ‘+ Las colonias de coliformes no fecales serén de tonos grises a cremosos. En condiciones normales, se observan pocas colonias de coliformes no fecales en el medio M-FC, debido a la accién selectiva de la elevada temperatura y a la adicién de la sal del cido rosélico. 3.1.5. CALCULO DE LA DENSIDAD DE COLIFORMES FECALES + Calcule la densidad a partir de las placas que producen recuentos de 20- 60 colonias de coliformes fecales. * La férmula para calcular la densidad es la siguiente: Colonias de coliformes fecales contadas x 100 pena mL de muestra filtrados Unidad HiT3.2. + Reporte sus resultados en términos de densidad de coliformes fecales por 100 mL. Ejemplo Si se han estudiado porciones de 50, 25 y 10 mL y el recuento ha sido de 15, 6 y 3 colonias de coliformes fecales, el resultado serd el siguiente: 5 +6+3)x100 _ (24)x100 5025s 1omL 57 28/2 cliformes fecales/100 mL ‘TECNICA DE NUMERO MAS PROBABLE POR TUBOS MULTIPLES. DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y TERMOTOLERANTES Método 9221 A, B, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 1995. Edicién 19. ste es un método estdndar usado en los laboratorios para determinar la presencia de coliformes totales y termotolerantes. 3.2.4. PROCEDIMIENTO Prepare los tubos de caldo lauril triptosa (CLT) 0 caldo lactosado (CL) en concentracién simple requeridos para la prueba y coléquelas en filas de 5 tubos. Tenga la precaucién de que en el momento de iniciar la prueba no estén a la temperatura de refrigeracién. Para las inoculaciones de porciones de 10 miliitros de muestra, use ef CLT o el CL en concentracién doble. Proceda al marcado de los tubos. Para ello, anote el nimero designado por el laboratorio en la ficha de registro de exdmenes, ademés dei volumen seleccionado de muestra que va a ser inoculada y el dia. Esta marcacién podra hacerse solamente en el primer tubo de la derecha en la primera fila. En los primeros tubos de las hileras siguientes se pueden simplificar las marcaciones, Para ello, se coloca sélo el volumen de la muestra inoculada. Identifique también los frascos de aguas de dilucién, Homogenice la muestra no menos de 25 veces. Para ello, incline el frasco formando un dngulo de aproximadamente 45° entre el brazo y el antebrazo. Con una pipeta esterilizada de 10 millitros y obedeciendo los cuidados de la asepsia, transfiera 10 millitros de muestra a un frasco con 90 + 2 mililitros de agua de dilucién temperada, anticipadamente identificado. Prepare asi la primera dilucién decimal (107), sablendo que un mililitro de ella corresponde a 0,1 mililitros de muestra. Pag. 17 Unidad 13.2.2. Con la misma pipeta, siembre 10 miliitros de muestra en cada uno de los tubos de CLT (0 CL) de concentracién doble, cuando este volumen sea requerido para la prueba. Descarte la pipeta de 10 millitros y con una pipeta de 5 millitros, inocule un miliitro de muestra en cada uno de los 5 tubos correspondientes a estas cantidades de inéculo, Homogenice el frasco con la primera dilucién (107*) y con una nueva pipeta esterilizada, transfiera 10 miliitros a un frasco con 90 + 2 millitros de agua de dilucién temperada, Se consigue asi la segunda dilucién decimal (102), sabiendo que un mililitro de ella corresponde a 0,01 mililitros de muestra. Proceda igual en las secuencias de diluciones deseadas (1073,...). Ordene los frascos con las diluciones; mantenga la secuencia decreciente de éstas (de mayor a menor dilucién efectuada). Agite vigorosamente 25 veces el frasco con Ia ultima dilucién efectuada y, con una pipeta estéril de 5 mililitros, siembre un miliitro de dilucién en cada tubo de CLT (0 CL) correspondiente a esta dilucién. Proceda de la misma forma sembrando desde la muestra més diluida a la mas concentrada, utilizando la misma pipeta. Después de la inoculacién de todos los volimenes de muestra en cada dilucién requerida para el examen, coloque la incubadora a 35 * 0,5 miililitros durante 24 + 3 horas. LECTURA Después de ese periodo de incubacién, retire los tubos de la incubadora para efectuar la primera lectura de los resultados. Para ello, agite suavemente cada tubo y examine la produccién de gas. Retire los tubos con resultado positivo (produccién de cualquier cantidad de gas, retenida en el tubo Durham) y anote los resultados. Devuelva a la incubadora los tubos con resultados negativos por un periodo adicional de 24 + una hora. La segunda lectura (48 + 3 horas) se hard en las mismas condiciones. Los tubos de CLT (0 CL) con resultado positivo se separaran y los negativos se descartarén. Para la realizacién del ensayo confirmativo, todos los tubos con resultado positivo en CLT (0 CL) en las lecturas de 24 + 2 horas y 48 3 horas se someterdn a la confirmacién inmediatamente después de las respectivas lecturas. Como procedimiento alternativo, cuando varias diluciones sembradas dan resultado positivo, se procede a la confirmacién de la diltima serie de tubos con mayor dilucién que presenten resultados positives en todos los tubos en 242h y en los tubos positives de las series siguientes, Unidad TirDescarte las series anteriores con resultado positivo; considere para ellas resultado confirmativo positivo. Todos los resultados con resultado presuntivo positive en 48 + 3 horas se someterén a la confirmacion. Este procedimiento alternativo se aplicara a muestras de agua potable o residual, en relacién con las cuales se tiene ‘comprobacién anterior consistente sobre la confirmacién de los resultados presuntivos positivos. El ensayo confirmativo se efectuard por medio del caldo lactosado verde brillante bilis (CLVBB) para determinacién de coliformes totales y caldo EC para determinacién de coliformes termotolerantes (fecales).. Confirmacién de coliformes totales en CLVBB * Marque los tubos de CLVBB correspondientes en cada tubo de CLT (0 CL) con resultado presuntivo positivo. * Agite cada tubo de CLT (0 CL) con resultado presuntivo positive y, con un asa estéril, retire el material e inocilelo en el tubo CLVBB correspondiente. Evite la pelicula superficial que se pueda formar en el CLT (0 CL) presuntivo positivo. ‘+ Inocule todos los tubos de CLVBB e inclibelos durante 48 + 3 horas a 35, 0,5 °C. + Proceda a las lecturas después de 48 + 3 horas. Considere como Pruebas confirmativas positivas para coliformes totales a todos los tubos Que presenten informacién de gas en el tubo. Elabore el nimero mas probable (NMP) a partir de los datos obtenidos. Diferenciacién de coliformes termotolerantes (fecales) Esta diferenciacion se efectia a partir de los tubos positivos de caldo lauril triptosa (0 caldo lactosado). + Efectie la marcacién de tubos EC (previamente temperados en bafio Maria a 44 + 0,2 °C durante un minimo de 30 minutos) con los nimeros correspondientes a cada tubo de medio presuntivo (CLT 0 CL) en que se verifica la formacién de gas. ‘+ Agite bien cada tubo de CLT (0 CL) con resultado presuntivo positivo y en un asa de niquel-cromo (estéril), tome un indéculo de cultivo y transfigralo al tubo de EC correspondiente. Para ello, evite la pelicula superficial que pueda formarse en cultivo presunto positivo. '*Incube todos los tubos de EC inoculados (no mas de 30 minutos después de la inoculacién) en bafio Maria a 44,5 + 0,2 °C durante 24 + 2 horas. Proceda a la lectura; considere como resultado positivo para la prueba todos los tubos que presentaron formacién de gas en el tubo Durham. Pag. 13, Unidad I3.3. Con los datos obtenidos, calcule el NMP de coliformes fecales. Utilice las tablas de NMP segiin el nimero de réplicas por dilucién. Las tablas figuran en el Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 1995. Edicién 19. 3.2.3, EXPRESION DE RESULTADOS En el caso de coliformes totales, los resultados se expresan como NMP de coliformes totales/100 mL y, en el caso de coliformes termotolerantes, como NMP de coliformes termotolerantes/100 mL. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFICAS AEROBIAS MESOFILAS VIABLES Método 9215 B, método de placa fluida (MPF) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 1995. Edicion 19. El método de Ia placa fluida para el analisis de bacterias heterotréficas aerobias mesé6filas viables en muestras de agua considera el uso de agar licuado @ una temperatura de 44 a 46 °C, Se debe tener especial cuidado con la temperatura del agar debido 2 que las bacterias en la muestra de agua estén expuestas a la presién del calor, lo cual puede hacer que los microorganismos no sean viables. Ademas, como se emplea un medio rico en nutrientes, es probable que las bacterias fisiolégicamente estresadas 0 dafiadas no se desarrollen debido a alguna forma de inhibicién metabilica. Tanto la presién del calor como el medio de crecimiento rico producen una recuperacién reducida de las bacterias. Mediante este método sélo se puede analizar un maximo de un mililitro de muestra. 3.3.1, PROCEDIMIENTO Homogenice la muestra no menos de 25 veces. Incline el frasco formando un Angulo de aproximadamente 45° entre el brazo y el antebrazo. Para efectuar las dlluciones de la muestra, proceda con una pipeta esteriizada de 10 miliitros y, obedeciendo los cuidados de la asepsia, transfiera 10 millitros de muestra a un frasco (previamente identificado) con 90 + 2 milllitros de agua de dilucién temperada. Prepare asi la primera dilucién decimal (10%), sabiendo que un millitro de ella corresponde a 0,1 mililitros de muestra. Pag. 14 Unidad IIT3.3.2, 3.3.3. Homogeneice el frasco con la primera dilucién (10+) y, con una nueva pipeta esteriizada, transfiera 10 millitros a un frasco con 90 + 2 millitros de agua de dilucién temperada. Consigne asi la segunda dilucién decimal (10- 2), sabiendo que un mililitro de ella corresponde a 0,01 millitros de muestra. Proceda igual en la secuencia de diluciones deseadas (10°3,...). Ordene los frascos con las diluciones. Mantenga la secuencia decreciente de ellas. Agite el frasco vigorosamente 25 veces con la ultima dilucién efectuada y, con una pipeta estéril de 5 millitros, siembre un millitro de dilucién en cada placa Petri (estéril) correspondiente a la respectiva dilucién. Proceda igual, sembrando las siguientes diluciones. Por ultimo, con una pipeta estéril de 5 mililitros, siembre un mililitro de la muestra original. Incorpore a cada placa aproximadamente 15 miliitros de agar (R2A 0 SPC) precalentado (a 45-50 °C), Cubra la placa y mezcle el agar con la muestra (mediante movimientos que simulen el ntimero 8) durante aproximadamente 10 segundos. Evite que el agar se adhiera a la tapa y a los bordes de la placa. Deje que el agar se solidifique. Incube las placas en posicién invertida a 35 °C por 72 horas. LECTURA Después de un periodo determinado de incubacién, seleccione para lectura las placas que presentan entre 30 y 300 colonias. Si todas las placas tuvieran mas de 300 colonias, tome en cuenta la placa con la dilucién mas alta y exprese el conteo sobre la base de dicha dilucién, Con ayuda de un contador de colonias o de un microscopio estereoscépico y con iluminacién fluorescente colocada lo mas proxima posible a la perpendicular en relacién con el plano de membrana, efectie el recuento de las colonias en las placas seleccionadas para lectura. Si las colonias no pueden contarse inmediatamente, guarde las placas a 4 °C por un tiempo no mayor de 24 horas. EXPRESION DE RESULTADOS Exprese los resultados como UFC/mL (unidades formadoras de colonias por millitro).. Pag. 15 Unidad IT4, FRECUENCIA DE LOS EXAMENES BACTERIOLOGICOS EN EL LABORATORIO DE UNA PLANTA DE TRATAMIENTO DE AGUA La determinacién de coliformes totales y termotolerantes se efecttia con Ia siguiente frecuencia: @) Enel agua de la fuente se realiza un examen mensual como minimo. b) Enel agua tratada y clorada (salida de la estacién), el examen debe ser diario. ©) _ Enel agua presente en los distintos puntos de la red, el examen debe ser diario. Pag. 16