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INFORME.

FERMENTACION ALCOHÓLICA
Gabriel Eduardo García Laiton, Laura Valentina Vanegas Vanegas Grupo: 1.2

Resumen
Las levaduras son organismos eucariotas unicelulares pertenecientes al reino Fungi, estos
microorganismos son altamente utilizados en la industria cervecera y alimentaria principalmente
debido a las dos clases de fermentación que son capaces de realizar, la alcohólica y la láctica. La
primera, como su nombre lo dice, es usada para la producción de alcohol (etanol) y su posterior
utilidad en la obtención de bebidas como la cerveza y el vino, la levadura mayormente empleada por
la industria en este campo es la Saccharomyces cerevisiae. La segunda, es implementada
sustancialmente en la industria alimentaria para la creación de productos como yogurt y kumis.
Ambas reacciones pueden llevarse a cabo por el resultante de la glucólisis, el piruvato, un compuesto
de tres carbonos que después de realizársele reacciones de oxidorreducción se transforma en los
productos mencionados anteriormente. Para estos hongos estas transformaciones significan un
proceso biológico imprescindible para su ciclo de vida.
Palabras clave: levaduras, fermentación alcohólica, fermentación láctica, glucólisis, piruvato.
Abstract
Yeasts are unicellular eukaryotic organisms belonging to the Fungi kingdom, these microorganisms
are highly used in the brewing and food industry mainly due to the two types of fermentation they are
capable of, alcoholic and lactic. The first, as its name says, is used for the production of alcohol
(ethanol) and its subsequent utility in obtaining beverages such as beer and wine, the yeast mostly
used by the industry in this field is Saccharomyces cerevisiae. The second, is implemented
substantially in the food industry for the creation of products such as yogurt and kumis. Both
reactions can be carried out by the resultant of glycolysis, pyruvate, a compound of three carbons
that after being carried out reactions of oxidoreduction is transformed into the products mentioned
above. For these fungi these transformations mean an essential biological process for their life cycle.
Key words: yeasts, alcoholic fermentation, lactic fermentation, glycolysis, pyruvate.
Introducción
Las levaduras son microorganismos eucariotas unicelulares pertenecientes al reino Fungi,
generalmente se caracterizan por llevar a cabo su división asexualmente, ya sea por gemación o por
fisión binaria. Hacen parte de dos clases de hongos: ascomicetos o basidiomicetos. Las ascomicetas
generan ascas libres, con 1 a 8 ascosporas, en las especies hifales las ascas están desnudas. Son
organismos aerobios y a pesar de que muchas especies dentro de este grupo son fermentadoras, otras
no lo son. Ejemplo de estas son los géneros Cryptococcus y Rhodotorula.
“La fermentación alcohólica es un conjunto de transformaciones bioquímicas en las que ciertas
levaduras se encargan de transformar el mosto, compuesto principalmente por hidratos de carbono,
en un líquido con determinado contenido alcohólico y dióxido de carbono gaseoso” (Sánchez Miguel,
2011). A pesar de que el interés que los humanos tienen sobre esta reacción es la producción de etanol
y dióxido de carbono para la creación de bebidas alcohólicas y de productos de panadería,
respectivamente, la función biológica de este proceso, es decir, lo que para estos organismos significa
realizarlo, es la producción de energía.
𝐶6 𝐻12 𝑂6 2𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2 + 2𝐴𝑇𝑃
Esta fermentación inicia cuando al final de la glucólisis queda como producto el piruvato y es
descarboxilado por la acción de la piruvato descarboxilasa, el acetaldehído resultante es el que luego
pasa a convertirse en los productos mencionados anteriormente. Cuando las condiciones en las que
se lleva a cabo la reacción son anaerobias, la reoxidación del 𝑁𝐴𝐷𝐻 + + 𝐻 + a 𝑁𝐴𝐷 + se efectúa
cuando el piruvato se convierte en acetaldehído y posteriormente en etanol, esto con el fin de que la
reacción no se suspenda.

Figura 1. Esquema de fermentación alcohólica

Otra clase de fermentación también efectuada por levaduras, y por algunas bacterias, es la láctica. En
esta también utilizan el producto de la glucólisis (piruvato) para iniciar el proceso, el resultado final
de interés en esta reacción es el lactato. En condiciones de ausencia de oxígeno, la fermentación
responde a la necesidad de la célula del microorganismo de generar la molécula 𝑁𝐴𝐷 + , que ha sido
consumida en el proceso energético de la glucólisis, por la reducción del piruvato se crea el lactato
(De Nadal, 2010). Esta fermentación es altamente utilizada en la industria alimentaria para la
producción de alimentos como el yogurt y para la conserva de otros como las aceitunas y los
pepinillos.

Figura 2. Esquema de fermentación láctica

Las levaduras acostumbran a fermentar una reducida cantidad de glúcidos, principalmente hexosas y
disacáridos. Gran número de grupos de estos hongos forman parte de la microflora natural de
alimentos y bebidas fermentadas y/o participan en el proceso de obtención de éstos. “El género
Saccharomyces y unos escasos más, son fermentadores enérgicos de los azúcares bajo condiciones
anaerobias. Dekkera, su anamorfo Brettanomyces y algunas otras, fermentan glucosa más rápido en
aerobiosis. Sólo Schwanniomyces, Lipomyces y Saccharomyces diastaticus pueden hidrolizar
almidón” (Carrillo L., 2007).

Metodología Figura 3. Esquema de varios géneros de levaduras

Producción de piruvato, acetaldehído y


etanol por fermentación de la glucosa
con las enzimas de la levadura

ensayos

Procedimiento a cargo del (1) Formación de piruvato a Formación de acetaldehído y


auxiliar de laboratorio partir de glucosa etanol a partir de glucosa

Para reconocimiento de piruvato:


Al cabo de este tiempo agregar a Añadir 2mL de ATA, mezclar y centrifugar
Tomar 2 tubos de ensayo y marcar c/u de los tubos 2mL de slcn de durante 10 min a 2500 rpm y separar los
como A y B. Pipetear 3mL de glucosa ácido tricloroacético, mezclar bien y sobrenadantes para el reconocimiento de
en c/u. Agregar al tubo A 5mL de centrifugar durante 10 min a 2500 etanol y acetaldehído.
suspensión de levadura en solución de rpm. Separar los sobrenadantes
𝑁𝑎2 𝐻𝑃𝑂4 alcalina (verificar que el pH para identificación de piruvato
aprox. 8) y al tubo B 5mL de suspensión
de levadura en solución de 𝑁𝑎𝐻2 𝑃𝑂4 Reconocimiento de Reconocimiento de
ácida (verificar pH aprox. 4). Mezclar Reconocimiento acetaldehído etanol
bien ambos tubos, proteger con papel del piruvato con 2,4
de aluminio y poner a incubar a 37°C dinitrofenilhidrazina Tomar 2 tubos de ensayo, Disolver 10 gotas del
durante 2 días sobrenadante del tubo B
agregar a c/u 0.5mL del
reactivo de Schiff, al 1o de en 1mL de benceno,
ellos añadir 100µL (6 adicionar 0.5mL de slcn
gotas) del sobrenadante de vanadato de amonio y
Tomar 2mL de los sobrenadantes 2 o 3 gotas de slcn de
Para reconocimiento de del tubo C y al 2o 100µL (6
que obtenidos en (1), en tubos de oxina, mezclar bien y dejar
acetaldehído y etanol: gotas) del sobrenadante
ensayo. Añadir a cada tubo 1mL de reposar por 20 min. (Lo
la slcn de 2,4 dinitrofenilhidrazina y del tubo D.
Tomar 2 tubos de ensayo y mismo para con el
marcar como C y D. mezclar bien cada tubo. En 2 tubos Repetir el procedimiento sobrenadante del tubo C).
Adicionar a c/u 3mL de de ensayo limpios, sacar 3 o 5 utilizando el reactivo de
glucosa y 5mL de gotas de las mezclas anteriores y benzaldehído como patrón Repetir el procedimiento,
suspensión de levadura en adicionar a c/u 1mL de NaOH, 10% positivo y agua como pero utilizando etanol
agua. Al tubo D añadir 0.5 y 2mL de agua destilada. Observar patrón negativo como patrón
RESULTADOS: la formación de color rojo.
g de sulfito de sodio.
Mezclar bien ambos tubos y
Repetir el ensayo utilizando el
ponerlos a incubar a 37°C
reactivo puro de ácido pirúvico
durante 1 día, protegerlos
como ctrl positivo y agua como ctrl
con papel de aluminio
negativo
Resultados:
Ensayo 1. Reconocimiento de piruvato con el Al realizar la respectiva adición del reactivo a las
reactivo de 2,4-dinitrofenilhidrazina muestras anteriores (sobrenadante A, B, piruvato
y agua) se pudo evidenciar la formación de una
solución de color rojo pardo en el tubo B y en el
tubo de control positivo, cabe resaltar que en este
último la coloración fue mucho más fuerte
(tornándose de color sangre). La solución de agua
(control negativo) y sobrenadante A no sufrieron
reacción.

Ensayo 2. Reconocimiento de acetaldehído En el momento de adición del reactivo de Schiff,


se pudo observar las coloraciones de la imagen.
Para el sobrenadante C la coloración se tornó
amarilla (no sufrió reacción), caso que sucedió con
el tubo D (control negativo) que contenía agua.
Los tubos B y control positivo (benzaldehído) si
sufrieron reacción, en el tubo B la coloración se
tornó más claro que en el tubo de benzaldehído.

Ensayo 3. Reconocimiento de etanol Al añadir el reactivo de vanadato de oxina, cada


una de las soluciones en el tubo de ensayo se tornó
de color café.

Análisis de resultados:
La fermentación de la glucosa a partir de la utilización de levaduras, se realizó en medio básico y en
medio alcalino respectivamente. Para el caso del primer estudio en medio alcalino se procedió a
realizar la de Na2HPO4 que permite inhibir la acción de la piruvato descarboxilasa y al añadir
NaH2PO4, la solución se frena la producción de acetaldehído. “Los organismos como las levaduras
que llevan a cabo la fermentación alcohólica poseen el enzima pirúvico carboxilasa” (Lehninger,
2005). Gracias a esta enzima fue posible identificar los intermediarios de la reacción. Este catalizador
no se encuentra presente en tejidos animales, y además necesita de la coenzima TPP y Mg2+ como
cofactores para su respectiva función, de esta forma se puede clasificar como metaloproteína. El
pirofosfato de tiamina, coenzima derivada de la vitamina B1, es la que se encarga de realizar la
descarboxilación del ácido pirúvico.
Durante la degradación de la glucosa se realiza la producción de piruvato y mediante una etapa
posterior mediante su oxidación, se produce por acción de la enzima piruvato descarboxilasa
acetaldehído. La concentración de estos dos se realiza en bajas concentraciones, de esta forma, para
poder realizar su reconocimiento como intermediarios en la glucólisis, es indispensable parar su
síntesis e impedir que lleguen a la conversión en otro tipo de compuestos. Para frenar esto, se utilizan
inhibidores o se cambian las condiciones fisiológicas de la actividad catalítica de las levaduras. La
inhibición permite que se bloquee la enzima que genera la conversión de los metabolitos.

Figura 4. Reacción general de la degradación de glucosa hasta el intermediario metabólico etanol

La producción de piruvato a partir de la glucosa como intermediario se encuentra en pocas cantidades,


de esta forma es necesario inactivar la enzima que permite su producción (piruvato carboxilasa) para
que en medio de la reacción de glicólisis este empiece a acumularse para de esta forma poderse
identificar con el reactivo de 2,4-dinitrofenilhidrazina. Esta inactivación sucede en el momento en el
que el pH de la reacción se torna alcalino, puesto que, el pH óptimo de esta enzima en la fermentación
alcohólica oscila entre 4 y 5.
La reacción, se basa en que la 2,4-dinitrofenilhidrazina se convierte en 2,4-dinitrofenilhidrazona, la
cual se torna de color rojo, permitiendo identificar de forma cualitativa la presencia de una cetona o
un aldehído. En este caso la coloración se tornó roja para el caso del piruvato como prueba patrón y
el sobrenadante B, ya que estos a su vez contienen en su estructura un grupo cetónico, además, la
acumulación del intermediario metabólico fue mayor debido al medio en el cual se encontraban
(ácido).
Figura 5. Reacción de una cetona con el reactivo de 2,4-dinitrofenilhidrazina

Para la identificación del acetaldehído, es necesario realizar la adición de sulfito de sodio, para la
formación de un complejo bisulfítico (figura 3). Este complejo es el que permite que se dé la
acumulación del acetaldehído para su posterior identificación. “en la reacción final de la fermentación
alcohólica, el acetaldehído es reducido hasta etanol por el NADH en presencia de la enzima alcohol
deshidrogenasa” (Lehninger, 2005).

Figura 6. Formación de complejo bisulfítico con la adición de sulfito de sodio para la acumulación de
acetaldehído.

La reacción con el reactivo de Schiff permite identificar la presencia de aldehídos produciendo un


complejo de color violeta, cuando se hace uso de bisulfito de sodio se produce la formación de gas
SO2, el bisulfito de sodio sufre una descomposición en la cual se genera SO2 gaseoso, por lo cual
solo se produce ácido leucosulfónico, incoloro, y que cambia a color violeta o púrpura al tener
reacción directa con un aldehído, al perder el ácido sulfuroso. En el caso concreto de la práctica, el
acetaldehído sufre este proceso y se forma una coloración púrpura al igual que la solución presente
en el tubo B que por adición bisulfítico se produce la acumulación de acetaldehído.

Figura 7. Reacción de un aldehído con el reactivo de Schiff. En la reacción se produce una coloración violeta

La identificación de alcoholes, aunque se encuentren mezclados con otros compuestos como


hidrocarburos, cetonas, éteres o compuestos halogenados, son reconocidos mediante la formación de
un complejo de coloración roja con una mezcla de 8-hidroxiquinolina (oxina) y vanadato de amonio.
Se debe tener en cuenta que algunos alcoholes solubles en agua no dan reacción en forma apreciable,
igualmente ocurre con el alcohol alílico y los aminoalcoholes. En el caso de esta práctica, la reacción
no se dio efectivamente debido a que, como dice anteriormente los alcoholes solubles en agua no dan
reacción en forma apreciable, caso concreto de la solubilidad del etanol en agua.
Conclusiones
Se pudo evidenciar la acumulación de piruvato mediante el bloqueo de la enzima piruvato
descarboxilasa al realizar la adición de fosfato de disodio, se procedió a realizar su identificación
mediante la utilización de reactivo de 2,4-dinitrofenilhidrazina, la cual dio reacción positiva.
La acumulación del acetaldehído se dio en el momento de realizar la adición bisulfítica con el bisulfito
de sodio, su identificación se hizo con el reactivo de Schiff, que forma una coloración violeta, la
reacción fue positiva para el tubo C y para el benzaldehído.
En la prueba de vanadato de oxina, no se dio reacción evidente, debido a que el etanol es un compuesto
soluble en agua, esta característica evita la formación de coloración roja, típica de este tipo de
reacción.
Bibliografía

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