1.

INTRODUCCIÓN
2. TÉCNICAS
3. DESARROLLOS
4. BIOSEGURIDAD
a. POSIBLES IMPACTOS
b. ANÁLISIS DE RIESGO
 Mouse
Metallothionein
N-terminal exon
Promoter
Intron

Activation Rat growth

by Cd2+ Hormone
gene

Palmiter et al., 1982

• Mejoras económicas en el cultivo de peces
– incremento en la tasa de crecimiento
– incremento en la porción comestible
– mejores tasas de conversión alimenticia
– utilización de dietas de bajo costo (carbohidratos)
– resistencia al frío y a la congelación
– resistencia alas enfermedades
– mayor fecundidad
– control de la reproducción
– menor agresión
• Diseño de peces para el mercado
– apariencia externa: peces para alimentación ó peces ornamentales
– sabor, textura
– composición de ácidos grasos
• Peces como bioreactores
– producción de compuestos de importancia médica
• Investigación básica, desarrollo, crecimiento y reproducción

Aleström & de la Fuente, 1999

Coss Pacheco y
Rebordino González, 2015
VENTAJAS DE LA TRANSFERENCIA DE
GENES EN LOS PECES

 ALTA FECUNDIDAD
 GAMETOS FACILMENTE DISPONIBLES
(DESOVES DE MILES DE HUEVOS)
 MAYOR NUMERO DE INDIVIDUOS
TRANSGENICOS PRODUCIDOS

 FERTILIZACION E INCUBACION
EXTERNA
 SE EVITAN LOS PROBLEMAS DE
FERTILIZACION IN VITRO Y
REIMPLANTACION
 LA FERTILIZACION SE PUEDE RETRASAR
POR UN PERIODO DE TIEMPO
CONSIDERABLE DESPUES DE LA COLECTA
DE HUEVOS
 (DIAS EN EL CASO DE SALMONES) SIN
VARIACIONES APRECIABLES EN SU
VIABILIDAD
 GRAN TAMAÑO
FACILITA EL MANEJO,
ROBUSTOS Y GRANDES
(DE 1 A 7 mm DE DIAMETRO)

ACCION DE
FRECUENCIAS DE SECUENCIAS
INTEGRACION REGULADORAS
IGUALES O MAYORES SIMILARES A LAS
A LAS REGISTRADAS DE LOS
PARA RATONES (10 – VERTEBRADOS
70 %) SUPERIORES
 CEBRA MEDAKA

Danio rerio Oryzias latipes

• Tiempo generacional corto

• Facilidad y costo de mantenimiento
• Rápido desarrollo
• Transparencia de los embriones
 GENES REPORTEROS
d-cristalino de pollo
CAT
PARTICULARMENTE UTIL
EXPRESION PUEDE SER DETECTADA A NIVELES
EXTREMADAMENTE BAJOS
Sacrificio
LA ACTIVIDAD ES MAS FACIL DE DETECTAR Y
CUANTIFICAR QUE LA SECUENCIA DE DNA

b-GALACTOSIDASA
TEST COLORIMETRICO ALTAMENTE
ESPECIFICO

Luciferasa
Tamiya et al., 1990
Amsterdam et al., 1995
• Promotor de la queratina krt8 (solo visible bajo luz fluorescente) y
un promotor específico de las células musculares mylz2 (visible sin
necesidad de luz fluorescente)
• Mezclaron líneas de diferentes colores
• Y utilizaron promotores con expresión gradual
 VENTAJAS

 Observación en vivo de la expresión de los

transgenes

 Se pueden utilizar los mismos embriones a

diferentes etapas para obtener un patrón dinámico
de expresión
Kaede
 Aislada del coral
Trachyphylia
geoffroyi
 Fotoconversión
irreversible de
verde a rojo bajo
luz ultravioleta o
violeta
• Metalotioenína

• Proteinas de shock calórico

Adam et al., 2000

• Estudios de migración celular
• Proyección axonal

Halloran et al., 2000

 MICROINYECCION
 INFECCION RETROVIRAL
 TRANSPOSONES
 TRANFERENCIA BALISTICA
 ELECTROPORACION
 PIGGYBACKING
 LIPOFECCION
terminal inverted repeats terminal inverted repeats

The Sleeping Beauty (SB)

transposon system
Targeting-Induced Local Lesions In Genomes Transcription Activator-Like Effector Nucleases

(N-Nitroso-N-ethylurea)
Murphey & Zon, 2002
 Stable transgenic line 1 Stable transgenic line 2
ACTIVATOR EFFECTOR
specific areas of the fish tissue GAL4 DNA-binding motif
(upstream activating sequence - UAS)
KalTA4
Promoter

Kal
yeast transcription factor TA4 Drives the GOI

Tissue-specific expression Lasting activation

progeny of this cross

Kal
TA4

Lasting
transcriptional activation

Heberlein et al.,2004
Wong & Van Eenennaam, 2008
Heat induced Cre

Yoshikawa et al.,2008
Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
(CRISPR)-associated Cas9

Nucleasas dirigidas por RNA

1983 EN RESPUESTA A LOS PROBLEMAS ENFRENTADOS
POR LA INDUSTRIA ACUICOLA CANADIENSE
 DOS MANERAS POTENCIALES EN LA
QUE LA TECNOLOGIA DE
TRANSGENICOS PODRIA SER USADA
PARA RESOLVER EL PROBLEMA

1) PRODUCIR SALMONES RESISTENTES AL

FRÍO

2) ELEVAR LAS TASAS DE CRECIMIENTO,

PARA EVITAR LA NECESIDAD DE
CULTIVARLOS EN INVIERNO
 Promueve la Promueve la
mobilización de retención de
lípidos nitrógeno
Promueve la
incorporación de
Mejora la FCR
aminoácidos en
los tejidos

Promueve el
desarrollo y
Estimula el apetito
maduracióndel
intestino

Regulación del
metabolismo de
nitrógeno, lípidos,
carbohidratos y
minerales
GH Mejora la
capacidad
digestiva
DOS GENES OFRECEN EXPECTATIVAS DE
GRAN VALOR PARA LA ACUACULTURA
GH y AFP
LA TRANFERENCIA DE ESTOS GENES EN ADICION A SU
INCORPORACION, HERENCIA Y PERSISTENCIA EN LOS
HUESPEDES REQUIERE ADEMAS DE:

NIVEL DE
EXPRESION CAPACIDAD DE
EXPRESION
DEL MANIPULAR
SUFICIENTE
TRANSGEN EN LOS NIVELES
PARA MEDIAR
LOS TEJIDOS DE EXPRESION
UNA ACCION
APROPIADOS IN VIVO
FISIOLOGICA
 Environment

GnRH TRH CRF GHRH SRIF

GTH TSH ACTH GH

GH CATECHOLAMINES

T4

GONADAL STEROIDS CORTISOL IGF INSULIN

T3

Somatic Growth
Funcionamiento diferente del
sistema endócrino de los peces transgénicos (GH)

• Los transgenes de GH se
incorporan en prácticamente
todos los tejidos
• Ausencia de expresión de GH
en la pituitaria de algunas
especies (regulación negativa)
- Niveles plasmáticos de IGFs
son muy bajos
- Altos niveles de mRNA de
los IGFs en los hepatocitos y
el músculo
– Acción autócrina o parácrina
 APETITO
• El apetito en los peces transgénicos no esta
directamente influenciado por los IGFs
• Se han observado niveles bajos de Grehlina
y del neuropeptido Y (moléculas
orexigénicas) en peces transgénicos, a
pesar de mostrar una gran motivación por
alimentarse
• Los niveles de CCK (hormona
anorexigénica) cerebrales no fluctúan
estacionalmente, como sucede con los
peces no transgénicos
• Continúan alimentándose aún en invierno,
contrariamente a los no transgénicos
Fletcher et al., 1999
Lee et al. (2009)
Devlin et al., 2007
Pitkänen et al., 1999
Rahman and McLean, 1999
Abass & Dunham, 2015)
Misgurnus mizolepis
(Cypriniformes, Cobitidae)

Promotor β-
actina ligado a
GH

Crecimiento
>35 veces
(Nam et al. 2001)
Notothenioid and Channicthyid fish

Antifreeze
 n= 4 to 88
m.w.= 2,600 to 56,000 Da
Freezing Avoidance in Frigid Marine Environment
 The other half of the story:
AFGP in Northern Gadids (Cods)
Polar cod
B. saida

Saffron cod
E. gracilis

Greenland cod Atlantic cod

G. ogac G. morhua

Antarctic notothenioid : AAT-AAT-PAT-AAT-PAT-AAT-AAT-etc

disac disac disac disac disac disac disac

Northern cod : AAT-AAT-PAT-AAT-PAR-AAT-AAT-etc

disac disac disac disac disac disac
 Antifreeze
Peptides
(4 types)
• Type I: 3-4 kDa

• Type II: ~14 kDa

• Type III: 7 kDa

14 kDa

• Type IV: ~15 kDa

Pitx1 gene

(Chan et al, 2010)

• No hay riesgo de virus o priones
• Se producen de 5 a 27 mg de
proteina recombinante por g de
músculo
• Comparable con lo que se produce
en leche (10mg/g)

• Factor de coagulación VII

• Vacuna contra Hepatitis B
• gLH en huevos de trucha
• IGF1 y 2 en huevos de cebra
1. Promotor de vtg y CYP1
• Sensibles a distintos disruptores ambientales
estrogénicos (estradiol, dietilstibestrol, bisfenol-
A etc.)
2. Promotor de proteinas de shock calórico
(hsp25) sensible a metales pesados
3. Diferentes construcciones sensibles a
agentes oxidantes
Fang & Miller, 2012

Radicales libres

O2

Peroxidación
de
lípidos
• Tilapias transgénicas que producen insulina
humanizada en sus corpúsculos de
Brockmann
• Encapsulamiento de los corpúsculos para evitar
rechazo
• Éxito en el transplante a ratones diabéticos
• Se restauraron los niveles de glucosa adecuados

Wright & Pohajdak, 2000

White et al., 2013
 Induction of liver tumors in TO(Myc) fish.

Li Z et al. Dis. Model. Mech. 2013;6:414-423

©2013 by The Company of Biologists Limited
• Modelos para
estudios sobre
cancer
• Mismos
mecanismos
básicos de
regulación
genética en
carcinogénesis
• Expresión de
oncogenes

Langenau et al., 2003, Chen, 2007

ANGIOGÉNESIS RESPUESTA ANTI-INFLAMATORIA
Cross et al. 2003 LIU et al. 2003
• Expresión de proteinas de IHNV, VHSV
• Inmunidad por expresión de péptidos anti-
bacterianos
• Imunizados antes de que haya madurado su sistema
inmunológico
• Cecropina-B (promotor de CMV), péptidos catiónicos de
Hyalophora cecropia en bagre y medaka
• Propiedades bacteriolíticas y anti-virales
• Gen de la lactoferrina (promotor de b-actina) en carpa
• Lisozima de pollo con mayor actividad bacteriolítica
(promotor de keratina) en cebra y platija

Hew et al., 1995; Hepell & Davis, 2000; Dunham et al., 2002, Sarmasik et al, 2002; Lorenzen & LaPatra, 2005; Yazawa et al., 2006
CARPAS SIN HIJAS
 • Metabolismo de Carbohidratos
• Trucha: transportador de glucosa, Hexokinasa
• Metabolismo de Lípidos
• Cebra: D5 Y D6-desaturasa
• Metabolismo de Fosforo
• Medaka: fitasa
• Metabolismo Vitamina C
• Trucha: L-gulono-gamma-lactona oxidasa

Krasnov et al., 1998; Hostetler and Muir 2004; Heather et al., 2005 Alimuddin et al., 2005, 2007;
 IMPACTO

POSITIVO NEGATIVO

NEUTRO

CORTO PLAZO LARGO PLAZO

 TOLERANCIA A
FACTORES FISICOS
DEL MEDIO

MODIFICACION MODIFICACION COMPETENCIA

DE HABITATS DE AREAS DE INTRA-E-INTER-
PREFERENCIALES REPARTICION ESPECIFICA

COLONIZACION DE NUEVOS MEDIOS

 PURGA

GMO tiene una menor adaptación – el más seguro

Pew, 2003
 EXPANSION

Pew, 2003 GMO tiene igual o mayor adaptación

 GEN DE TROYA

Efectos antagónícos en dos componentes adaptativos propician el

descenso de la población Pew, 2003
 2004

• MACHOS DE MEDAKA TRANSGENICOS (GH)

 4 VECES MAYOR PROBABILIDAD DE REPRODUCIRSE
 30% MAS SUCEPTIBLES A MORIR QUE SUS SIBLINGS
NO TRANSGENICOS
• MODELO
 60 TRANSGENICOS MEZCLADOS EN UNA POBLACION
DE 60,000 NO TRANSGENICOS
 40 GENERACIONES CON PREVALENCIA DE
TRANSGENICOS CON MAYOR ÉXITO REPRODUCTIVO
 PRODUCCION CONTINUA DE CRIAS QUE MUEREN
PRECOZMENTE

• EXTINCION DE LA POBLACION
Pennington et al., 2010

wild-type medaka

transgenic medaka
side views

top view
1. Alimento abundante y sin predación mayor número de transgénicos
2. Alimento abundante y predación
3. Alimento escaso sin predación
4. Alimento escaso y predación
• ¿Purga?

• ¿Expansión?

• ¿Gen de
Troya?

Las truchas arco iris transgénicas son 37 más grandes al alcanzar la

madurez sexual y tienen una menor viabilidad juvenil
• ¿Ingestión sin riesgos?
• Equivalencia sustancial
• No hay estudios de largo plazo
• Ecosistemas naturales
• Medidas de contención
• Construcciones que podrían representar un riesgo
• GH, recombinasas, resistencia a enfermedades
• Especies nativas (endémicas)
• Especies con potencial invasor
• Técnologías emergentes
• Análisis de riesgo
• El nivel de contención requerido para un
transgen en particular dependerá del
riesgo potencial que pueda causar en la
naturaleza (Devlin et al., 2006)

• NRC (2004) recomendó el uso simultaneo

de múltiples estrategias de contención
(Norwegian Directorate of Fisheries 2009)

Además de escapes masivos, 2% de los salmones cultivados escapan

Se estiman 2 millones de escapes de salmones al año en el Atlántico Norte

Wong and Van Eenennaam, 2008

$$$$
• Se diseña para inducir
el 100% de mortalidad
– Cambios de
temperatura
– pH
– Tratamiento con cloro,
bromuro, ozono
• Tratamiento de
efluentes y
restauración
 NUEVOS ORGANISMOS PARA LOS CUALES:
 NO EXISTE INFORMACION RELEVANTE EN CUANTO A SU
COMPORTAMIENTO EN EL AMBIENTE NATURAL

 TAMPOCO EXISTE NINGUNA BASE TEORICA APROPIADA

PARA SU PREDICCION

 SE HAN PROPUESTO RESTRICCIONES QUE

IMPLICAN LA UTILIZACION DE ORGANISMOS
INFERTILES
Weber & Lee, 2014
 METODOS DE ESTERILIZACION
COMUNES
REDUCCION DE LA
METODOS EFICACIDAD
FERTILIDAD

IMPORTANTE
TRIPLOIDIA HEMBRAS SI POSIBILIDAD DE
PRODUCCION DE NO
ESTERILES,
SUCEPTIBLES A
ENFERMEDADES

TRIPLOIDIA MACHOS NO

TRATAMIENTO SI Posibilidad de NO
CON estériles significativa
ANDROGENOS
PRODUCCION SI
DE HIBRIDOS
?
• A escala comercial raramente se alcanza el 100%
• Varían según
– la especie,
– la variedad,
– el método,
– la calidad de los gametos
– y el sexo
• Aunque se retarda el crecimeinto ovárico, se han
reportado casos de ovocitos maduros
• Variabilidad en el crecimiento, disminución de la
resistencia las enfermedades y el stress
 PRINCIPAL FUNCION
 ESTIMULACION DE LA SINTESIS Y LIBERACION DE
GONADOTROPINAS
 LIBERACION
 DE LAS TERMINACIONES NERVIOSAS A LA PITUITARIA POR
MEDIO DE UN SISTEMA PORTA PRIMITIVO
 ESTRUCTURA
PRIMARIA
Uzbekova et al., 2000; Maclean et al., 2003; Hu et al., 2007; Xu et al., 2011
De dos a tres formas en el cerebro de los peces
Uno especie- específico GnRH1,
GnRH2 (alias chicken GnRH-II ó cGnRH-II),
GnRH3 (alias GnRH de salmón or sGnRH)
En los que tienen tres el GnRH1 es el que se libera a la
pituitaria
En los peces cebra solo hay 2 (GnRH2 y GnRH3)
El GnRH3 se libera a la pituitaria
En las truchas hay dos genes para el GnRH3, GNRH3A y
GNRH3B, localizados en diferentes cromosomas pero
codifican para lel mismo péptido
Se debe conocer cual es el predominante para su
correcta inactivación
Están relacionados con los niveles de GH y juegan un
importante papel en el desarrollo
En los cebra el knockeo del GnRH2 ó GnRH3, ó ambos
resultan en embriones con defectos en el cerebro, ojos o
corazón
• No inhiben por completo la expresión
genética
– Son eficaces contra especies relativamente raras
de RNAm
• Vida media del RNA muy corta
• Con la incompatibilidad de unas cuantas
bases (1 a 4) no se alcanzan los resultados
esperados
• Efectos colaterales tóxicos no específicos
• Reemplazo continuo de mRNAs por nuevas
transcripciones
Verdadero
efecto de
interferencia ya
que se knockean
varios genes
aparte del GOI
– Anormalidades
fenotípicas en
varios estudios

Oates et al., 2000; Zhao et al., 2001

• Análogos de DNA que
actúan
– bloqueando la traducción
evitando que se unan las sub-
unidades ribosómicas
– alteran el splicing del pre-
mRNA generando transcritos
aberrantes que dan lugar a genes
no funcionales
• Tienen sitios de
reconocimiento para los
ribosomas y utilizan
fosforodiamidato
– Mayor afinidad por el RNA que el
mismo RNA
• No los degradan las
RNAsas
Heasman, 2002
Un anillo morfolino sustituye a la ribosa o
desoxiribosa

Chen et al., 2004

Activador transcripcional
responsivo a la tetraciclina

Wong & Van Eenennaam, 2008

 Nitroreductase

zona pellucida

metronidazole
cytotoxin

atrophy of gonads

Hu et al., 2010
Xiong et al., 2013
 gradient of stromal-derived factor 1a (Sdf1a)
provides the directional cue that guides the
migration of the primordial germ cells (PGCs)
to the gonadal tissue

Richardson & Lehman, 2010

 CONTROL

Inducción de la expresión ubicuita de

Sdf1a en embriones de Danio rerio y
disrupción del patrón normal de migración
de las PGCs
Wong & Collodi, 2013
 (Tol2-CMV-GFP-pA-CMV-gal4-pA-Tol2) (Tol2-CMV-RFP-pA-5 3 UAS-as/dnd-pA-Tol2)

dead end

transcription of
antisense dnd
disrupted the
migration of PGCs,
led to their
apoptosis

Zhang et al., 2014

• Con niveles variables de fertilidad, la presión
de selección favorecería a los peces fértiles
(Muir and Howard, 2004)
• Debido a que en las operaciones acuícolas
se manejan números muy elevados de
animales, aún eventos raros de reversión a
la fertilidad serían probables (Wong & Van
Eenennaam , 2008)
• Los individuos crecen tan rápido como su
fisiología se los permite a pesar de las posibles
ventajas de ser grande
• Al llevarlos más allá de su crecimiento hay
repercusiones somáticas
• Un de las razones es que el crecimiento cuesta:
– Reducción en la velocidad de natación
– Habilidad disminuida para hipo-osmoregular
– Alteraciones hormonales (IGFs, Insulina)
– Envejecimiento precoz (desgaste de los telómeros)
– Menor cantidad de esperma

Farrel et al, 1997;Devlin, et al., 2000; DeLiang etal., 2007; Li et al., 200; Pauliny et al., 2015
 • Malformación vertebral • Menor frecuencia
• Malformación craneal reproductiva, menor
• Acromegalia fidelidad en los nidos,
• Prognatismo menor fertilización
• Sobre crecimiento de los • Menor supervivencia
opérculos ante predación
• Diferencia de color • Menor viabilidad
• Alteración en el tamaño y • Disminución de la
forma de las aletas resistencia a
enfermedades*
• Eritrocitos más pequeños,
menos hemoglobina, más • Alteraciones en
colesterol y triglicéridos diferentes órganos
(intestino, branquias,
• Menor crecimiento
músculo, hígado)
• Poca discriminación de presas
• Menor tendencia a
• Mayor habilidad reproductiva* formar cardúmenes

Devlin et al., 1995; Nam et al., 2002; Sundström et al., 2004; Li et al, 2009; Darek et al., 2011; Fitzpatrick et al., 2011; Noh et al, 2012
CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

Hong et al., 2011

small body sizes and
short generation times

Yazawa 2012
Yoshizaki et al 2012
• Gen introducido
• Especie transformada y características
• Estrategia de contención
• Movilidad de la especies (e.g. especies migradoras)
• Habilidad para volverse feral
• Aptitud relativa de la especie
• Ecosistema receptor
• Interacciones genotipo-ambiente
• Estabilidad de la comunidad receptora

Van Eenennaam & Olin, 2006

 net fitness methodology

• Viabilidad juvenil
• Viabilidad en la etapa adulta
• Edad a la madurez sexual
• Fecundidad femenina
• Fertilidad masculina
• Éxito reproductivo

Muir and Howard 2001

• Medio ambiente natural
• Incertidumbre
• Experimentos en acuarios no proveen datos definitivos
para AR
• Tres aproximaciones
1. Cámaras de comportamiento, túneles de nado,
instalaciones para reto de enfermedades
• Características fisiológicas y comportamentales individuales
2. Sistemas semi-naturales
• Microcosmos, mesocosmos (alimentación, predación, nado,
efectos metabólicos y energéticos)
3. Liberación en la naturaleza de animales equivalentes
• Variedades con crecimiento rápido o con implantes de GH
• Los salmones transgénicos no afectan a
las poblaciones no-transgénicas cuando
hay alta disponibilidad de alimento (7.5%
de su biomasa)
• Ante la escases de alimento dominaban
los transgénicos
• Les ganaban el alimento a los no-transgénicos
• Mostraban un fuerte componente agonístico y
canibalístico hacia los no-transgénicos
• Aún así mayor mortalidad de transgénicos
• Diferencias fenotípicas entre organismos
silvestres y cultivados

Devlin et al., 2004

Devlin et al., 2006
 • Reducción de nado afectaría la susceptibilidad a
ser predado
• ¿En que grado?
• Interacciones sinérgicas y antagónicas
derivadas de los efectos pleiotrópicos del
transgen

Mayor apetito y rápido desarrollo vs Mayor susceptibilidad a la predación

y menor supervivencia
EFECTO DE GH SOBRE VARIEDADES
SELECCIONADAS

Devlin et al., 2001

Sundström et al., 2014
 MARCADORES GENETICOS
 INCLUYEN SECUENCIAS GENETICAS
COMPLETAMENTE INACTIVAS Y TRIVIALES
ESTAS SECUENCIAS SON COMPLETAMENTE ARTIFICIALES Y
CONSISTEN DE HOMOPOLIMEROS DE DNA
 ESTOS PECES AL SER LIBERADOS Y AUNQUE SE
LLEGARAN A REPRODUCIR, SU PROGENIE TAMBIEN
LLEVARIA EL MARCADOR GENETICO,
ESPECIALMENTE SI LOS TRANSGENICOS FUERAN
HOMOZIGOTICOS PARA EL MARCADOR
 EL CASO DE GloFish
(Yorktown Technologies, Austin, TX)

• FDA determina no regular los Glofish en base a que

los cebra no presentan riesgo para la alimentación y
porque los cebra no transgénicos no han ejercido
impactos sobre el ambiente
• No se permitieron en California
• Se prohibió su venta, posesión e importación
• Yorktown Technologies solicita una excepción
• Los científicos del Departamento de Caza y Pesca
recomiendan aprobar una excepción
• Fue denegada por la Comisión de Caza y Pesca por
inquietudes éticas
• La Comisión vota posteriormente y decide aprobar la
excepción
• La ley estatal de California requiere de un estudio
completo de impacto ambiental
• Yorktown Technologies decide no seguir adelante
debido al costo e incertidumbre del procedimiento de
impacto ambiental
 Salmón AquadvantageTM
• Triploide
• Dos debilidades:
• 1.-La dificultad para
verificar
consistentemente la
triploidía en grandes
poblaciones
• 2.- Interferencia
reproductiva con
poblaciones
silvestres y
competencia
NRC, 2004