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Desde la propia vida depende casi incomprensiblemente enzima equilibrada• mediado sustrato
específicas de transferencia de electrones, quizá no sea sorprendente que los medios para medir
los procesos bioquímicos vitales celulares implicaría sensores compuesto de las mismas sustancias.
Como avances en el pasado, los progresos dependerán en el futuro aumento de la comprensión y
el control de los enzimas, probablemente la síntesis de enzimas, una forma más sofisticada de
control de transferencia de electrones, y una estrecha interacción entre la electroquímica y la
fisiología de los sistemas vivos.
El descubrimiento clave por los hermanos Buchner, que procede de la fermentación del jugo
filtrado de células de levadura destruidas por esmerilado con arena, fue seguida en 1926 por el
éxito de Sumner en la cristalización de la ureasa, demostrando así que las enzimas eran
simplemente las proteínas. Antes de eso, su función mágica supuestamente fue creído para ser
intrínsecamente entrelazadas, en el proceso de toda la vida. La mayoría de ellos creían que las
enzimas deben ser tratadas como altamente perecederas, como huevos frescos y almacenadas en
el frío hasta que pudieran medirse o utilizados.
Mirando las enzimas como transductores químicos específicos, traducción de un analito en una
sustancia susceptible de ser detectado por un detector sensible química o físicamente, una nueva
clase de sensores, intrínsecamente sensible a compuestos biológicos, ha sido concebido y
desarrollado. Combinaciones de enzimas, como las esterasas, dehydrogenases y oxidasas y de
detectores, como por ejemplo, conductimetric polarographic, potenciométricos, acústicas y
ópticas, ofrecen la promesa de ampliar la selectividad, sensibilidad y versatilidad de estos
detectores. La primera enzima electrodos invocado enzimas atrapado físicamente sobre o muy
cerca de la superficie del sensor. Posteriormente, la inmovilización, la química insolubilization, o
técnicas de fijación fueron adoptados. Co• enzimas ve también ha sido física y químicamente
adherida. Insolubilization como medio de enzima la prolongación de la vida puede tener la ventaja
de que evita las complicaciones de fuerzas osmótica coloide, especialmente cuando las
membranas permeables al analito se utilizan en conjunción con una enzima de electrodo.
Idealmente, los biosensores basados en enzyrne debería, al igual que los revolucionarios de los
gases en sangre y electrodos de pH, trabajar directamente en sangre entera sin diluir.
Fig. 1.1 La electrólisis. En el ánodo (A) Los electrones son removidos del sustrato y la oxidación
ocurre. En el cátodo (C) electrones (e) se añaden y reducción ocurre. El potencial aplicado controla
el tipo de reacciones en cierta medida. La corriente (I), por convención, fluye en la dirección
opuesta. El
Polarography depende de la electrólisis (Fig. 1.1). Los inicios de la enzima polarographic electrodo
puede ser encontrada en la caída del electrodo de mercurio (Fig. 1.2) de Heyrovsky (1960), en los
años transcurridos entre las dos guerras ha aclarado la naturaleza electroquímica de la interfaz
entre el metal, el potencial aplicado, y las reacciones químicas. Esto fue trabajado en aire libre
soluciones porque el oxígeno fue una gran molestia para polaro• grafía, como esta nueva ciencia
fue llamado, utilizando el electrodo de mercurio. Ha habido un esfuerzo continuo por químicos
para aumentar la versatilidad y especificidad de este método electroquímico. Desde un punto de
vista analítico, las principales ventajas de la colocando electrodos de mercurio fueron su atractivo
teórico, su reproducibilidad y sus capacidades analíticas, especialmente en las muestras tratadas
en el laboratorio. La factible aunque compleja instrumentación necesaria para adaptar el mercurio
polarography a la medición de las enzimas que se muestra en la Fig. 1.3. Pero debido a que el
mercurio líquido era potencialmente tóxicos y difíciles de usar en biología las maravillosas ventajas
inherentes en un flamante agita
la enzima 5 electrodos
+ 1,5 V
~---< G r-----',
Fig. 1.2 El Heyrovsky colocando electrodos de mercurio (Heyrovsky J 960). Es más útil en el rango
de + 0,4 - 2,6 V de la tensión aplicada. Electrodos de platino puede utilizarse entre + 0 .9 y - 0,8 V.
electrodo de mercurio cada pocos segundos no puede ser usado en muchas situaciones.
Para los muchos avances que se hicieron en fisiología por medición de oxígeno, bio• lógicamente
sólido inerte anodo y catodo superficies parecía mucho más preferible.
Muchos tipos de electrodos sólidos eran (y siguen siendo) probado. El platino era usualmente
seleccionados, en parte porque podría estar cerrado y aislado con vidrio. Pero esta sólida sin
agitación unrenewable superficie de platino fue acondicionado• taminated fácilmente por la
miríada de sustancias presentes en la sangre y los tejidos vivos.
Estos problemas han sido revisados por Davies (1962). Clark's celofán• cubiertos de platino de
cátodo de oxígeno (Clark et al. 1953) superó muchos de estos problemas, pero no fue hasta el
cátodo de platino y electrodo de referencia de plata fueron colocados en su propia eléctricamente
conductivas detrás de un micro-entorno eléctricamente no conductivo sólo gas permeable
membrana de polietileno (Clark, 1956) que una nueva forma reproducible para medir la tensión de
oxígeno en los tejidos, Iiquids, y los gases resultantes. Debido a que el oxígeno era la principal
preocupación de la biología, y no a la cuantificación del número de iones y sustancias orgánicas, el
potencial podría ser mantenida constante cuando el oxígeno fue medido con un electrodo de
platino. Muchos biosensores combinar el electrodo de oxígeno Clark mediciones con enzimas
abrochado en el electrodo de membrana.
Los biosensores, es decir, sensores que incorporan material biológico en su estructura (Fig. 1.4) se
describió por primera vez en 1962 en la Academia de Ciencias de Nueva York simposio (Clark y
Lyon, 1962). En esa presentación el uso de
V 1 ne enzima e1eccroae
5
Fig. 1.3 El aparato para la siguiente acción enzimática. (Desde Knoblock, E. (1944). Chem.
los transductores de enzimas como membrana sándwiches cerrados fue descrito para hacer
sensores electroquímicos (pH, polarographic, potenciométrico, o conductimetric) más inteligente.
Se convirtieron en específico para determinados sustratos por la detección de un producto de una
reacción catalizada por enzimas o una caída en una sustancia utilizada en la reacción. Por ejemplo,
la combinación de glucosa oxidasa con oxígeno Clark p02 electrodo para medir la glucosa,
detectando la caída cuando la glucosa fue convertida a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno se
describía.
Así que, básicamente, existen dos tipos de enzima polarographic sensores del electrodo. En uno, el
analito consume oxígeno en presencia de una enzima y la medición depende de un cambio en la
tensión de oxígeno. En el otro, la enzima que convierte el analito a una sustancia a la que el sensor
es sensible. El propósito de la enzima es transducir seï¿la sustancia de
medida, desde uno hasta que el sensor no es sensible a uno para que responda. Por esta razón, la
capa de la enzima fue originalmente conocido como un transductor. Quizás la enzima sustancia
formada, el producto de interés, debería ser llamado "transformate'. El sustrato, el analito, pasaría
a ser 'transformate', en el ambiente de la 'catholyte' o 'anolyte' en la capa de la enzima.
8 electrodos de la enzima
todavía nerviosos acerca de contaminar la superficie de platino con proteínas y coenzimas. Pero
también he añadido a la enzima del electrolito formando la ruta desde el ánodo hacia el cátodo, el
electrodo y funcionaba bien para medir la glucosa.
En 1963 yo estaba trabajando principalmente con polarography anódico para medir H20 2
formado por reacciones catalizadas por el oxígeno oxidorreductasas. Con el sensor de peróxido,
sangre entera podría utilizarse, eliminando la necesidad de centrifugación y permitir el monitoreo
continuo de sustratos como la glucosa en vivo o en una corriente que fluye en vdro. Cuando se
utilizan los electrodos de oxígeno y sus células rojas de transporte de oxígeno de la hemoglobina
tuvo que ser retirado y sólo el suero o plasma utilizado.
Por 1965 o así, yo estaba midiendo la glucosa en la sangre diluida de post operatorio• pacientes
con un electrodo de mano en un vaso de precipitados. Yo todavía era la medición de lactato por el
método Barker-Summerson y deseando que algunos• cómo un lactato oxidasa que generó el
peróxido puede ser encontrado. Aplicado para una patente en 1965 (Clark 1970) abarca la
utilización de uno o más enzimas para convertir varios sustratos, en última instancia, el peróxido
de hidrógeno. Se describió el uso de dos electrodos para habilitar la sustracción de corriente desde
un electrodo sin enzima de corriente de un electrodo con la enzima para eliminar inter• fering
corrientes. En 1969 yo había convencido a los Yellow Springs Instrument Company para llevar a
cabo el desarrollo de un analizador de glucosa dedicada para la medición directa de la glucosa en
25 microlitros de muestras de sangre entera.
Y para 1974 el modo! 23 analizador YSI, después de algunos pasos inciertos, aparecieron en el
mercado.
Debe tenerse en cuenta que tanto la enzima utilizada y el propio electrodo polarizado generar
productos, subproductos, si quieres, que son necesariamente nqt quería y que pueden
obstaculizar la reacción deseada. Por ejemplo, fenol, cuando oxidó, produce un negro brillante
depositar sobre la superficie del electrodo, lo cual altera su reactividad química y también puede
producir una capa de aislante eléctrico. También es importante que los productos no deben
afectar a la actividad de la enzima. Lo mejor es cuando los productos de la reacción son solubles
en agua y pueden difundir lejos. En el caso de la glucosa oxidasa• basado ánodo, los productos son
el peróxido de hidrógeno, gluconolactone, gluconato, agua y oxígeno, todos los cuales son muy
solubles y diffusable.
Una solución para interferir polarographically sustancias activas en la muestra, es construir las
membranas que impiden que las sustancias no deseados lleguen a la superficie de platino. Esto
requiere dos membranas, la interna impide la permeación de cualquier sustancia no deseada, el
exterior permitiendo el paso de la capa en el sustrato de la enzima, y normalmente las
interferencias de fondo. Un número de dicha combinación patentada de membranas se han
desarrollado y varios están en el mercado. Los electrodos de glucosa y lactato YSI, por ejemplo,
utilizar un acetato de celulosa y poli carbonato• Nuclepore combinación.
El avance de las técnicas polarographic desde las primeras dos electrodos Electrodos a tres
sistemas, a pulso a pulso diferencial polarography,
la enzima
Muchos de los sustratos que han sido medidos por el uso de oxígeno oxidorreductasas están
incluidos piruvato, lactato, glucosa, galactosa, el alcohol, el colesterol, el glicerol, hipoxantina,
xantina, oxalato, y fructosa. El ingenioso uso de ferroceno para mediar en la transferencia de
electrones de un sensor basado en la oxidasa para medir la glucosa es digna de nota (Cass et al.
1984; Aston, este volumen, el capítulo 16; Cardosi y Turner, este volumen, el capítulo 15).
Oxidorreductasas oxígeno nuevo, que se encuentra en las primitivas formas de vida tales como los
hongos, están siendo descubiertos cada año, pero muchos más se han encontrado
dehydrogenases, generalmente en mayor plantsand Iife formas de animales. Racine et al.
Capacidades de medición de glucosa rápida deben ser una parte de cada unidad de pediatría.
Dicha ronda el reloj disponibilidad de mediciones de glucosa, entre otras cosas, podría proteger a
los niños de hipoglucemia peligrosa antes de la cirugía. Lactato piruvato y, posiblemente, las
mediciones deben estar disponibles. Los residentes de pediatría y enfermeras deben aprender a
calibrar el biosensor• instrumentación basada de manera que la glucosa y el lactato se pueden
ejecutar al mismo tiempo oen las mismas muestras utilizado para gases en sangre y pH.
Las mediciones de la tensión de oxígeno conjuntival han sido iniciadas por Fatt.
El carácter único de la circulación palpebral que realizar continuas p02 (así como C02 y, quizás, pH)
vigilar posibles podrían ser de valor para el control de la glucosa. Un biosensor bajo el párpado
puede estar entre "invasores" y '' no invasivos. Quizás la grabación continua de acondicionado•
junctival lactato será posible. Monitoreo continuo de glucosa en la sangre sería valiosa en el
trabajo de parto y el parto por embarazada diabéticos.
lU 1 ne enzima e1ec1roae
15-30 14m. La galactosa oxidasa electrodo es sensible a la rafinosa, utilizado en los últimos
estudios, así como a la galactosa, glicerol, fructosa y dihidro• xyacetone. La naturaleza de esta
enzima está relacionada con electrodo confe! Solución potencial en una manera interesante
(Johnson et al. 1982). Hay varias maneras interesantes para acoplar la actividad oxidasa a otros
sustratos (Hopkin, 1985).
Para uso en sangre o sin diluir para electrodos implantados debe ser remem• bered que el oxígeno
oxidorreductasas ('oxidasas') requieren oxígeno y, a menudo, su tasa de oxidación del sustrato es
una función del oxígeno normalmente no function p02• Sin porque el transformate no será
generado por la enzima. (Enfors 1983; Cleland y Enfors, 1983) ha proporcionado oxígeno por
generación anódica de oxígeno en la capa de la enzima, midiendo la fermentación analito según el
oxígeno de la corriente necesaria para mantener constante la presión de oxígeno (Fig. 1.5). La
necesidad de fermenta• ción in situ los biosensores son paralelas a las de implante quirúrgico.
Clark y Sachs
(1968) habían utilizado anteriormente un principio oxystat similares pero el oxígeno fue agregado
a partir de una solución saturada por un sistema serva. Recientemente, se ha demostrado (Clark et
al. 1987) que suficiente oxígeno gaseoso puede ser suministrada desde un tambor de silastic
implantados para hacer un sensor de glucosa integral que es
(1981) han descri p02 independiente. Gough y cama Leypoldt medios de suministro de oxígeno a
los sensores de glucosa. ·
Fig. 1.5 oxidasa-base se suministra con electrodo de oxígeno electrolítico Enfors (desde
1983).
J. L. et al.
Un dispositivo barato para supervisar el consumo de alcohol en sangre, quizás a través de la piel,
podría ser concebido. Medicina de urgencias tiene necesidades especializadas donde resultados
rápidos puede salvar la vida.
Pero quizá el mejor futuro para electrodos de enzimas será como biosensores en o sobre el
cuerpo. Sensores, como para Jactate y glucosa, se haría sobrepasar• ingly pequeños e
incorporarse en catéteres intravasculares para monitorizar pacientes críticamente enfermos (Clark
el al. 1988; Clark y Duggan, 1982). • La importan cia de lactato sanguíneo como una medida de la
adecuación de la oxigenación tisular, o el gasto cardíaco, no puede exagerarse. Hay evidencia,
también, que un alto lactato materna durante el trabajo de parto puede tener un efecto
perjudicial sobre el recién nacido.
La hipoxantina puede resultar una valiosa integrador de hipoxia. Los sensores de glucosa
implantable será casi seguramente ideó capaces de controlar bombas de insulina (Clark el al.
1988). Este uso en la diabetes por sí sola justificaría el enorme esfuerzo en la combinación de
enzimas y electroquímica.
Referencias
Plotkin, E. V., Scott, L. D. L. y Turner, A. P. F. (1984). Ferroceno enzima mediada por electrodos
amperométricos determinación de glucosa. Anal. Chem. 56, 667-71.