García Burgos Emilio Clave: 7

Grupo: 7 27/abril/18

Experimento No. 10: Análisis e Identificación de Carbohidratos.

Objetivos.
Identificar cualitativamente diferentes carbohidratos. Diferenciar una pentosa de una hexosa, aldosas
de cetosas y un disacárido frente a un monosacárido, mediante el empleo de reacciones
características. Identificar y analizar las diferentes reactividades de mono, di y polisacáridos frente a
reacciones típicas de identificación de carbohidratos

Hipótesis.
Si se llevan a cabo reacciones de identificación cualitativa de carbohidratos; entonces se podrá
comprender la diferente reactividad de éstos (pentosas de hexosas, aldosas de cetosas, disacárido
de un monosacárido y también de un polisacárido).

Reacciones.

a) Identificación de Monosacáridos (Test de Barfoed).

b) Prueba de Benedict.

c) Identificación de Cetosas (Test de Seliwanoff).

d) Identificación de Pentosas (Test de Bial).

e) Hidrólisis de almidón.

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Procedimiento.
a) Identificación de Monosacáridos (Test de Barfoed).
En un tubo de ensaye adicione
0.50 mL de una disolución 0.5%
de azúcar correspondiente y 1.5
mL de reactivo de Barfoed y
caliente en un baño de agua en
ebullición hasta que la reacción
ocurra.
Únicamente al tubo de sacarosa,
que es negativo para Barfoed,
adiciónele 2 gotas de HCl
concentrado y caliente unos
minutos a ebullición.
b) Prueba de Benedict.
Coloque en un tubo de ensayo 1
mL de reactivo de Benedict y 3
gotas de disolución de
carbohidrato a analizar. Caliente
a ebullición y deje enfriar a
temperatura ambiente.
Un resultado positivo se
considera por la aparición de un
precipitado rojizo-naranja
c) Identificación de Cetosas (Test de Seliwanoff).
En un tubo de ensaye adicione
0.50 mL de una disolución 0.5%
de azúcar correspondiente y 1.5
mL de reactivo de Seliwanoff y
caliente en un baño de agua en
ebullición por un lapso máximo de
1-3 minutos.
Las cetosas reaccionan
rápidamente deshidratándose
para dar furfural el cual se
condensa con el resorcinol para
dar un compuesto aromático de
color rojo cereza.
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Análisis del Procedimiento.
*La técnica sugiere usar tubos de ensaye para poder emplear poca cantidad del reactivo y además ser
más fácil su manipulación. *El azúcar adicionada es la que será caracterizada por la prueba, se adiciona
una pequeña cantidad para hacer el muestreo. *El reactivo de Barfoed lo que identifica es azúcares
reductoras (porque el Cu (II) del reactivo pasa a Cu (I) si el azúcar da positivo a esta prueba); y también
ayuda a diferenciar entre monosacáridos y disacáridos, con base en el tiempo en el que tarda en
aparecer el precipitado de Cu (I). *Para generar el baño de agua a ebullición se utiliza una solución de
salmuera muy concentrada para permitir una mayor temperatura del agua por propiedades coligativas.
*La reacción ocurre cuando se forma un precipitado rojo ladrillo en el fondo del tubo de ensayo.
*Este procedimiento se hacer porque la sacarosa da negativo a esta prueba por ser un disacárido; pero
si las condiciones de la reacción son modificadas, como aumento de temperatura y disminución de pH,
se puede dar la ruptura del enlace glucosídico haciendo posible la reducción del Cu(II) a Cu(I) del
reactivo de Barfoed, ya que aparecen grupos reductores por haber sido liberado el carbono anomérico.
*La técnica sugiere usar tubos de ensaye para poder emplear poca cantidad del reactivo y además ser
más fácil su manipulación. *El carbohidrato adicionado es la que será caracterizado por la prueba, se
adiciona una pequeña cantidad para hacer el muestreo. *El reactivo de Benedict lo que identifica son
carbohidratos reductores (porque el Cu (II) del reactivo pasa a Cu (I) si el azúcar da positivo a esta
prueba). *Para generar el baño de agua a ebullición también se utiliza una solución de salmuera muy
concentrada para permitir una mayor temperatura del agua por propiedades coligativas. Esta solución
se prepara con cloruro de sodio en exceso y agua destilada. *La reacción ocurre cuando se forma un
precipitado rojo/naranja en el tubo de ensayo.
*El cambio de coloración de azul a rojo-naranja y la aparición del precipitado del mismo color en el tubo
de ensayo es un resultado positivo porque se forma el ion cuproso a partir del ion cúprico del reactivo
de Benedict; este primer ion precipita en forma de Cu2O por el medio alcalino presente. Este proceso
refleja una reducción del cobre, lo que necesariamente implica una oxidación de otra especia, este
especie es el aldehído del carbohidrato sometido a la prueba que forma el ácido carboxílico
correspondiente. La reacción sólo es posible para azúcares que tienen el aldehído libre del carbono
anomérico para poder reaccionar. Si el aldehído se encuentra impedido, es decir formando un enlace
glucosídico o en su forma hemiacetal, no se efectúa la reacción de oxidación y el reactivo de Benedict
no sufre cambio alguno.
*La técnica sugiere usar tubos de ensaye para poder emplear poca cantidad del reactivo y además ser
más fácil su manipulación. *El azúcar adicionada es la que será caracterizada por la prueba, se adiciona
una pequeña cantidad para hacer el muestreo. *Para generar el baño de agua a ebullición se utiliza
una solución de salmuera muy concentrada para permitir una mayor temperatura del agua por
propiedades coligativas. *El reactivo de Seliwanoff lo que identifica son cetosas de aldosas, ya que se
deshidratan rápidamente en presencia del medio ácido para dar un hidroximetilfurfural, el cual forma
un compuesto aromático con el resorcinol que es de color rojo.
*Este procedimiento distingue cetosas de aldosas, porque estas primeras se deshidratan mucho más
rápido que las aldosas. *El baño es para favorecer la reacción de deshidratación; pero si el
calentamiento es prolongado la transposición es favorecida, lo que ocasionaría falsos positivos, por ello
sólo se calienta de 1-3 minutos.
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d) Identificación de Pentosas (Test de Bial).

En un tubo de ensaye adicione
0.1 mL de una disolución 0.5% de
azúcar correspondiente y 1.5 mL
de reactivo de Bial y caliente en
un baño de agua en ebullición por
un lapso máximo de 2-3 minutos.
*La técnica sugiere usar tubos de ensaye para poder emplear poca cantidad del reactivo y además
ser más fácil su manipulación. *El azúcar adicionada es la que será caracterizada por la prueba, se
adiciona una pequeña cantidad para hacer el muestreo. *Para generar el baño de agua a ebullición se
utiliza una solución de salmuera muy concentrada para permitir una mayor temperatura del agua por
propiedades coligativas. *El reactivo de Bial contiene orcinol en ácido clorhídrico y cloruro férrico, el
cual forma complejos de coloración sólo con las pentosas.

Las pentosas dan una coloración
azul-verde o verde olivo.
*Este procedimiento distingue pentosas de hexosas, porque estas primeras se des deshidratan mucho
más rápido que las hexosas; las pentosas dan lugar a la formación de un hidroximetilfurfural, el cual
forma un compuesto con el orcinol de color azul-verdoso. *El baño es para favorecer la reacción de
deshidratación; pero si el calentamiento es prolongado se da la formación de compuestos coloridos que
dan falsos positivos, por ello sólo se calienta de 2-3 minutos.

e) Hidrólisis de Almidón.
Coloque en un matraz de 125 mL provisto de
una barra de agitación magnética, 0.6 gramos
de almidón soluble y enseguida adicione 40 mL
de agua. Calentar a ebullición. Dejar enfriar a
temperatura ambiente. La prueba de Lugol y
Benedict son llevadas en paralelo.
*Se calienta el agua porque se necesita que esté a ebullición porque el almidón es soluble
en caliente. *Para generar el baño de agua a ebullición se utiliza una solución de salmuera
muy concentrada para permitir una mayor temperatura del agua por propiedades
coligativas. *El almidón se pesa directamente en el matraz con ayuda de una balanza
analítica. *Las pruebas se llevan en paralelo porque se tiene sólo una disolución de
almidón para ambas.

Coloque en dos tubos de ensaye 1 mL de
disolución de almidón (T0 Lugol y T0 Benedict).
Después se introduce la disolución de almidón
a un baño de agua a ebullición y se le agrega 1
mL de HCl concentrado. Se toma 1 mL de esta
nueva disolución y se toma como Tx
*Se toma estos T0 porque serán los blancos para ambas pruebas respectivamente, ya
que en ese momento el almidón no está nada hidrolizado, y se agregan en tubos de
ensayo para contener su volumen. *Se agrega HCl concentrado para realizar la hidrólisis
del almidón junto con el agua del medio y se vuelve a introducir la disolución de almidón
al baño para fomentar la hidrólisis. *Se toma otro tubo (Tx) para que sirva para contabilizar
las gotas de NaOH 10% necesarias para neutralizar el exceso de HCl en el medio.

A Tx se le agrega un pedazo de papel pH y se *Se le agrega el pedazo de papel pH dentro del tubo Tx para observar el pH del medio
le agregan cuantas gotas de NaOH 10% sean (ácido) y posteriormente las gotas de NaOH son para neutralizar este exceso. Cuantas
necesarias para neutralizar la muestra. gotas sean necesarias, son las que serán agregadas a cada tubo para Benedict.

PRUEBA DE LUGOL.
La disolución de almidón se deja en el baño y
cada 5 minutos se toma una alícuota de 1 mL,
la cual se vierte en un tubo de ensayos
etiquetado. Después cada tubo se introduce en
un baño de hielo.
*Se contabiliza cada 5 minutos para ir observando el avance de la hidrólisis del almidón
a través del tiempo. El tiempo empieza en cuanto se le agrega el HCl y es calentado el
almidón en el baño. *Se vierten en tubos de ensayo para su fácil manipulación y para
construir una serie visual de la hidrólisis del almidón. *Se introduce en hielo porque el
complejo formado es soluble en caliente, y las hélices del almidón se modifican y liberan
al yodo de su estructura; pero si se encuentra frío se coordina nuevamente el yodo a ellas.

Se para a los 35 minutos (7 tubos). Una vez
fríos los 7 tubos y T0 se les agrega 1 gota de
disolución de yodo-yoduro (Lugol) y se observa
el cambio de coloración en cada tubo.
*Se para a este tiempo porque de esta manera se obtienen 7 muestras, suficientes para
construir la serie comparativa deseada. A todos los tubos, incluido el blanco se les agrega
una gota de Lugol para realizar la prueba cualitativa de hidrólisis del almidón. Se espera
que a menor hidrólisis la coloración se más azul y a mayor hidrólisis naranja. *Los tubos
deben estar fríos por las razones mencionadas anteriormente.

PRUEBA DE BENEDICT.
De la misma disolución de almidón que está en
el baño se toma cada 5 minutos una alícuota de
1 mL, la cual se vierte en un tubo de ensayos
con las gotas de NaOH 10% necesarias para
neutralizar (contabilizadas en Tx).
*Se contabiliza cada 5 minutos para ir observando el avance de la hidrólisis del almidón
a través del tiempo. El tiempo empieza en cuanto se le agrega el HCl y es calentado el
almidón en el baño. *Se vierten en tubos de ensayo para su fácil manipulación y para
construir una serie visual de la hidrólisis del almidón. *Se agregan las gotas de NaOH
para neutralizar el exceso de ácido agregado y romper la forma hemiacetal y pasar a la
lineal para poder ser oxidada. Se deben agregar antes de verter la alícuota en el tubo de
ensayo.

Se para a los 35 minutos (7 tubos). Una vez
listos los 7 tubos y T0 se les es agrego 1 mL de
reactivo de Benedict. Se calientan todos juntos
en el baño de agua a ebullición y se observan
los cambios ocurridos en cada tubo.
*Se para a este tiempo porque de esta manera se obtienen 7 muestras, suficientes para
construir la serie comparativa deseada. A todos los tubos, incluido el blanco se les agrega
1 mL del reactivo de Benedict para realizar la prueba cualitativa de hidrólisis del almidón.
*Se espera que a menor hidrólisis la coloración se azul del reactivo y a mayor hidrólisis
sea rojiza/naranja por la formación del sólido producto de la reacción redox.

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Resultados.

Tabla No. 1: Resultados pruebas a-d.

Carbohidrato Glucosa Galactosa Ribosa Sacarosa Arabinosa Maltosa Lactosa Fructuosa
Tiempo (min) 5:30 1:30 2:10 3:00 4:52 17:02 18:24 x
Benedict + + x - x x x -
Seliwanoff - - - + - - - +
Bial - - + - + - - -

a) Identificación de Monosacáridos (Test de Barfoed).

Imagen No. 1: Test de Barfoed.

b) Prueba de Benedict.

Imagen No. 2. De izquierda a derecha: Sacarosa, Fructuosa, Glucosa, Galactosa.

c) Identificación de Cetosas (Test de Seliwanoff).

Imagen No. 3. De izquierda a derecha: Sacarosa, Fructuosa, Galactosa, Lactosa,

Glucosa, Maltosa, Ribosa, Arabinosa.

d) Identificación de Pentosas (Test de Bial).

Imagen No. 4. De izquierda a derecha: Glucosa, Lactosa, Ribosa, Galactosa,

Fructuosa, Arabinosa, Maltosa, Sacarosa

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e) Hidrólisis de Almidón.

Imagen No. 5. Prueba de Lugol, de izquierda a derecha: T0, 5´, 10´, 15´, 20´, 25´, 30´, 35´.

Imagen No. 6. Prueba de Benedict, izquierda a derecha: T0, 5´, 10´, 15´, 20´, 25´, 30´, 35´.

Análisis de Resultados.

a) Identificación de Monosacáridos (Test de Barfoed).

Para esta prueba de identificación los carbohidratos que dieron positivo fueron: glucosa, galactosa,
ribosa, sacarosa y arabinosa; fue así porque estos carbohidratos son monosacáridos. El tiempo de
reacción con la prueba de Barfoed para éstos fue menor a los 15 minutos y la reacción redox fue
llevada a cabo rápidamente (se nota la formación de Cu2O sólido). En cuanto a la lactosa y maltosa
la prueba fue negativa porque no son monosacáridos, y en ambos tubos no se apreció la formación
de precipitado alguno porque la reacción redox no se suscitó, lo anterior debido a que al ser
disacáridos tienen un enlace glucosídico que no permite la liberación del carbono anomérico,
impidiendo tenerlo en su forma línea y por ende la oxidación al ácido correspondiente.

b) Prueba de Benedict.
La prueba de Benedict es muy similar a la de Barfoed ya que da los mismos resultados, debido a
que el fundamento teórico es el mismo: disponibilidad del aldehído para ser oxidado y poder reducir
al cobre presente en el reactivo. Para las azúcares reductoras la prueba fue positiva, presentando la
formación de un sólido naranja/rojo en el tubo, producto de la reducción de Cu(II) en Cu(I) presentado
en forma de Cu2O sólido; estas azúcares fueron: fructuosa, glucosa y galactosa. De entre ellas, la
que menor coloración naranja presentó fue la fructuosa, ya que debe enolizarse para poder ser
oxidada y esto hace que la reacción sea menos cuantitativa que con la glucosa. La sacarosa dio
negativa a esta prueba porque es un dímero de glucosa y fructuosa, lo que ocasiona que no se
pueda oxidar porque la glucosa está en forma hemiacetal con la fructuosa, dejando al aldehído
impedido y no libre para ser oxidad y reducir al cobre.

c) Identificación de Cetosas (Test de Seliwanoff).

En esta tercera prueba los únicos carbohidratos que dan positivo son la sacarosa y la fructuosa, ya
que presentan la coloración rojo cereza intensa esperada por la formación del compuesto aromático.
Al ser las únicas cetosas sometidas a esta prueba fueron las que reaccionaron rápido a la
deshidratación y las que dieron indicio de coloración. Las demás azucares dieron un color tenue o
incoloro debido a que eran aldosas y éstas reaccionan más lento que las cetosas; el tiempo de
calentamiento fue de 2:00 minutos y por ello son se pudo completar la deshidratación para ellas. Si
el tiempo de calentamiento hubiese sido mayor, probablemente se hubieran tornado coloridas las
que no lo fueron, dando falsos positivos por haber favorecido la transposición, pero en este caso no
sucedió porque el tiempo fue corto.

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d) Identificación de Pentosas (Test de Bial).

La prueba de Bial dio positiva para la arabinosa y la ribosa, debido a que estas dos fueron las únicas
pentosas analizadas, todas las demás azucares no lo eran. Esta prueba es positiva para las pentosas
porque se deshidratan más rápido que las hexosas en presencia de HCl. Al deshidratarse forman un
furfural que genera un complejo colorido con el orcinol.

e) Hidrólisis de Almidón.
Por último para la hidrólisis del almidón ambas pruebas revelan lo mismo: a medida que el
calentamiento avanza después de haber sido agregado el HCl, la hidrólisis es mayor. Para la prueba
con Lugo el T0 que contenía la disolución de almidón original presentó una coloración azul intensa,
lo que refleja que el yodo estaba coordinado en las hélices del almidón. A medida que la hidrólisis
fue avanzando esta coloración azul se volvió morada, después rojiza y al final naranja/amarilla, esto
sucedió ya que conforme la hidrólisis se realizaba se rompían los enlaces glucosídicos del almidón,
provocando que sus hélices se fueran destruyendo y el yodo fuese liberado al medio, tornando a la
disolución del color que es el Lugol (naranja/amarillo). Se tuvo que enfriar porque el complejo
formado es soluble en caliente.

Para la prueba con el reactivo de Benedict primero se tuvo que agregar unas gotas de NaOH 10%
para poder tener un medio alcalino (neutralizando el HCl presente) para favorecer la forma lineal del
azúcar. Fue importante tener al carbohidrato en esta forma para que de esta manera pudiera ser
oxidada en mayor proporción. Se pudo notar mayor formación de precipitado a mayor tiempo de
calentamiento del almidón, lo que refiere directamente que a mayor hidrólisis mayor oxidación del
carbohidrato; lo anterior es porque al romperse los enlaces glucosídicos en la hidrólisis, se fomentó
la liberación del carbono anomérico, lo que propició la oxidación del azúcar y la reducción del
cobre(II) del reactivo a cobre(I).

Conclusión.
Se pudo identificar cualitativamente diferentes carbohidratos mediante reacciones simples
características. Se diferenció una pentosa de una hexosa, una aldosa de cetosa y un disacárido
frente a un monosacárido. También se logró diferenciar las reactividad de un mono, di y polisacárido
en reacciones de identificación de carbohidratos.

Bibliografía.
• Química orgánica. McMurry J. Editorial Cengage learning SA de CV, 7a edición, 2008.
• Lehninger. Principios de bioquímica. Omega, Barcelona, 2000.
• Flores, J. (2002). Reacciones de Identificación de Carbohidratos. Caracas: UPEL.
• Wade, L. G. (2004). Química Orgánica (4° ed.). Madrid: Pearson Prentice Hall.