UERJ

INSTITUTO DE QUÍMICA - DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA

DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL

Ação enzimática – Influência da temperatura e

concentração de substrato

PROFESSOR: GUSTAVO SANTANA

DATA DE REALIZAÇÃO DA PRÁTICA: xx/09/13

DATA DE ENTREGA DO RELATÓRIO: xx/10/13

COMPONENTES DO GRUPO:

ANA CARLA FERREIRA

DOUGLAS RIBEIRO

THAIANE NOLASCO

THAMARA AZEREDO
1- INTRODUÇÃO

As enzimas são polímeros de cadeia longa com aminoácidos sucessivamente ligados

uns aos outros através de ligações peptídicas em uma sequencia determinada
geneticamente, que apresentam atividade catalítica. Sendo assim são catalisadores
das reações bioquímicas, ou seja, atuam tornando possível uma nova reação com
energia de atividade menor. Os reagentes das reações que são catalisadas
designam – se por substratos. Estes se ligam a uma zona específica da enzima, que
é o centro ativo. A ligação do substrato com o centro ativo da enzima é um
processo designado por complexo enzima-substrato. No final deste processo que se
forma o produto, a enzima é libertada na sua forma original, indicando que não é
consumida nem alterada.

Isso significa que simplesmente com a sua presença e sem serem consumidas
durante o processo, as enzimas conseguem acelerar os processos biquímicos, sua
eficiência como catalisadores é medida pelo número de transformações
moleculares, que é explicada pelo número de moléculas de substrato que uma
enzima converte por unidade de tempo, mas existem fatores que podem influenciar
a atividade enzimática, como:

- Concentração da enzima;

- Concentração do substrato;

- pH;

- Temperatura.

Se todos os fatores que influenciam a atividade das enzimas forem ótimos, quanto
mais enzimas houver disponíveis, mais rapidamente ocorrerá a reação.

Com relação a concentração do substrato, a velocidade de uma reação catalisada por

uma enzima é aumentada devido ao abaixamento da energia de ativação necessária
para converter o substrato no produto, a cinética da reação é influenciada pela
concentração do substrato e da enzima. A velocidade da reação aumenta com o
aumenta da concentração de enzima para uma mesma concentração de substrato. Se
a concentração do substrato é baixa, temos uma subutilização do sítio ativo da enzima,
e consequentemente, pouco produto é formado. Com o aumenta da concentração do
substrato, a reação tende a atingir sua velocidade máxima, isto é, produzir a máxima
quantidade de produto para uma quantidade de enzima pré-determinada – temos
assim, uma reação saturada. A partir desse momento, a quantidade de substrato
adicionado não altera mais a velocidade da reação.

Dentre os fatores que podem provocar alterações na atividade enzimática,

a temperatura pode ser destacada como o mais importante. Dentro de certos limites, a
velocidade de uma reação enzimática aumenta com o aumento da temperatura.
Entretanto, a partir de uma determinada temperatura, a velocidade da reação diminui
bruscamente. O aumento de temperatura provoca maior agitação das moléculas e,
portanto, maiores possibilidades de elas se chocarem para reagir. Porém, se for
ultrapassada certa temperatura, a agitação das moléculas se torna tão intensa que as
ligações que estabilizam a estrutura espacial da enzima se rompem e ela se desnatura.

A desnaturação proteica ocorre quando o calor destrói a integridade das proteínas em

seus estados nativos. Como as enzimas são proteínas estão sujeitas a esse processo
que podem ocasionar a perda, algumas vezes reversível, de atividade, e também
sofrem influência de substâncias que podem atuar ativando ou inibindo sua atividade.
A essas substâncias denominam-se ativadores e inibidores enzimáticos,
respectivamente. Os inibidores enzimáticos são substâncias que diminuem a atividade
da enzima, de maneira reversível ou irreversível, por mecanismos que não envolvem a
desnaturação da mesma. Dentre os inibidores reversíveis:
- inibidores competitivos: quase sempre possuem estrutura molecular
semelhante à do substrato, competindo com ele pelo sítio ativo da enzima. Assim, em
geral, a reação não ocorre enquanto o inibidor estiver ligado à enzima.
- inibidores não competitivos: liga-se a sítios distintos do substrato. Assim, é
possível ligação simultânea do inibidor e do substrato à enzima. Porém, a enzima é
inativada na presença do inibidor, estando o substrato ligado ou não.
Quanto aos inibidores irreversíveis, esses se combinam com um grupo funcional
pertencente à molécula da enzima, e que seja essencial para a atividade da mesma.
Esse tipo de inibidor pode, inclusive, promover a destruição desse grupo.
2- OBJETIVO

Verificar a influência do fator temperatura e concentração de substrato sobre a

velocidade inicial de uma reação enzimática.

3- MATERIAIS

Materiais utilizados

Tubos de Folin-Wu

Becher

Pipeta graduada

Espectrofotômetro

Cubeta de quartzo

Manta de aquecimento

Tabela 1: Materiais utilizados – Prática: AÇÃO ENZIMÁTICA – Influência da temperatura e

Concentração de substrato.

Reagentes utilizados

Água destilada

Reagente do DNS

Solução de sacarose (1,0M; 0,5M;

0,2M; 0,1M; 0,05M; 0,02M e 0,01M)
em tampão de acetato 0,0M, pH 4,7

Solução de enzima

Tabela 2: Reagentes utilizados – Prática: AÇÃO ENZIMÁTICA – Influência da temperatura e

Concentração de substrato.

4- PROCEDIMENTO E MÉTODOS

4.1- Influência da temperatura

 Em 4 tubos de Folin-Wu foram adicionados 0,5 mL da solução de sacarose 0,5M
e no branco 1,0 mL de água destilada. Em seguida foram adicionados 0,5 mL da
solução de enzima e os tubos foram colocados, por 10 minutos, nos respectivos
banhos: banho de gelo a 0° C, temperatura ambiente, banho térmico a 50° C e água
fervente a 100° C. Foi adicionado 1 mL do reagente de DNS e os tubos foram colocados
em banho-maria em ebulição por 5 minutos e depois desse tempo foram resfriados. Os
volumes foram completados para 12,5 com água destilada e homogeneizados. As
absorbâncias foram lidas, a 540 nm, no espectrofotômetro.

4.2- Influência da concentração do substrato

Em 8 tubos de Folin-wu foram adicionados 0,5 mL de sacarose, sendo que para

cada tubo a concentração dessa solução foi diferente, respectivamente, 1,0M; 0,5M;
0,2M; 0,1M; 0,05M; 0,02M e 0,01M e no branco foi adicionado 0,5 mL de água
destilada. Em seguida foram adicionados 0,5 mL da solução de enzima e foi contado o
tempo de 10 minutos. Ao passar esse tempo foram adicionados aos tubos 1,0 mL de
DNS. Logo depois os tubos foram aquecidos em banho-maria em ebulição por 5
minutos e depois resfriados. Os volumes foram completados para 12,5 com água
destilada e homogeneizados. As absorbâncias foram lidas, a 540 nm, no
espectrofotômetro.

5- RESULTADOS E DISCUSSÕES

A curva-padrão utilizada é a mesma da prática 8 (Ação enzimática: Influência do

tempo):

A partir da prática 8, obteve-se a equação para a absorbância, na qual possui faixa de

validade de absorbância 0,078 < abs < 0,430

Abs = 0,0915C - 0,0095

5.1- Cálculo da concentração de produto formado e da velocidade da reação (Influência da
Temperatura).

Segue a tabela 3 com os dados de concentração, temperatura (°C), absorbância a 540

nm, produto formado (𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝐿−1 ) e velocidade da reação V (𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝐿−1 . 𝑚𝑖𝑛−1).

Produto formado Velocidade da reação

Temperatura (°C) Absorbância a 540 nm
(𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝐿−1 ) (𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝐿−1 . 𝑚𝑖𝑛 −1 )
0 0,398 4,445 0,445
Tamb 1,088 11,994 1,199
50 1,870 20,541 2,054
100 0,301 3,393 0,339
Tabela 3: Resultados experimentais

Para T = 0°C

Abs = 0,0915C – 0,0095

0,398 = 0,0915C - 0,0095

C = 4,454 mol/mL

v = 4,454 / 10 = 0,445 mol/mL.min

Para T = temperatura ambiente = 25,5ºC

Abs = 0,0915C – 0,0095

1,088 = 0,0915C - 0,0095

C = 11,994 mol/mL

v = 11,994 / 10 = 1,199 mol/mL.min

Para T = 50ºC

Abs = 0,0915C – 0,0095

1,870 = 0,0915C - 0,0095

C = 20,541 mol/mL

v = 20,541 / 10 = 2,054 mol/mL.min

Para T = 100ºC

Abs = 0,0915C – 0,0095

0,301 = 0,0915C - 0,0095

C = 3,393 mol/mL

v = 3,394 / 10 = 0,339 mol/mL.min

Gráfico de velocidade de reação x Temperatura

A partir dos resultados da tabela 3 tem-se o gráfico de velocidade de reação (μmol/mL.min) x

Temperatura (°C) na figura 1 abaixo:

Velocidade da reação X Temperatura

2.5
Velocidade da reação (micromol/mL.min)

1.5

0.5

0
0 20 40 60 80 100 120
Temperatura (ºC)

Figura 1: Gráfico velocidade da reação x Temperatura

Neste experimento, na temperatura de 0ºC a enzima sofre inativação pela baixa velocidade de
reação conforme foi visto no gráfico da figura 1. Em temperaturas acima de 50º C nota-se um
decréscimo na velocidade. E isso ocorre pelo fato de que as enzimas estão sofrendo
desnaturação térmica ocorrendo perda da atividade biológica das mesmas. Observa-se
também que a temperatura ótima está entre 45 e 50ºC, é a temperatura na qual a enzima
atinge sua atividade máxima, isto é, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma
atividade constante por um período de tempo.
5.2- Cálculo da concentração de produto formado e da velocidade da reação (Influência da
concentração do substrato).

Segue a tabela 4 com os dados de concentração de substrato [S], absorbância a 540

nm, produto formado (𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝐿−1 ), velocidade da reação V (𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝐿−1 . 𝑚𝑖𝑛−1),
1. [𝑆]−1 e 1. 𝑉 −1.

Produto Velocidade da
[S] Absorbância a
formado reação 1. [𝑆]−1 1. 𝑉 −1
(𝑚𝑜𝑙. 𝐿−1 ) 540 nm
(𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝐿−1 ) (𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝐿−1 . 𝑚𝑖𝑛 −1 )
0,01 0,187
0,02 0,379
0,05 0,671
0,1 0,816
0,2 0,981
0,5 1,042
1,0 0,940
Tabela 4: Resultados experimentais

6- CONCLUSÃO

Conclui-se que em relação á influência da temperatura pode-se dizer que a velocidade das
reações enzimáticas aumenta com a temperatura. No entanto, isto só é verdade dentro de
certos limites porque as enzimas, devido á sua natureza proteica, sofrem desnaturação a partir
de uma determinada temperatura (elevada), sofrendo inativação a temperaturas baixas. No
entanto a inativação em certos casos pode ser reversível, enquanto que a desnaturação como
se baseia na quebra das ligações químicas entre os aminoácidos, já não é possível ser
reversível.

Conclusão apenas da parte da influência da temperatura, falta a conclusão da concentração

de substrato.