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1. Disrupción.
2. Lisis.
3. Remoción de proteínas y otros contaminantes.
4. Obtención de DNA.
Disrupción:
Una técnica fácil para el aislamiento de DNA genómico es incubar los lisados de las
células a altas temperaturas (e.g., 90 °C por 20 minutos), o realizar una digestión
previa con Proteinasa K, y luego se utilizan los lisados directamente en otras
técnicas a seguir. Cabe tener en cuenta que estas técnicas” rápida-y-sucias” no son
aplicable para seguir trabajando en técnicas moleculares especificas que necesitan
DNA de alta calidad. Ademas los lisados contienen inhibidores enzimáticos, como las
sales y el DNA casi nunca en estos casos se encuentra a un pH óptimo. Una mala
inactivación de la Proteinasa K puede resultar en falsos negativos y una alta
frecuencia de fallas varias.
Método del salting-out:
Extracción Orgánica:
Este método se usa luego de la lisis alcalina y permite precipitar el plasmido por
uso de polientilenglicol, es un método rápido y barato que no necesita de múltiples
maquinarias, basa su principio en que hay una relación inversa entre el tamaño
macromolecular del acido nucleico y la cantidad necesaria de polientilenglicol para
la precipitación, ósea es una precipitación diferencial.
Enzimas de Restricción:
Muchas cepas bacterianas poseen sistemas enzimas de restricción que reconocen DNA
foráneo y los cortan para prevenir una eventual infección.
Al mismo tiempo este sistema evita que el DNA cromosomal sufra cortes o
degradación, las enzimas de restricción reconocen y cortan secuencias especificas
de DNA, como son las palindromes u otras, estas enzimas son capaces de distinguir
el DNA foráneo del propio debido a que el DNA bacteriano esta modificado metilado
lo cual evita que las enzimas los cortes, ya que la misma secuencia de
reconocimiento es sustrato tanto de la endonucleasa (corte) como de la metilasa
(metilacion). El DNA del invasor no es metilado al ingresar a la bacteria debido a
que solo el DNA Hemimetilado es sustrato de las metilasas (Endonucleasa y metilasa
siempre están apareadas). La metilacion ocurre sobre las bases nitrogenadas.
Las enzimasde restriccipon reconoces DNA de doble hebra.
Enzimas de restricción TIPO II: Son las más famosas y conocidas. La estructura
proteica presenta dos enzimas separadas M y R, donde la útil es la R, el sitio de
corte se reconoce como una secuencia de 4 a 7 pares de bases organizadas en
palindromes el corte es específico y no necesita ATP. La metilacion y restricción
son reacciones separadas no como en los otros tipos.
Vectores de Clonamiento.
Los principales vectores de clonamiento son considerados los plásmidos y los fagos.
Los plásmidos están compuestos por dsDNA circular de 1 a 200 Kpb, su replicación es
independiente de la replicación del cromosoma bacteriano y pueden utilizar algunas
proteínas del hospedero de larga vida para su propia replicación.
Los plasmidio confieren su portador características fenotipicas como la capacidad
de expresión de factores de virulencia y la capacidad de resistir a antibióticos.
Los plásmidos presentan características especificas en cuanto a su replicación e
incompatibilidad ya que: El control del numero de copia del plasmido esta regulado
por una secuencia presente en el sitio de origen de replicación llamada replicon,
este replicon se regula por medio de interacciones cis entre secuencias de RNA, el
replicon mas conocido es el pMB1, para el cual no se necesita codificar enzimas de
replicación ya que este utiliza las DNA Pol I y III, la RNA pol, luego los dnaB,
dnaC, dnaD y dnaZ.
El RNA II es el primer necesario para iniciar la replicación del DNA, este primer
es procesado a partir de un trascripto mas largo llamado pre-primer de 500
nucleótidos formado por la RNAsa H, antes de que se forme un complejo estable entre
RNA y DNA cerca del OriV (origen de replicación), la formación del hibrido es
esencial para que la RNAsa H pueda procesar el pre-primer y formar el RNA II, para
iniciar la replicación.
Por otro lado el RNA I controla negativamente el número de copias del plasmido
previniendo la separación del RNA II del pre-primer, el RNA I tiene un largo de 100
nucleótidos y es codificado por la misma hebra contraria que codifica para parte
del pre-primer, por lo que interfiere en la formación del hibrido pre-primer
RNA--;:DNA impidiendo la correcta actividad de la RNAsa H para la formación del RNA
II por corte del pre-primer (cis). Ademas al RNA I, el numero de copias del
plasmido es regulado negativamente por el polipéptido Rop, producto del gen rop,
este gen se encuentra río abajo del OriV, este polipéptido actúa de forma trans
reprimiendo la formación del RNA II, ya que estabiliza el complejo RNA I-pre-
primer.
Una sola mutación del RNA I, produce un cambio de 15 a 20 copias del plasmido por
células a mas de 500.
Marcadores seleccionables
• Tetracycline binds to a protein of the 30S subunit of the ribosome and
inhibits ribosomal translocation. The tetr gene carried on plasmid pBR322
encodes a 399-aminoacid, membrane-associated protein that prevents the
antibiotic from entering the cell.
• Ampicillin binds to and inhibits a number of enzymes in the bacterial
membrane that are involved in ths synthesis of the cell wall. The ampr gene
carried on the plasmid codes for an enzyme that is secreted into the
periplasmic space of the bacterium, where it catalyzes hydrolysis of the b-
lactam ring, with concomitant detoxification of the drug.
• Chloramphenicol binds to the ribosomal 50S subunit and inhibits protein
synthesis. The cmr or cat gene codes for a tetrameric, cytosolic protein (Mr
of each subunit = 23,000) that, in the presence of acetyl coenzyme A,
catalyzes the formation of hydroxyl acetoxy derivatives of chloramphenicol
that are unable to bind to ribosomes.
• Kanamycin and neomycin are aminoglycosides that bind to ribosomal components
and inhibit protein synthesis. Both antibiotics are inactivated by an
aminoglycoside phosphotransferase with a molecular weight of 25,000 that
appears to be located in the periplasmic space. Phosphorylation of these
antibiotics is believed to interfere with their active transport into the
cell.
Estrategias de clonamiento:
PARA que ¿?, El aislamiento de un gen puede ser útil para determinar su secuencia
nucleotidica y por ende su estructura intrones, exones, promotores, sitios de
restricción etc.…
La comparación de secuencias genéticas puede llevar a conocer relaciones evolutivos
y de ahí la secuencia aminoacidica puede llevarnos a conocer tanto la estructura
como la función de una proteína codificada.
Ademas la información obtenida por el clonamiento puede ser utilizada en varios
campos de la ingeniería genética.
Clonamiento básico:
Este método consiste en agregar una solución de cloruro de calcio a una suspensión
bacteriana en fase Log de crecimiento ya que las bacterias se están replicando y
sus membranas plasmáticas presentan múltiples zonas incompletas, que se visualizan
como poros, la función del cloruro de calcio es ralentizar el cierre de estos poros
estabilizando la membrana, y evitando que hallan repulsiones de cargas entre la
membrana y el DNA transformante y entre las mismas hebras de DNA.
Otros metodos:
B.= el
método
de
electroporación, permite formar poros sobre la bacteria por donde puede entrar el
DNA, mediante pulsos eléctricos, entre los pulsos eléctricos y la adición del DNA
no debe pasar mucho tiempo o la bacteria se vuelve a cerrar.
C.= El método de las balas implica el uso de una pistola de DNA la cual dispara
unas microesferas que llevan DNA adherido, el cual una vez dentro de la bacteria se
separa de la bala y trasforma la célula.
Fago LAMBDA:
Es un virus denominado bacteriófago, es especifico para E.coli, el virus maduro
contiene un genoma de alrededor de 48 kpb y una envoltura proteica eicosaedrica, la
trascripción de genes es muy regulada, en base a esta regulación el fago tiene dos
vías de desarrollo una lítica y otra lisogenica.
El fago presenta un genoma linear dentro de su cabeza el cual se recircularías al
ser infectado dentro de coli, luego el DNA circularizado puede integrarse al DNA de
la bacteria (profago) o permanecer en su forma circular dentro del citosol.
La replicación del genoma ocurre formando un concatamero el cual posee múltiples
genomas continuos de doble hebra, pero al momento de ensamblarse el virus complete
solo un genoma es internalizado en la cabeza.
El ciclo lítico implica la completa expresión de la actividad viral donde el genoma
se replica unas cien veces por célula infectada, solo un fago infecta una celula,
mientras que en la lisogenia la actividad viral de muchos genes se ve apagada el
genoma se incluye al genoma bacteriano dando vida aun profago y la bacteria ahora
se denomina lisogenica, el ciclo lítico queda latente y se puede activar.
Para la lisogenia se necesita la integración del DNA del fago, se usan sitios
llamados attB bacteria y attP phage para el reconocimiento de integración luego
ocurre la recombinación cruzada de los extremos POP´ y BOB´, del fago y de la
bacteria respectivamente queda la unión de los genomas en BOP´ y POB´, donde se
forman los nuevos sitios que marcan la unión de los genomas a la derecha e
izquierda del genoma del fago lambda attR y attL, respectivamente.
Transcripción temprana-tardía
La proteína N modifica a la RNA polimerasa que transcribe a partir del promotor pL.
La capacidad de la RNA pol para seguir la trascripción esta debida a la
modificación proporcionada por N con la cual, desconoce a los terminadores de la
trascripción tL1, tL2, y a otros más localizados en el operón izquierdo O L,
produciendo los transcritos de la región b, más allá del sitio attP.
Por otro lado la RNA polimerasa pasa el terminador tR1 y trascribe eficientemente
los genes para las proteínas CII, O, P y Q; entre P y Q, se encuentra un segundo
terminador tR2, el cual es mucho mas potente que tR1 y solo se puede obviar con la
presencia de N, ósea Q solo se expresa en presencia de la proteína N.
Se observa que para el ciclo lítico luego de la infección la transcripción de los
genes tempranos N y cro, así como los genes del lado izquierdo cIII, beta y del
lado derecho, cII, q, p y o, se ve disminuida debido a que la trascripción a partir
de pL y pR, se ve inhibida por la proteína Cro, ya que esta se une a los operadores
múltiples OL y OR, los cuales están solapados con los respectivos operadores.
La inhibición de la expresión génica mediada por Cro es esencial para el ciclo
lítico ya que una excesiva actividad de pL y pR, puede ser letal para el desarrollo
del ciclo.
Trascripción tardía:
La proteína Q y su función:
El
Se usa este tipo de fago para obtener ssDNA mutado de forma especifica.
PCR:
Polymerase Chain Reaction.
1º etapa Denaturacion: Esta etapa permite denaturar el DNA, debe hacerse a unos 90
a 96ºC, siempre dependerá del tamaño de la hebra, dura de 30 seg. a 1 min.
Hay técnicas que implican un calentamiento rápido a 96ºC y un enfriamiento rápido a
4ºC, llamada Hotstart estas etapas tiene como objetivos asegurar la correcta y
completa denaturacion del DNA, también se pueden realizar usando solución de baja
concentración salina o disruptores de puentes de hidrogeno como son la formamida y
el formaldehído.
2º etapa Annealing: En esta etapa ocurre la unión de los primers al respectivo
templado o molde, se debe realizar a unos 54 60 ºC dependiendo de la composición y
longitud de los primers y del buffer usado. 30 seg 1 min.
3º etapa Elongación: En esta tercera etapa ocurre la síntesis de las nuevas hebras
de DNA amplificado a partir de los primers usados, entra en juego aquí la Taq
polimerasa (o cualquier otra polimerasa), la polimerasa se une a los primers y
sintetiza la nueva hebra en base a la hebra molde preexistente. Este proceso ocurre
a unos 72ºC dependiendo de la polimerasa que se use y ademas de la composición del
DNA molde y de los primers.
Es una técnica muy sensible solo necesita 0.01 ug de DNA para amplificar.
Se deben agregar pocos primers 1 y 2, 20 pmol de cada uno.
El Buffer debe ser principalmente Tris-HCl a pH 8.
Se debe agregar una concentración de MgCl 2 no superior a los 1.5 mM, este proceso
es critico ya que le entrega especificidad a la unión de los primers a la hebra
molde por estabilización de cargas, ademas las poliemrasas en general necesitan de
cationes divalentes para su actividad.
Ademas se agregan salen de potasio y amonio para entregar fuerza iónica al medio la
cual es esencial para la
estabilhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhización de cargas entre todas
las hebras de DNA.
La cantidad de Taq polimerasa no debe ser excesiva 2 unidades, dependiendo de la
cantidad de DNA que se quiera amplificar, ya que mucha taq polimerasa puede
resultar en una amplificación poco especifica del DNA.
Punto clave:
El reactivo mas importante de la PCR son los Primers, ya que le entregan
especificidad a la reacción, estos deben ser de unos 15 a 25 pb, la composición en
GC debe ser alrededor de un 50%, ademas no deben ser complementarios, no deben
formar estructuras secundarias de orquilla ni ser palindromes, no deben ser
complementarios entre si en los extremos 3’ o se auto replicaran, deben tener casi
la misma temperatura de annealing, no deben unir otras parte de la secuencia que no
sea la amplificar y no deben tener secuencias repetidas o serán inespecíficos.
Muchas técnicas utilizan primer que poseen colitas volantes que poseen en su
estructura alguna secuencia de reconocimiento o algún sitio de restricción, este
ultimo también se aplica al momento de fabricar un primer directo para la hebra
molde que una secuencia palindromica a si mismo como sitio de restricción de una
enzima este echo puede permitir en un futuro la correcta inserción direccional del
g
M6en si este se quiere expresar.
Real-Time PCR:
Usa un sistema compuesto por un primer que contiene una molécula fluorescente y un
apagador.
La PCR inicia normalmente en el annealing se unen los dos primers (Fw y Rev) en sus
sitios respectivos, pero un nuevo primer se une en una de las dos hebras del DNA a
amplificar se une normalmente en dirección 5’3’, donde en el extremo 5’ esta la
molécula fluorescente (R) y en el extremo 3’ el apagador (Q); cuando la polimerasa
(debe tener actividad correctora 5’3’) inicia la elongación del primer normal y
alcanza el extremo 5’ del primer modificado elimina el nucleótido modificado R, el
cual a ser separado de su apagador Q en 3’, es libre de emitir fluorescencia.
La fluorescencia es proporcional al Nº de moléculas de DNA que se están
amplificando, por lo que este proceso me permite cuantificar la cantidad de DNA que
estoy amplificando en tiempo real.
Nested-PCR: PCR anidada. Variante de la PCR convencional que comprende dos rondas
de amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada una, con el
fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción
con los iniciadores externos para amplificar una región de ADN mas extensa, que
contiene el segmento diana. Después, con este producto de amplificación, se
ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos para amplificar la región
específica.
El proceso de Nested-PCR permite determinar la direccionalidad del inserto que se
logro clonar en un vector y trasformar para una célula.
Se usa el primer FW usado para amplificar inicialmente el fragmento y otro primer
especifico para una zona especifica del plasmido u otro vector usado, según la
direccionalidad del inserto de fragmento un segundo proceso de PCR dará como
resultado un producto que corresponde al fragmento entre los primers usado dando la
deducción de la justa direccionalidad del primer o viceversa un resultado nulo
indicara que el inserto no se logro clonar direccionalmente.
PCR asimétrica: Se ocupa cuando se quiere amplificar una sola hebra de DNA más que
la otra por lo que los procesos de PCR ocurren de forma normal solo que se usa un
exceso del primer forward para obtener solo dicha hebra, ademas se deben realizar
mas ciclo s que la normal.
Genotecas:
Las genotecas por definición son un pool de moléculas de DNA recombinante.
Las Genotecas contienen fragmentos de todas las secuencias de un Genoma.
Las genotecas de cDNA son obtenidas a partir de cDNA y son tejido o tiempo
especifico.
Las genotecas de DNA genómico se obtienen por técnicas de DNA recombinante usando
cósmidos o DNAs virales y trasformando bacterias para obtener la copia del gen.
ln(1-P)
N= ln(1-f)
Esta relación ademas depende de la fracción media de genoma en cada clon (f).
Ejemplo usando fago l como vector en una genoteca del genoma humano:
The architecture of an expression vector. An expression vector should contain a strong inducible
promoter, a multiple cloning site for the insertion of target genes, and a transcriptional terminator.
Additionally, a ribosome binding site (RBS) is included to promote efficient translation.
Figure 17.5
pKK177-3 is a tac vector containing multiple sites
downstream from the tac promoter into which a gene can
be cloned. Downstream from these sites is rrnB, which
contains an E. coli 5S gene and the T1 and T2
terminators (Amann and Brosius 1985).