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La inmunidad innata instruye a la inmunidad adaptativa, y la supresión de la inmunidad innata se

asocia con un mayor riesgo de infección. Mostramos previamente que los componentes celulares
de sangre total de una cohorte de niños sudafricanos secretaban niveles significativamente más
bajos de la mayoría de las citoquinas después de la estimulación de los receptores de
reconocimiento de patrones en comparación con la sangre completa de cohortes de niños
ecuatorianos, belgas o canadienses. Para comenzar a diseccionar los mecanismos moleculares
responsables, nos propusimos identificar la fuente celular relevante de estas diferencias. A través
de las cuatro cohortes representadas en nuestro estudio, identificamos una variación significativa
en la composición celular de la sangre completa; sin embargo, solo se detectó una reducción
significativa en la producción intracelular de citocinas en el nivel de células individuales en
monocitos infantiles sudafricanos, células dendríticas convencionales y células dendríticas
plasmacitoides. También descubrimos una marcada reducción en la polifuncionalidad para cada
uno de estos compartimentos celulares en niños sudafricanos en comparación con niños de otros
continentes. Juntos, nuestros datos identifican las diferencias en la composición celular, así como
las respuestas funcionales profundamente inferiores de las células innatas, en nuestra cohorte de
niños sudafricanos. Es necesario explorar un posible vínculo entre la inmunidad innata alterada y
un mayor riesgo de infección o una menor respuesta a las vacunas en los bebés sudafricanos.

La susceptibilidad a la infección y la respuesta a las vacunas difiere entre los niños de diferentes
regiones del mundo (1). Estas diferencias en la respuesta a la vacuna se han atribuido a la
variación en el fondo genético del huésped y / o exposiciones ambientales (2, 3). Sin embargo, los
mecanismos subyacentes siguen siendo en gran parte desconocidos. Esta falta de comprensión
impide la optimización de las intervenciones (3). Debido a que la inmunidad innata ordena la
inmunidad adaptativa, planteamos la hipótesis de que las diferencias en la respuesta inmune
innata de los niños de diferentes partes del mundo podrían contribuir a la variación en la
susceptibilidad a la infección o la respuesta a las vacunas. No se ha realizado ninguna comparación
mundial de la respuesta inmune innata específica de células. El sistema inmune innato se
transmite a los receptores de reconocimiento de patrones codificados por la línea germinal (PRR),
que reconocen motivos moleculares conservados en microbios conocidos como patrones
moleculares asociados a patógenos. La detección de patrones moleculares asociados a patógenos
mediante PRR desencadena una respuesta efectora dirigida a eliminar el potencial patógeno. Para
permitir una comparación global, utilizamos una variedad de ligandos PRR para activar las vías
específicas del receptor. Anteriormente descubrimos que los niños de una cohorte sudafricana
secretaban cantidades notablemente más bajas de casi todas las citocinas medidas después de la
estimulación PRR en comparación con los niños de cohortes en Bélgica, Canadá o Ecuador (4). Sin
embargo, la (s) causa (s) que conducen a las diferencias observadas en las respuestas a la
estimulación de la PRR no pudieron dilucidarse utilizando la medición aproximada de las citocinas
secretadas en el sobrenadante del cultivo. Razonamos que las diferencias en las citoquinas
detectadas en el sobrenadante de la sangre completa podrían deberse a diferencias en la
composición celular, la respuesta de subconjuntos de células particulares, o ambos. Como primer
paso para identificar los mecanismos celulares y moleculares responsables, utilizamos la
citometría de citocinas intracelulares de células individuales para identificar los compartimentos
celulares de los que surgieron las diferencias observadas.

Dado nuestro objetivo final de determinar el impacto de la variación inmune innata en las
respuestas de la vacuna, nos centramos en las APC principales: las células dendríticas
convencionales (cDC), las células dendríticas plasmacitoides (pDC) y los monocitos. También
incluimos granulocitos, células TCR ab T y células T gd, y células B para permitir una evaluación
más completa de la composición celular total de las muestras. Nuestros hallazgos revelan que la
composición celular alterada, así como una respuesta reducida en el nivel de una sola célula
después de la estimulación PRR, en niños sudafricanos contribuyeron a la respuesta de citocinas
notablemente más baja. Es necesario evaluar la posible causa cadena arriba y la consecuencia
aguas abajo de dicha respuesta inmune innata suprimida a la estimulación de PRR en niños
sudafricanos.

Materiales y métodos

Declaración de Ética

Este estudio se realizó de acuerdo con los principios expresados en las Guías de Buenas Prácticas
Clínicas y la Declaración de Helsinki, y fue aprobado por la Junta de Ética de la Universidad de
Columbia Británica (protocolo: H11-01423). Además, cada sitio involucrado obtuvo la aprobación
ética de sus respectivos centros de investigación. Se obtuvo el consentimiento informado por
escrito del pariente más cercano, los cuidadores o tutores en nombre de los menores involucrados
en este estudio para todos los participantes del estudio.

Reclutamiento e inscripción de participantes

Este estudio comparó niños de 2 años de edad de cuatro sitios: Vancouver, BC, Canadá; Bruselas,
Belgica; Quininde, Ecuador; y Ciudad del Cabo, Sudáfrica. Los sujetos canadienses fueron
reclutados de un grupo de niños sanos que participan en otros estudios de investigación en curso
en la Universidad de Columbia Británica (5). Los sujetos en Bélgica formaron parte de un estudio
piloto para un estudio de cohorte de nacimiento con base urbana más grande establecido en el
Hospital St. Pierre (Bruselas, Bélgica). Se reclutó a niños de Ecuador en un estudio de cohorte de
población de base rural (6), y se inscribieron niños sudafricanos en una cohorte de nacimiento de
base urbana establecida en la Universidad de Stellenbosch (7). Se incluyó un sujeto en el estudio si
se lo consideraba sano en función de una evaluación de salud basada en la historia. Los sujetos
fueron excluidos del estudio si tenían uno o más de los siguientes criterios: afección médica
crónica significativa, incluida la infección por VIH o VIH durante la gestación, deficiencia
inmunitaria, inmunosupresión por medicamentos, cáncer, recepción de productos sanguíneos en
3 meses, trastorno hemorrágico, malformación congénita importante o trastorno genético.

Recogida de sangre
Todos los sorteos de sangre se realizaron en el hospital por un flebotomista capacitado. Se extrajo
sangre periférica (3-5 ml) por venopunción estéril en recipientes que contenían 143 U de heparina
sódica (BD Biosciences, cat. N ° 8019839). Las muestras de sangre se mantuvieron a temperatura
ambiente y se procesaron dentro de las 4 h de extracción de sangre, como se describió
anteriormente (8, 9).

Estimulación PRR

Dada la sensibilidad inherente del sistema inmune innato, el análisis de las respuestas inmunes
innatas mediante la estimulación de PRR es vulnerable a los artefactos técnicos (8). Para minimizar
los artefactos técnicos, utilizamos un protocolo altamente estandarizado y rigurosamente
controlado para contrastar el estado inmune innato de los niños en cuatro continentes (África,
Europa, América del Norte y América del Sur). Las mezclas maestras de todos los reactivos se
prepararon en cantidades adecuadas para todo el estudio, se congelaron y se enviaron en
condiciones supervisadas a los cuatro sitios. Las placas prefabricadas de 96 pocillos contenían los
siguientes ligandos PRR específicos con concentraciones específicas y específicamente dirigidos a
PRR: PAM3CSK4 (PAM; TLR2 / 1; InvivoGen) a 1 mg / ml; poliinosinic-polycytidylic acid (Poly I: C;
TLR3; Amersham Biosciences) a 100 mg / ml; LPS (TLR4; InvivoGen) a 10 ng / ml; R848 (TLR7 / 8;
InvivoGen) a 10 mM; peptidoglicano (PGN; NOD1 / 2; InvivoGen) a 10 mg / ml; dipéptido de
muramilo (MDP; dominio de oligomerización de unión a nucleótidos [NOD] 2; InvivoGen) a 0,1 mg
/ ml; y medios solo Todos los pocillos contenían brefeldin A (Sigma-Aldrich) a 10 mg / ml. La misma
persona (K.K.S.) realizó todos los aspectos de los experimentos en todos los sitios utilizando
nuestro protocolo de fenotipo inmunológico innato validado y de calidad controlada (5, 8-11). La
sangre completa se diluyó 1: 1 con RPMI 1640 estéril precalentado, y se añadieron 200 ml de
sangre diluida a cada pocillo de las placas prefabricadas que contenían los ligandos de TLR
específicos. Las muestras se incubaron durante 6 ha 37 ºC en 5% de CO2 y luego se trataron con
una concentración final de EDTA 2 mM durante 10 min a 37 ºC. Las células se recogieron y se
resuspendieron en 1,4 ml de solución de lisado 13 BD FACS, se colocaron en tubos nuevos y se
almacenaron a -80ºC.

Tinción de citocinas intracelulares y adquisición de citometría de flujo

La preparación de las muestras para el análisis citométrico de flujo se realizó como se describió
previamente (5, 9, 12). Brevemente, los tubos congelados se descongelaron y se hilaron, y los
sedimentos se resuspendieron en 200 ml de solución de permeabilización BD FACS y se incubaron
a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de dos lavados en PBS que contienen 0,5%
de BSA y 0,1% de azida sódica (PBSAN), las células se tiñeron en un volumen final de 100 ml de
PBSAN durante 45 min a temperatura ambiente. Después de dos lavados adicionales con PBSAN,
las células se resuspendieron en PBSAN y se analizaron en un citómetro de flujo LSR II (BD
Biosciences). La configuración del citómetro y las cuentas de seguimiento (BD Biosciences) se
usaron para calibrar la máquina antes de cada uso para garantizar que el rendimiento de la
máquina permaneciera igual. Se usaron perlas de compensación (CompBeads; BD Biosciences)
para estandarizar los ajustes de voltaje y se usaron como controles de tinción única positiva y
negativa, como se describió previamente (8, 9, 13). Se utilizó material congelado de una muestra
de sangre completa adulta estimulada con R848 en cada ejecución para determinar si la intensidad
de fluorescencia media de las poblaciones de citocina seguía siendo la misma entre los
experimentos (es decir, asegurar que la configuración del citómetro y la configuración de perlas de
seguimiento realizado de acuerdo con las especificaciones del fabricante). Se adquirieron un total
de 500,000 eventos no compensados por muestra. La compensación se estableció en FlowJo
(TreeStar) y las muestras se analizaron de forma compensada. Las puertas se establecieron en
base al principio de fluorescencia menos uno (13, 14). Colocamos las muestras de citometría de
flujo no estimulada como un control biológico negativo; los valores obtenidos con controles
negativos biológicos se restaron de la respuesta de la muestra estimulada por individuo, como se
describe (13). La viabilidad no se evaluó directamente, solo indirectamente a través de la
apariencia de dispersión lateral y frontal, como se describió anteriormente (8, 9); no se observó
ninguna diferencia en la viabilidad entre las muestras de los cuatro sitios.

Normalización

Dado su papel en la detección rápida del cambio ambiental (15, 16), el sistema inmune innato es
propenso a artefactos técnicos que pueden afectar rápidamente la evaluación inmune innata (8).
Por lo tanto, implementamos un enfoque experimental con un rigor riguroso y nos centramos en
la garantía de calidad para contrastar de manera confiable las muestras obtenidas en los cuatro
continentes. Las mezclas maestras de todos los reactivos se prepararon en cantidades adecuadas
para todo el estudio, se congelaron y se enviaron en condiciones monitoreadas y registradas a
cada sitio. Los materiales y reactivos utilizados para extraer sangre o que entraron en contacto con
la sangre se obtuvieron y probaron para garantizar la ausencia de sustancias innatas activadoras
de inmunidad (8, 9). El postprocesamiento de muestras se envió en hielo seco con monitores de
temperatura; esto reveló que las temperaturas se mantuvieron estables a 280 ° C durante todos
los envíos. Al llegar al sitio de análisis central (Vancouver, BC, Canadá), las muestras se
almacenaron congeladas en nitrógeno líquido. Todas las muestras se corrieron dentro de los 12
meses de colección. Cada ejecución de citometría de flujo contenía muestras elegidas al azar de
cada sitio para evitar artefactos, almacenamiento o efectos de ejecución.

Índice de polifuncionalidad y análisis polifuncional

El análisis polifuncional se define como la evaluación de múltiples parámetros a nivel de célula


única (17). El índice de polifuncionalidad (PI) evalúa numéricamente el grado y la variación de la
polifuncionalidad dentro de un conjunto de datos en particular, permitiendo el análisis estadístico
comparativo y correlativo, como se describe (17) El análisis de polifuncionalidad se realizó
utilizando el software "FunkyCells - Boolean Data Miner" (www.funkycells.com) desarrollado por
el Dr. M. Larsen (París, Francia).

análisis estadístico
Se realizó el análisis de Kruskal-Wallis para comparar los cuatro sitios con una varianza significativa
entre la respuesta media a las citoquinas. La prueba posterior de Dunn se utilizó para determinar
cuál de los sitios contribuyó a las diferencias significativas. El análisis estadístico se realizó
utilizando Prism versión 6 (GraphPad, La Jolla, CA).

Análisis Z-score

La calculadora antropométrica de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se utilizó para


determinar el puntaje z individual de cada participante (WHO Anthro versión 3.2.2) (18).

Resultados

Características de la cohorte

Cuatro poblaciones fueron incluidas en este estudio. Las características de la población de estudio
se describen en la Tabla I. Para permitir la administración completa de la infancia temprana
recomendada localmente.

vacunas, la edad promedio en el consumo de sangre fue de ~ 24 meses. Según la historia clínica,
todos los niños estaban sanos al momento de la recolección de la muestra. Los datos
antropométricos, como el peso, la altura y la circunferencia del brazo medio superior, en estudios
de vacunas pueden proporcionar información útil sobre la uniformidad y la salud general de la
población de estudio (19). En este estudio, recolectamos el peso y la altura para evaluar la salud
general de las poblaciones de nuestra cohorte y compararlas con los estándares de la OMS (20).
Con base en la documentación de la OMS de los Estándares de Crecimiento Infantil, el puntaje Z
de peso para la edad (WAZ), el puntaje Z de longitud para la edad (LAZ) y el puntaje Z de peso para
la longitud (WLZ) de las cuatro cohortes cayó dentro del rango normal, con no más de 6 2 SD.

Composición celular de las muestras de sangre total

Para determinar los componentes implicados en la respuesta celular de niños de diferentes partes
del mundo, utilizamos una citometría de flujo monocromática policromática. Se usaron
marcadores de anclaje de superficie celular para identificar las principales poblaciones objetivo de
APC en sangre completa. Estos incluían monocitos (HLA-DR +, CD14 +), cDC (HLA-DR +, CD142,
CD11c +, CD1232) y pDC (HLA-DR +, CD142,

CD11c2, CD123 +). También identificamos células T ab (CD3 +, gdTCR2), células T gd (CD3 +, gdTCR
+), células B (HLA-DR +, CD142, CD11c2, CD1232) y granulocitos (HLA-DR2, CD14 +) en la misma
muestra. En la figura 1 se muestra un ejemplo de la estrategia de activación utilizada para
identificar poblaciones de células y su respuesta de citoquinas después de la estimulación PRR. El
uso de estos marcadores de anclaje integrales permitió la comparación directa de la composición
celular entre sitios (figura 2). Esta comparación identificó varias diferencias entre subpoblaciones
celulares. Por ejemplo, aunque muestras de niños sudafricanos tenían porcentajes de granulocitos
que eran similares a los otros tres sitios, contenían menos monocitos, cDC, pDC, células T ab,
células T gd y células B, mientras que los niños de la cohorte canadiense mostraban el porcentaje
más bajo de células T gd.

Análisis de una sola citocina

La expresión de las principales citoquinas innatas, específicamente IL-6, IL-12, IFN-a, IFN-g y TNF-a,
se identificó a continuación en el nivel de una sola célula para cada una de nuestras
subpoblaciones de células. Nos centramos en estas citocinas porque permiten la evaluación de
una amplia gama de funciones inmunes (5, 10). Un ejemplo de activación de citocinas se muestra
en la Fig. 1 y en la Fig. 1 complementaria.

células T gd, células T ab, células B y granulocitos. No se observó la segregación de citoquinas


después de la estimulación de PRR por encima del nivel de muestras no estimuladas para
granulocitos, células T gd, células T ab y células B. Por lo tanto, no incluimos estas poblaciones de
células en el posterior análisis de alto nivel basado en citocinas.

Monocitos Los monocitos respondieron a la estimulación con R848 (TLR7 / 8), LPS (TLR4), PAM
(TLR1 / 2), PGN (TLR2 y

NOD1 / 2) y MDP (NOD2) produciendo IL-6, IL-12, IFN-g y TNF-a, pero no IFN-a. No se detectó
respuesta a la estimulación con Poly I: C (TLR 3) (datos no mostrados); por lo tanto, Poly I: C no se
incluyó en análisis adicionales. La producción de monocitos de citoquinas en respuesta a R848,
LPS, PAM, PGN y MDP difirió significativamente entre los grupos, con sujetos de Sudáfrica que
albergaban un menor número de monocitos que expresan citoquinas en comparación con los
otros tres sitios (Fig. 3, Fig. 2A). Las respuestas de IL-6, IL-12, IFN-g y TNF-a de monocitos a R848 y
estimulación de LPS fueron significativamente diferentes entre los sitios, con las mayores
diferencias debido a la variación entre Sudáfrica y Canadá, Ecuador y Bélgica. Como señalaron
otros investigadores (21), vimos la producción de IFN-g por monocitos en respuesta a estímulos
fuertes como LPS y R848. La producción de cada citoquina (IL-6, IL-12, IFN-g y TNF-a) en respuesta
a PAM fue significativamente diferente en los monocitos de los niños de los cuatro sitios; el
principal contribuyente a esta variación fue la diferencia entre los sujetos sudafricanos y los de
Ecuador. Las respuestas a PAM de sujetos sudafricanos versus belgas y canadienses también
fueron significativamente diferentes, pero solo para IL-6. Los monocitos estimulados por PGN
produjeron IL-6, IFN-g y TNF-a, con una diferencia significativa entre los niños sudafricanos y
canadienses. La estimulación con MDP de los monocitos indujo la producción de IL-6 y TNF-a, que
solo fue estadísticamente diferente entre los niños belgas y sudafricanos (tabla complementaria I).

Células dendríticas convencionales.


Se indujo una fuerte respuesta de IL-6, IL-12, IFN-g y TNF-a en cDC en respuesta a los ligandos de
RLD y NOD R848, LPS, PAM, PGN y MDP. En cuanto a los monocitos, los cDC no produjeron
ninguna de las citocinas que medimos mediante citometría de flujo en respuesta a la estimulación
con Poly I: C (TLR3) (datos no mostrados). Cada citoquina producida por cDC difirió
significativamente entre los cuatro sitios, con cDC de niños sudafricanos que contienen el número
más bajo de células que expresan citoquinas (Fig. 3). La respuesta a las citoquinas de las CDc
después de la estimulación con PGN también fue significativamente diferente entre los sitios,
como resultado de la gran variación entre los niños sudafricanos y los niños canadienses,
ecuatorianos o belgas para IL-6 y TNF-a; para IL-12 e IFN-g, la variación fue más pronunciada entre
los niños sudafricanos y canadienses o ecuatorianos (Tabla complementaria I).

Células dendríticas plasmocitoides. Los pDC solo respondieron al ligando R848 de TLR7 / 8,
produciendo IFN-a, IFN-g, IL-6 y TNF-a, pero no IL-12 (Fig. 3). Las principales diferencias se
originaron en sujetos de Canadá versus Ecuador para IL-6, Canadá versus Sudáfrica para IFN-a, y
Bélgica versus Sudáfrica para TNF-a (Tabla I Suplementaria).

Análisis de múltiples citocinas

Nos propusimos evaluar la capacidad de las células en sujetos de cada uno de los cuatro sitios para
producir múltiples citoquinas al mismo tiempo. Monocitos R848, LPS y PAM. La respuesta de IL-6,
IL-12, IFN-g y TNF-a a las tres estimulaciones fue diferente entre los sitios, con las mayores
diferencias debido a la variación entre Sudáfrica y Canadá, Ecuador o Bélgica (Fig. 4) . Niños
canadienses y ecuatorianos produjeron la respuesta polifuncional más alta, incluyendo doble
producción de citocinas (TNFa + IL6 +), triple producción de citoquinas (TNFa + IFNg + IL6 +, TNFa +
IL12 + IL6 +) y cuádruple producción de citoquinas (TNFa + IFNg + IL12 + IL6 +) poblaciones. Los
niños sudafricanos tuvieron una respuesta global más baja (la altura más baja de la barra apilada)
y respondieron principalmente con células productoras de citoquinas únicas (TNFa + o IL12 +), con
muy pocos monocitos polifuncionales que producen citocinas detectados. PGN y MDP. Las células
productoras de citocinas únicas dominaron la respuesta a la estimulación de NOD2 en los cuatro
sitios. Los monocitos estimulados por PGN respondieron principalmente con TNFa +, seguido de
producción de TNFa + IL6 +. Los niños belgas y sudafricanos mostraron una respuesta global más
baja en comparación con los niños canadienses y ecuatorianos (Fig. 4). MDP evocó solo una
respuesta mínima, pero la producción de IL-6 y TNF-a fue aún diferente entre los sitios y fue más
pronunciada entre los niños belgas y sudafricanos (Fig. 2B Suplementaria). La diferencia en la
producción de citocinas monocíticas entre niños de diferentes los continentes se vuelven más
evidentes al trazar las tendencias polifuncionales en un gráfico de líneas (Fig. 4, Fig. 2B
Suplementaria). La respuesta de las citocinas de los monocitos a la estimulación de R848 o LPS
estaba dominada por productores únicos de citoquinas para niños sudafricanos, mientras que los
monocitos de los niños en otros sitios contenían productores de citocina simples, dobles y triples
después de cada estimulación. La estimulación con PAM produjo solo una pequeña diferencia
entre Sudáfrica y los otros tres sitios, mientras que la polifuncionalidad de los monocitos
estimulados con PGN y MDP no varió significativamente entre los sitios.
Células dendríticas convencionales. R848, LPS y PAM. La fracción relativa de CDDC que producen
multicoquina en respuesta a la estimulación R848, LPS y PAM fue similar en todos los sitios, con la
excepción de Sudáfrica. Aunque los CDC de niños canadienses, belgas y ecuatorianos respondieron
con un gran número de células productoras de citocina únicas, dobles o triples, las CDC
sudafricanas respondieron solo con células productoras de citocinas (IL12 + y TNFa +) (Fig. 5, Fig.
2B).

PGN y MDP. Los cDC que responden a la estimulación de PGN estaban dominados por la respuesta
de TNFa +, seguidos por las células de doble producción de TNFa + IL6. La mayor diversidad en la
respuesta de citocina se observó en niños canadienses (Fig. 5). La estimulación con MDP resultó
principalmente en una población de cDC produciendo TNFa + citocina única en cada sitio (Fig. 2B
complementaria).

Las líneas de tendencia de gráficos lineales polifuncionales confirmaron que las respuestas de cDCs
a R848, LPS y estimulación PAM estaban dominadas por una única respuesta de citocina en los cDC
de niños sudafricanos, mientras que las de los otros sitios contenían citoquinas únicas y
multicoquina produciendo células. Sin embargo, los cDC estimulados con PGN y MDP no
mostraron una diferencia entre los sitios (Fig. 5, Supplemental Fig. 2B).

Células dendríticas plasmocitoides. Después de la estimulación con R848, la fracción más grande
de respuestas de pDC consistió en células productoras de doble citoquina (TNFa + IFNa +); las
células positivas únicas comprendían la segunda fracción más grande. El gráfico de línea
polifuncional reveló que los pDC de niños sudafricanos producían predominantemente citoquinas
únicas en respuesta a la respuesta de estimulación R848, mientras que los pDC de niños en los
otros tres sitios respondían principalmente con la producción de citocinas dobles (figura 6).

Índice polifuncional

El enfoque de células individuales resumido anteriormente para determinar la producción de


citoquinas múltiples en respuesta a la estimulación PRR nos permitió evaluar estadísticamente la
capacidad de cada célula para producir más de una citocina al mismo tiempo (es decir, su PI) (Fig.
7). ) (17).

Monocitos El PI para monocitos de niños sudafricanos fue el más bajo en comparación con todos
los otros sitios, mientras que fue similar entre niños belgas, canadienses y ecuatorianos. Esta
diferencia para los niños sudafricanos fue más pronunciada en respuesta a R848, LPS, PAM y PGN
y fue menos pronunciada en respuesta a MDP (Fig. 7, Supplemental Fig. 3).

Células dendríticas convencionales. En respuesta a la estimulación de R848, LPS, PAM, PGN y MDP,
los niños sudafricanos montaron respuestas polifuncionales de cDC significativamente menores
que las de los niños de los otros sitios. El análisis estadístico reveló que esta diferencia se debió a
la variación en las respuestas entre niños sudafricanos y belgas, canadienses y ecuatorianos (Fig. 7,
Fig. 3 complementaria).
Células dendríticas plasmocitoides. El análisis estadístico del PI para pDCs después de la
estimulación con R848 identificó una diferencia significativa entre niños sudafricanos y
canadienses, ecuatorianos y belgas (Fig. 7). Los sujetos sudafricanos mostraron la respuesta más
baja.

Discusión

Recientemente identificamos que las respuestas inmunes innatas en etapas tempranas de la vida
difieren entre los niños de diferentes continentes, con una cohorte de niños sudafricanos que
secretan significativamente menos citoquinas luego de la estimulación PRR en comparación con
los niños en cohortes de Ecuador, Bélgica o Canadá (5). Usando un análisis basado en citometría
de flujo intracelular de cetina de alto rendimiento controlado rigurosamente, determinamos que
esta diferencia era el resultado de una fracción global más baja de células innatas en la circulación
periférica, así como la fracción inferior de células innatas que producen citoquinas . En nuestro
estudio anterior, analizamos la secreción de citocinas en medio de cultivo después de la
estimulación in vitro; sin embargo, este enfoque no proporciona los detalles necesarios para guiar
una mayor delineación de los mecanismos subyacentes. Ahora nos propusimos identificar la
respuesta a nivel de células individuales para determinar si las diferencias en la secreción global de
citoquinas se debían a diferencias en la composición de las células sanguíneas, diferencias
específicas de subconjuntos de células innatas en respuesta a la estimulación PRR, o ambas.
Encontramos que la composición del compartimiento de WBC periférico variaba entre los niños de
los cuatro continentes, y que la sangre periférica de los niños sudafricanos albergaba la fracción
más baja de los principales tipos de células de respuesta PRR: monocitos, cDC y pDC. Debido a que
los granulocitos, las células T gd, las células T ab, las células B y las pocas células restantes no
identificadas no produjeron niveles de citocinas por encima del fondo, las notables diferencias
cuantitativas en estas poblaciones celulares entre los niños de diferentes sitios probablemente no
contribuirían directamente a la diferencia observada en las citocinas secretas. Aunque nuestros
datos respaldan la noción de que las diferencias en la composición celular podrían haber
contribuido a diferencias en la secreción de citoquinas después de la estimulación PRR, la sangre
completa de niños sudafricanos contenía tantos monocitos, CDCs y pDC como la sangre completa
de niños de otros sitios . Esto sugiere que las diferencias en la composición celular por sí solas no
eran totalmente responsables de la menor respuesta de citocina detectada en la sangre de los
niños sudafricanos. Las diferencias poblacionales en la composición celular se describieron
previamente (22, 23). Una comparación de niños europeos y ugandeses notó recuentos de
linfocitos más bajos en niños ugandeses en comparación con niños europeos negros, mientras que
los recuentos de neutrófilos fueron similares (23). En general, estos hallazgos parecen ser
consistentes con nuestros datos.

El enfoque basado en una sola célula de nuestro estudio actual nos permitió identificar las
diferencias específicas de la población celular a nivel de células individuales de las respuestas de
estimulación PRR funcionales y compararlas entre los sitios geográficos.
Previamente, identificamos un cambio dependiente de la edad en la capacidad de respuesta
innata a la estimulación de PRR de monocitos, CDCs y pDC (24). Lo que es más importante,
nuestros estudios de cohorte longitudinales previos posteriores a niños cana- dienses (5, 10) y
sudafricanos (11) desde el nacimiento durante los primeros años de vida sugirieron que las
trayectorias de desarrollo en respuesta a la estimulación PRR podrían diferir entre niños de estos
dos países. Sin embargo, estos estudios previos no se realizaron utilizando los mismos reactivos o
protocolos, lo que impide una comparación directa. El estudio transversal presentado en este
artículo fue creado para permitir precisamente este tipo de comparación directa. Nuestros datos
indican claramente que la respuesta inmune innata con respecto a la estimulación PRR de
monocitos, cDC y pDC difirió significativamente entre nuestras cohortes de niños sudafricanos y
canadienses. Al llevar a cabo esta estrictamente controlada comparación lado por lado para todas
nuestras cohortes en cuatro continentes, ahora podemos extender esta conclusión para
establecer que, a nivel de célula única, la respuesta inmune innata de la cohorte sudafricana
difiere de la canadiense cohorte, así como las cohortes belga y ecuatoriana. Aunque hubo
diferencias en las respuestas de monocitos, cDC y pDC a la estimulación PRR entre los niños de
Canadá, Bélgica y Ecuador, estas diferencias fueron relativamente menores en comparación con la
sorprendente y consistentemente menor respuesta de los niños sudafricanos. Esta menor
respuesta funcional a la estimulación PRR en nuestra cohorte de niños sudafricanos se extendió a
todos los tipos de células sensibles a la estimulación PRR, se aplicó a todos los estímulos PRR
probados e incluyó todas las citocinas medidas, incluido el grado de polifuncionalidad. Juntos,
estos datos comienzan a delinear un estado de inmunosupresión innata relativa en nuestra
cohorte de niños sudafricanos en comparación con niños de otras partes del mundo.

Se ha descrito una reducción de la polifuncionalidad para las células T después de infecciones


crónicas, como el VIH, el virus de la hepatitis C y el VEB (25, 26), o la administración de
medicamentos inmunosupresores (27). Funcionalmente, este menor grado de polifuncionalidad
de las células T se ha relacionado con un mayor riesgo de infección en pacientes trasplantados (27)
y con un control disminuido de la replicación del VIH en sujetos infectados con VIH (28). Hasta
donde sabemos, nuestros datos son los primeros en identificar las diferencias en el grado de
polifuncionalidad de las células inmunes innatas. Han et al. (29) mostraron que la estimulación de
las células T inicia las respuestas de las citocinas de manera asincrónica, con una trayectoria
dinámica de respuestas que ocurre de manera secuencial. Todavía tenemos que realizar una
evaluación del curso temporal de la respuesta de las citoquinas intracelulares en nuestros sujetos
para determinar si las diferencias en la cinética contribuyen a las diferencias en la
polifuncionalidad.

La menor respuesta de nuestra cohorte sudafricana versus los otros niños de la cohorte a la
estimulación de PRR podría deberse a variaciones en la genética del huésped y / o las diferencias
ambientales. Se sabe que las diferencias en la composición genética del huésped influyen en la
inmunidad innata (30). Recientemente demostramos que la variación en la respuesta inmune
innata puede estar influenciada por polimorfismos de un solo nucleótido dentro de las vías de PRR
y que la prevalencia de estos polimorfismos de un solo nucleótido varía entre los diferentes
antecedentes raciales (31). Por lo tanto, es muy posible que las diferencias genéticas entre
nuestras poblaciones contribuyan a las diferencias en las respuestas funcionales que medimos
entre los sitios. Sin embargo, dada la amplia variación en los antecedentes raciales de los padres
en nuestras cohortes sudafricanas y belgas (incluidas africanas, blancas, asiáticas y mixtas), no
creemos que las diferencias en la genética por sí solas expliquen la respuesta innata de citoquinas
inherentemente menor de los niños sudafricanos en comparación con los niños de otros sitios.
Nuestros datos respaldan las conclusiones de Lisciandro et al. (32, 33), quienes sugirieron que las
respuestas inmunes de APC son más bajas en ambientes tradicionales que en ambientes
modernos. Sin embargo, nuestros datos no respaldan la división simple en individuos ricos en
recursos versus pobres en recursos o una distinción basada en la latitud, porque los niños de
Ecuador (considerados pobres en recursos) mostraron respuestas de citocinas intracelulares
equivalentes al igual que los niños de Bélgica o Canadá (considerados recursos ricos) pero una
respuesta mucho más alta en comparación con los niños de Sudáfrica (considerados pobres en
recursos). Por lo tanto, los factores ambientales que conducen a la menor respuesta de los niños
sudafricanos tendrían que ser más específicos para Sudáfrica, posiblemente incluso para el área
del Cabo Occidental dentro de Sudáfrica, de la cual se seleccionó a nuestra cohorte (34). Aunque
no se conoce la naturaleza exacta del factor (es) ambiental (es), podemos excluir un rango de
posibles candidatos. Los factores ambientales, como la vacunación, el modo de alimentación, el
modo de nacimiento, el peso al nacer y la edad, pueden afectar la ontogenia inmune innata (3, 8,
35-38). Sin embargo, entre nuestras cuatro cohortes globales, las formulaciones y los calendarios
de vacunas fueron muy similares y se adhirieron al Programa Ampliado de Inmunización (39). La
diferencia más notable entre nuestras cohortes fue el uso de la vacuna BCG neonatal. Aunque no
se administró BCG a recién nacidos en Bélgica y Canadá, se administró a los niños de Sudáfrica y
Ecuador. Dado que los niños ecuatorianos mostraron una respuesta inmunitaria innata más similar
a la de los niños belgas y canadienses que a los niños sudafricanos, la BCG neonatal parece ser un
culpable poco probable de explicar la diferencia en el estado inmune innato del niño alrededor de
los 2 años de edad. Djuardi et al. tampoco encontraron un efecto claro de la vacuna BCG sobre la
ontogenia inmune innata. Sin embargo, aunque el cronograma de vacunación global fue similar
para todos los niños en cada sitio, las diferencias en la composición de la vacuna (por ejemplo, tos
ferina acelular frente a células enteras) o la edad exacta de vacunación difirieron entre los sitios.
Como resultado de esto, no podemos excluir que la variación en la vacunación infantil estándar
pueda contribuir a las diferencias observadas en el desarrollo inmune innato.

Dado que todos nuestros niños se inscribieron de acuerdo con los mismos criterios de inclusión y
exclusión bien definidos, es poco probable que las diferencias en las enfermedades médicas
durante los primeros 2 años de vida hayan contribuido a las diferencias entre los sitios que
detectamos. También interpretamos nuestros datos para indicar que las diferencias en el modo de
alimentación (por ejemplo, la duración de la lactancia materna, la lactancia materna frente a la
alimentación con biberón) probablemente no contribuyan en gran medida a las diferencias entre
los sitios que observamos. Aunque no podemos excluir que el modo de alimentación podría
conducir a diferencias sutiles, nuestros datos sugieren que tiene un impacto mínimo porque
difería enormemente tanto dentro como dentro de los sitios, mientras que la variación de la
respuesta inmune innata dentro de los sitios era insignificante. Además, la variación en la
respuesta inmune innata a la estimulación PRR no se correlacionó con el modo de alimentación
cuando se compararon individuos dentro de un sitio (datos no mostrados). Aunque los estudios
demostraron que el modo de nacimiento puede afectar el sistema inmune de los niños hasta la
edad de 5 años (3, 36), no fue posible detectar una asociación entre el modo de nacimiento y la
respuesta inmune innata (datos no mostrados). Específicamente, aproximadamente la mitad de
los niños canadienses nacieron por cesárea, mientras que casi todos los niños sudafricanos,
ecuatorianos y belgas nacieron por vía vaginal. Aunque el peso al nacer y la edad gestacional se
correlacionaron con un mayor riesgo de mortalidad infantil (38), su impacto en la trayectoria
innata innata postnatal no se ha delineado. Sin embargo, el peso promedio al nacer fue similar
para todas nuestras cohortes y dentro del rango "normal" para cada sitio. De forma importante,
todos los sujetos de nuestra cohorte se ubicaron dentro de los índices de crecimiento infantil de la
OMS (para todos los WAZ, LAZ y WLZ). Además, el número total de niños inscritos en nuestras
cohortes que nacieron prematuramente (37 semanas gestacionales de edad) fue muy bajo (n = 3
en Sudáfrica y n = 2 en Bélgica, ~ 15% por cohorte). Esto sugiere que ni el peso al nacer ni la edad
gestacional podrían explicar las diferencias que detectamos entre nuestras cohortes. Por último,
aunque varios estudios identificaron diferencias en el estado inmune basadas en el sexo, el análisis
de nuestros datos estratificados por sexo de los sujetos no reveló ninguna diferencia significativa
(datos no mostrados). Esto puede deberse al pequeño tamaño de la muestra, pero excluye el sexo
como el principal factor determinante de las diferencias que detectamos entre nuestras cohortes
globales con respecto a la respuesta inmune innata a la estimulación de PRR.

La principal limitación de este estudio es el número relativamente pequeño de sujetos por sitio.
Sin embargo, nuestros datos que identifican las respuestas de citoquinas innatas más bajas en
nuestra cohorte de niños sudafricanos fueron consistentes a través de múltiples estímulos y para
múltiples tipos de células, lo que sugiere que nuestros hallazgos probablemente sean
biológicamente relevantes y posiblemente clínicamente significativos. Claramente, nuestros
hallazgos deberán ser replicados en una escala mayor. También debe tenerse en cuenta que
nuestro reclutamiento de cohortes no fue representativo de la población total en cada sitio. Por
ejemplo, los niños ecuatorianos fueron seleccionados de una cohorte rural basada en la población
y no representan a todos los niños ecuatorianos de una amplia variedad de entornos y entornos. A
pesar de estas limitaciones, nuestros datos apoyan fuertemente la existencia de una respuesta
inmune innata profundamente reducida a la estimulación de PRR en niños sudafricanos. No está
del todo claro si esa inmunodeficiencia innata cuantitativa y cualitativa, comparada con otras
regiones del mundo, tiene implicaciones clínicas, pero merece una exploración más profunda.