Universidad del Valle de México

Innovación de técnicas microbiológicas para el aislamiento de

Bacillus subtilis a partir de mango.

Christopher L. Cordero Zamora; Omar A. Osorio Solano; Rodrigo Martínez Rincon;

Sabinne M. Gallegos Rico.

*Universidad del Valle de México, Campus Lomas Verdes, Escuela de Ciencias de la Salud, Carrera de
Química Farmacéutica Biotecnológica
Paseo de las aves No. 1. San Mateo Nopala, Naucalpan de Juárez Estado de México, México.
Noviembre 2017

RESUMEN
B. subtilis es una bacteria encontrada comúnmente en el suelo, plantas y algunas frutas, que tiene un
gran uso en la biología molecular debido a su gran capacidad de producir antibióticos contra hongos
fitopatógenos. En el presente proyecto, se estandarizó una nueva técnica de aislamiento de B.
subtilis a un bajo costo, eficiente y con un fácil manejo, obteniendo un cultivo axénico del
microorganismo para su posterior uso como agente antifúngico de onicomicosis.

Palabras clave: Bacillus, B. subtilis, aislamiento, metabolismo bacteriano, cultivo axénico, técnicas
microbiológicas, metabolitos secundarios.

ABSTRACT
B. subtilis is a bacterium commonly found in soil, plants and some fruits, which has a great use in
molecular biology due to its great capacity to produce antibiotics against phytopathogenic fungi. In
this project, a new technique of isolation of B. subtilis was standardized with a low cost, efficient
and an easy handling, obtaining a pure cultivation of the microorganism for its later use as an
antifungal agent of onychomycosis.

Key words: Bacillus, B. subtilis, isolation, bacterial metabolism, axenic culture, microbiological techniques,
secondary metabolites.

Introducción resistente a las altas temperaturas y a los

Bacillus es un género de bacterias en forma de bastón
y gram positiva. El género Bacillus pertenece a
la División Firmicutes. Son aerobios estrictos
o anaerobios facultativos. En condiciones estresantes
forman una endospora de situación central, que no
deforma la estructura de la célula a diferencia de las
endoesporas clostridiales. Dicha forma esporulada es
desinfectantes químicos corrientes.
La mayoría de especies dan positivo a la prueba de
la catalasa y son saprófitas. Viven en el suelo, agua
del mar y ríos, aparte de alimentos que contaminan
con su presencia. Aunque generalmente son móviles,
con flagelos peritricos, algunas especies de interés
sanitario, como B. anthracis, (causante del carbunco)

son inmóviles. Hay especies productoras
de antibióticos.
Muchas especies de Bacillus pueden producir grandes
cantidades de enzimas que aseguran su utilización en
diferentes industrias. Algunas especies de Bacillus
pueden formar inclusiones intracelulares
de polihidroxialcanoatos bajo ciertas condiciones
ambientales adversas, como en una falta de elementos
tales como fósforo, nitrógeno, u oxígeno combinado
con un suministro excesivo de fuentes de carbono.
La pared celular de Bacillus es una estructura en el
exterior de la célula que forma la segunda barrera
entre la bacteria y el medio ambiente, al mismo
tiempo mantiene la forma de varilla y resiste la
presión generada por turgencia de la célula. La pared
celular se compone ácido teicurónico.
Bacillus subtilis
B. subtilis es una bacteria gram positiva, catalasa
positiva que es comúnmente encontrada en el suelo.
Miembro del género Bacillus, tiene la habilidad para
formar una resistente endospora protectora (Fig. 1),
permitiéndole tolerar condiciones ambientalmente
extremas. B. subtilis no es considerado patógeno
humano; sin embargo puede estar presente en los
alimentos sin causar intoxicaciones alimenticias. Sus
esporas pueden sobrevivir a la calefacción extrema
que a menudo es usada para cocinar el alimento, y es
responsable de causar la fibrosidad en el pan
estropeado.
Fig. 1: Endospora protectora de B. subtilis.
El control biológico o el uso de microorganismos
antagonistas como las bacterias, hongos y levaduras
ha surgido como una alternativa viable para el control
de enfermedades (Sharma et al., 2009). El potencial
de Bacillus spp. para sintetizar metabolitos con
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actividad antifúngica y antibacteriana se ha utilizado
en control biológico de fitopatógenos. La formación
de endosporas les otorga una alta viabilidad
comparada con células vegetativas, ya que son
resistentes a la desecación y al calor, pudiéndose
formular fácilmente en productos estables (Wulff et
al., 2002). De los péptidos antifúngicos producidos
por Bacillus podemos citar a micobacilinas, iturinas,
bacilomicinas, surfactinas, micosubtilinas,
fungistatinas y subporinas. Estos péptidos
generalmente tienen un PM < 2000 Da.
Particularmente, B. subtilis es una especie que
produce diferentes metabolitos secundarios en la
forma de lipopéptidos (como la bacitracina,
cefalosporina y polimixina B), que cuentan con una
buena actividad antifúngica antibacteriana y que,
como consecuencia, son de alto valor biotecnológico y
farmacéutico (Volpon et al., 2000).
La aparición de resistencia contra péptidos
antimicrobianos es menos probable que la resistencia
a antibióticos convencionales (Oard et al., 2004).
Fig. 2: B. subtilis a 10 µm.
B. subtilis ha sido estudiada ampliamente como agente
de biocontrol fúngico. Tal es el caso del producto
“Baktillis” (Fig. 3), un fungicida biotecnológico que
es utilizado para inhibir la germinación y la
propagación de los hongos fitopatógenos actuando
directamente sobre las esporas y el micelio de los
mismos. Esta acción, se debe a los ya mencionados
metabolitos secundarios, metabolizados propiamente
por la bacteria (lipopéptidos, subtilina, bacitracina,
toximicina, etc.). Asimismo, tiene la capacidad de
activar o potenciar los mecanismos de defensa de las
plantas, promoviendo el crecimiento vigoroso y
saludable de los cultivos.

Fig. 3: Presentación comercial del producto Baktilis.
Por otro lado, en el Departamento de Parasitología de
la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro
(UAAAN), campus Saltillo, se están realizando
estudios de control biológico de la marchitez de
plantas causada por hongos (Fig. 4), utilizando a las
bacteria B. subtilis con potencial control contra los
hongos Rhizoctonia, Phytophtora, Fusarium y otros
hongos del suelo que causan pudrición de la raíz.
La búsqueda de nuevos agentes de biocontrol con
actividad frente a hongos y con características aptas
para su aplicación, es una práctica vigente, por lo que
en el presente estudio se propuso una nueva
metodología para aislar B. subtilis.
Fig. 4: Efecto de F. lateritium sobre la variedad de
plantas Montalm.
Técnicas de aislamiento
Se encuentran reportadas diversas técnicas de
aislamiento de B. subtilis Sin embargo, enlistamos las
más significativas para llevar a cabo nuestro proyecto.
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a) Técnica reportada por Reinoso, P. et. Al.
(2006)
El aislamiento de bacterias del género Bacillus se
llevó a cabo por medio de la resuspensión aséptica de
1 g de tierra en 100 mL de agua destilada estéril, con
agitación vigorosa por 30 s, después de realizarles
diluciones seriadas y someterlas a un tratamiento
térmico de 85ºC durante 10 min en baño de agua; se
tomó 0,1 mL de la dilución tratada que se sembró con
espátula de Drigalsky en placas con medio de agar
nutriente e incubadas durante 72 h a 28ºC para
después realizarles el conteo de las colonias de distinta
apariencia. Se tomó una muestra representativa de
cada colonia para realizarle una tinción simple con
violeta cristal y observar al microscopio, con un
aumento de 100X. Aquellas colonias que mostraron
presencia de endospora bacteriana pasaron a una
subcultivación en agar nutriente durante 24 h a 28ºC
para efectuar la prueba de la catalasa a fin de ubicarlas
en el género Bacillus.
Los aislamientos que resultaron positivos a la catalasa
se conservaron en frascos de agar nutriente a 4ºC hasta
su posterior uso.
b) Técnica reportada por Ragazzo, J. (2011)
El aislamiento de cepas de Bacillus se realizó de la
superficie de frutas tropicales y de suelo en las huertas
de producción. Se seleccionaron muestras de frutas
tropicales (10 papayas var. Maradol, 10 mangos cv
Ataulfo, 10 melones cantaloup y 10 plátanos). Todas
estas frutas fueron colectadas en huertas; de dos
huertas por especie y cinco frutos por huerta. Los
frutos se colocaron enteros en bolsas de poliestireno
con cierre y agua peptonada estéril, cuyo volumen fue
dos veces el peso del fruto. Los frutos se agitaron
durante 2 min. Las muestras de suelo se colectaron de
cinco huertas de frutos tropicales (dos muestras por
huerta), para ello se tomaron 10 g de suelo en un radio
de 3 cm de las raíces de los árboles y a una
profundidad de 10 cm. Las muestras se colocaron en
100 ml de agua peptonada, agitándose vigorosamente
en vórtex. Del agua peptonada utilizada para muestras
de fruto y de suelo, se tomaron alícuotas de 5 ml que
se incubaron en baño maría a 80 ºC con agitación a
100 rpm por 30 min para destruir las células
vegetativas. Se tomaron alícuotas de 0.1 ml que se
inocularon en caldo nutritivo a 37 ºC durante 24 h,
posteriormente se sembró en agar nutritivo,
incubándose a 37 ºC durante 24 h. Las colonias
aisladas se resembraron en agar nutritivo hasta obtener
cultivos puros y evaluar las características típicas de
Bacillus.

c) Técnica reportada por Galindo, E. et. Al.
(2005)
La cepa B. subtilis fue aislada de huertos comerciales
de mango y se reactivó en medio YPG-agar,
incubando a 30 C, durante 24 h. Su capacidad de
producir antibióticos se probó en bioensayos in vitro
en medio PDA. La bacteria se propagó en matraces
con medio YPG y finalmente se produjeron las células
viables necesarias para su aplicación en campo, en un
biorreactor piloto de 30 L. Posteriormente, las
bacterias fueron recuperadas en amortiguador de
fosfatos, empleando una centrífuga de discos de nivel
piloto.
d) Técnica reportada por Cuervo, P. (2010)
Para el aislamiento de los microorganismos evaluados
en biofertilizantes se realizó primero cuantificación en
medio SPC o Agar placa de conteo estándar, mediante
el método de cuantificación de células viables en
series de diluciones decimales y siembra en superficie,
por duplicado. Las placas se incubaron a 37°C por 24
a 72 horas. Posteriormente se seleccionaron los
diferentes tipos de colonias y se sembraron por
estriado y agotamiento en agar nutritivo para la
obtención de cultivos puros.
Planteamiento del problema
B.subtilis es una bacteria que tiene un amplio uso en la
biología molecular como principal objeto de estudio
debido a su susceptibilidad genética, su uso como
productor de antifúngicos mediante su metabolismo y
su tamaño relativamente grande; sin embargo, casi
siempre se le encuentra en conjunto con otros
organismos debido a su extensa distribución, por lo
que resulta importante su aislamiento adecuado para
realizar correctas investigaciones.
Justificación
El uso de microorganismos como objeto
biotecnológico ha tenido un gran auge en los últimos
años, como la síntesis de nuevos medicamentos,
mejoras en la calidad de vida, observación de
metabolismos específicos que pueden beneficiar a los
seres humanos etc. Es por esto, que se deben aislar
estos microorganismos con técnicas y medios que
permitan una mayor concentración de los mismos,
económicas, y prácticas para investigarlos con mayor
eficiencia evitando la alteración de datos.
Objetivos
Universidad del Valle de México
General
 Aislar la bacteria B. subtilis a partir de
mango.
Específicos
 Aislar la cepa B.subtilis
 Obtener la bacteria a partir del mango.
 Obtener mayor eficiencia en el aislamiento
bacteriano
 Lograr la caracterización e identificación
bacteriana.
 Obtener un cultivo axénico de la bacteria B.
subtilis obtenida del mango.
 Conseguir pruebas de inhibición fúngica a
partir de la bacteria.
Hipótesis
Si estandarizamos una técnica de aislamiento
basándonos en las necesidades metabólicas de la
bacteria B. subtilis y utilizando compuestos y medios
de cultivo promotores de su crecimiento, esta logrará
tener cierta afinidad hacia los mismos y, en
consecuencia, un aislamiento positivo y eficiente.
Método
Previo a la toma de muestra del mango, la fruta se
sembró en la tierra durante toda una noche y se colocó
en una bolsa de agua fría durante un día con la tierra
dentro.
Después se preparó un agar nutritivo con 10% peptona
de carne donde se sembró un inóculo de la cáscara y
se dejó en la estufa durante 48 horas a 37°C. Al final
de este periodo se pasó un inóculo de este agar a un
agar nutritivo nuevo, otro inóculo a agar azul de
metileno y eosina y finalmente, un último inóculo a
agar tripticaseína. Se dejó en la estufa durante 48
horas a 37°C.
Al observar el crecimiento positivo en los tres medios,
se fabricó en el laboratorio un agar de cultivo nuevo
con los siguientes compuestos: Agar nutritivo (14g/L),
Manitol (10g/L), Cloruro de Sodio (2 g/L) y peptona
de carne (1g/L). Se sembró un inóculo de los tres
medios preparados previamente en este nuevo agar y
se dejó otras 48 horas en la estufa a 37°C, obteniendo
así, la cepa aislada de B. subtilis, después de realizar
pruebas de catalasa, prueba de oxidasa, tinción Gram
y tinción de endosporas.
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Todo el método fue comparado con un cultivo control Control Mango

identificado de B. subtilis, que fue proporcionado por
la maestra Teresa Durán. Agar nutritivo Bacilos + Bacilos -

Resultados Agar azul de Bacilos + Bacilos -

metileno
Control Mango
tripticaseína Bacilos + Bacilos +
Agar nutritivo Positiva Positiva
Tabla 4: Tinciones Gram para el cultivo control y el
Agar azul de Negativa negativa cultivo de mango en el medio fabricado en
metileno laboratorio.

tripticaseína Positiva positiva

Tabla 1: Pruebas de catalasa para el cultivo control y

el cultivo de mango en los distintos medios.

Control Mango

Agar nutritivo Bacilos Gram + Bacilos y cocos

+

Agar azul de Bacilos + Bacilos - y

metileno cocos +

tripticaseína Bacilos + Bacilos + y Fig. 5: Presencia de cocos Gram + en agar nutritivo

cocos - antes de ser transferidos al medio selectivo fabricado
en laboratorio (100X).
Tabla 2: Tinciones Gram para el cultivo control y el
cultivo de mango en los diferentes medios

Control Mango

Agar nutritivo

Agar azul de
metileno

tripticaseína

Tabla 3: Pruebas de catalasa para el cultivo control y Fig. 6: Presencia de cocos en agar tripticaseína antes
el cultivo de mango en el medio fabricado en de ser transferidos al medio selectivo fabricado en
laboratorio. laboratorio (100X).
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Gram positivas. Este compuesto únicamente fue

utilizado para aislar las cepas Gram positivas de las
Gram negativas; asimismo se utiliza de forma
recurrente para separar los dos géneros Gram de
Staphylococcus spp.

El cloruro de sodio fue utilizado con el fin de

mantener el equilibrio osmótico en los
microorganismos y para hacer más selectivo el medio
para bacterias Gram positivas.

Creemos que el paso clave del éxito obtenido, fue la

Fig. 7: Presencia de bacilos Gram + en el medio
siembra que se realizó en el medio selectivo a partir de
fabricado en el laboratorio, a partir del inóculo del
la colonia crecida en el agar tripticaseína. La
agar tripticaseína.
composición del agar tripticaseína es la siguiente:
B. B Escheric B.
 Tripteína (15 g/L): aporta nutrientes ricos en
subtili cereus hia coli lichenifor
péptidos, aminoácidos libres, bases púricas y
s mis pirimídicas, minerales y vitaminas.
 Peptona de soya (5g/L): aporta carbohidratos
Respira Aerob Anaero Anaerobi Anaerobia que estimulan el crecimiento.
ción ia bia a  Cloruro de sodio (5g/L): mantiene el balance
osmótico.
Catalas Positi Negativ positiva Positiva
a va a Todos estos nutrientes influyen en el crecimiento de
las bacterias, sin embargo, la peptona de carne
Oxidasa Positi positiva Negativa negativa utilizada en el primer agar es utlizada para cultivar
va microorganismos aerobios, como es el caso de B.
subtilis. Como se mencionó anteriormente, debíamos
Tinción positi Positiv Negativo Positivo separar a las especies de cocos que estaban con los
Gram vo o bacilos. Tanto el género Streptococcus y
Staphylococcus son organismos anaerobios, por lo que
Tabla 5: Comparación de B. subtilis con otras al usar la peptona de carne, estos organismos fueron
bacterias tipos bacilos comunes de encontrar en inhibidos en su crecimiento. (Fig. 7).
ambiente.
El medio de eosina y azul de metileno es un medio
selectivo para bacilos, inhibiendo el crecimiento de
Discusión cualquier otro microorganismo que no sea éste. Sin
embargo, este es un medio específico para Bacilos
Como se puede observar, el éxito del aislamiento de Gram negativos, por lo que no fue posible observar el
B. subtilis se debe al medio de cultivo, crecimiento de B. sutilis (Gram positivo) en este
específicamente, el medio de cultivo enriquecido con medio.
Manitol, NaCl, y peptona de carne para separar los
bacilos de las especies de cocos que se encontraban Finalmente, se realizaron pruebas bioquímicas al
juntas (Fig. 5 y 6). cultivo axénico de B. subtilis con el fin de diferenciar
esta bacteria de otros bacilos similares. Como se
La mayoría de las bacterias utilizan la glucosa como observa en la Tabla 5, se comprobó el aislamiento
fuente de Carbono principal para llevar a cabo su bacteriano óptimo, ya que las pruebas bioquímicas
metabolismo, como es el caso de B. subtilis. En el arrojaron los resultados que se esperaban para B.
caso del medio selectivo, se sustituyó el uso de subtilis.
glucosa por manitol, que es utilizado en microbiología
para inhibir el crecimiento de bacterias Gram
negativas y potenciar el crecimiento de bacterias

Con esta nueva técnica de aislamiento bacteriano, se
optimizó el procedimiento, ya que se omitió el
tratamiento térmico (Reinoso, 2006) y el
sometimiento a la centrifugación (Ragazzo, 2011),
utilizando únicamente medios de cultivo accesibles.
En el caso del medio realizado en laboratorio, los
componentes son fáciles de encontrar en un
laboratorio y son bastante accesibles económicamente,
evitando gastos en medios selectivos que, en
ocasiones, resultan difíciles de conseguir.
Conclusiones
Con base en los resultados obtenidos y los objetivos
planteados al inicio de este proyecto, se concluye:
 El aislamiento de B. subtilis es positivo si
solo se modifica el medio de cultivo.
 No se necesitan métodos complejos de
laboratorio (centrifugación, calentamiento),
para asilar microorganismos.
 El aislamiento de microorganismos
específicos es posible a partir de muestras
con una gran diversidad bacteriana.
 Se logró una mayor eficiencia en el
aislamiento bacteriano.
 Cada bacteria tiene características específicas
que las diferencian unas de otras, por lo que
resultan cruciales las pruebas bioquímicas de
identificación para evitar resultados falsos
positivos.
Perspectivas
Como se mencionó anteriormente, B. subtilis, es un
gran objeto de investigación contra hongos
fitopatógenos actualmente; por lo que más adelante, a
partir de la cepa aisalda en el transcurso de este
proyecto, se pretende evaluar este mismo poder
antifúngico contra hongos patógenos de los seres
humanos, específicamente, la onicomicosis.
Agradecimientos
Los Alumnos de la asignatura Biotecnología del II-
2017, desean expresar su agradecimiento:
A la maestra Teresa Durán Moreno, por compartir sus
conocimientos con nosotros y ser nuestra guía durante
el desarrollo de este proyecto.
Universidad del Valle de México
Al doctor, Gabriel Silva Escobedo, por las ideas para
optimizar el trabajo, así como el préstamo de material
de laboratorio para trabajar.
A la maestra Monserrat Ibarra, por sus técnicas
microbiológicas y su ayuda en la identificación de la
bacteria.
Al maestro Fernando Rojas, por su apoyo con los
métodos de siembra a pesar de la distancia.
A nuestros compañeros, María Fernanda Cedeño
Toscano e Iván Ricardo Delgadillo Pérez por sus
sugerencias para llevar a cabo buenos aislamientos
bacterianos.
Y finalmente, a la Universidad del Valle de México
campus Lomas Verdes por todo el apoyo recibido
durante el desarrollo del proyecto, desde el préstamo
de material de trabajo, hasta el préstamo de escenarios
para llevar a cabo el proyecto.
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