Composición de microbiota fecal temprana en niños que más tarde desarrollan enfermedad celíaca y autoinmunidad

asociada.

Introducción

La enfermedad celíaca (EC) es un trastorno del intestino delgado, en el que el gluten induce una reacción inflamatoria de
la mucosa. En la población finlandesa, la prevalencia de EC se ha duplicado durante los últimos 30 años [1]. El 90% de los
pacientes portan la molécula HLA-DQ2.5 codificada por los genes HLA-DQA1? 05 y -DQB1? 02, y la mayoría de los pacientes
restantes portan la molécula HLA-DQ8 codificada por HLA-DQA1? 03 y -DQB1? 03: 02 genes. Alrededor del 30-40% de las
personas de ascendencia del norte de Europa son positivas para HLA-DQ2.5 y / o DQ8, lo que demuestra el papel de otros
factores etiológicos en el desarrollo de la enfermedad, además de estos componentes genéticos principales [2].

Varios estudios han demostrado una relación entre la composición de la microbiota intestinal alterada y la EC [3-5]. Sin
embargo, las diferencias observadas pueden surgir del propio proceso de la enfermedad o depender de las diferencias
genéticas. Por ejemplo, se ha informado que el haplotipo HLADQ2.5 influye en la composición de la microbiota intestinal
de los lactantes [6]. Los posibles cambios y diferencias en la microbiota intestinal antes del inicio de la EC no están claros.

El objetivo de nuestro estudio fue evaluar genéticamente la composición de la microbiota fecal de los niños finlandeses
con el riesgo de EC antes del inicio de la enfermedad. Nuestro objetivo fue detectar las posibles diferencias en la
microbiota entre los niños que más tarde desarrollaron CD y los que no. A través de este estudio, esperamos ampliar la
comprensión sobre el impacto de la colonización microbiana temprana en la patogénesis de la EC y revelar si la
composición de la microbiota fecal temprana podría reflejar el riesgo de la enfermedad. A nuestro entender, este es el
primer estudio hasta ahora donde las muestras se han recolectado antes de la aparición del CD.

materiales y métodos

Temas de estudio

Se obtuvieron muestras de materia fecal de 27 niños finlandeses (reclutados en el Hospital de la Universidad de Kuopio y
en el Hospital de Maternidad Katiloopisto en Helsinki) con un alto riesgo genético de CD que participan en un estudio de
seguimiento [7]. Los recién nacidos fueron examinados para detectar la presencia de alelos HLADQB1* 02 y HLA-DQA1*
05 [8] y seguidos hasta los 3 o 4 años de edad mediante el cribado de autoanticuerpos de transglutaminasa tisular (tTGA)
[9].

El diagnóstico de EC se basó en hallazgos histológicos típicos, atrofia vellositaria e hiperplasia de criptas, en la biopsia
duodenal del intestino delgado [10].

Nueve niños (todas las niñas) fueron diagnosticados con biopsia duodenal a la edad mediana de 3.5 años (rango 2.6-4.2
años) después del desarrollo de autoanticuerpos tTGA en la edad media de 3 años (18 meses a 3 años). Fueron
seleccionados para el estudio junto con 18 infantes control, emparejados por sexo y fecha de nacimiento, permaneciendo
negativos para tTGA durante el seguimiento.

Las muestras de materia fecal se recolectaron a la edad de 9 y 12 meses (muestras de 9 y 12 meses, respectivamente). Las
muestras se almacenaron en congeladores caseros (-20°C) durante un período máximo de dos meses, después de lo cual
se entregaron en los centros de estudio en cajas frías llenas de bolsas de hielo y se almacenaron a -80°C hasta el
procesamiento. La muestra de 9 meses de un caso de lactantes y 12 muestras de heces de un infante control no se habían
entregado. Los datos sobre el modo de parto se obtuvieron de las familias participantes o registros obstétricos, y se
recogieron datos sobre nutrición y antibióticos utilizando cuestionarios dietéticos y llamadas telefónicas a la edad de 1-2
semanas, 1.5 meses, 3.5, 6 y 9 meses. Después de la edad de 9 meses, la información relacionada con la salud se recopiló
mediante cuestionarios de seguimiento generales. El consentimiento informado por escrito se obtuvo de todas las
familias. El plan de estudio fue aceptado por el comité de ética del Hospital de la Universidad de Kuopio.

Extracción de ADN Se extrajo ADN bacteriano de ˜ 100 mg de las muestras de heces congeladas con un kit de extracción
de heces GXT semiautomático VER 2.0 (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Alemania) combinado con una homogeneización
adicional mediante perlas en tubos de vidrio de 0,1 mm (MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, EE. UU.) A 1000 rpm
durante 3 minutos con MO BIO PowerLyzerTM 24 Bench Top Bead-Based Homogenizer (MO BIO Laboratories, Inc.,
Carlsbad, CA, EE. UU.) Para mejorar la lisis celular. Las concentraciones de ADN de los extractos de ADN se midieron con
el kit de ensayo Qubit dsDNA HS y el fluorómetro Qubit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Los extractos de
ADN se almacenaron a -80°C.

Análisis de composición de microbiota fecal

Los perfiles bacterianos de las muestras de heces se analizaron con secuenciación del gen 16S rRNA. Las bibliotecas del
gen 16S rRNA se generaron en una única PCR con cebadores de doble índice diseñados a medida. El enfoque se describe
en Materiales y métodos complementarios.

Análisis de los datos

La calidad de la secuencia sin procesar se verificó con FastQC (http: //

www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), y el análisis de datos se realizó con Qline (v. 1.9) como se describió
anteriormente [11-13] . Las lecturas de secuencia se filtraron con una tasa de aceptación de puntuación de calidad de 20
o superior. Las secuencias quiméricas se filtraron usando usearch (v. 6.1), y las unidades taxonómicas operativas (OTU) se
seleccionaron usando el algoritmo de uclust con un 97% de similitud de secuencia. Se excluyeron las OTU que representan
menos del 0,05% del recuento de secuencia total. Para minimizar el efecto de la variación entre muestras en la eficiencia
de la secuencia, las muestras se submuestrean (enrarecen) mediante muestreo aleatorio sin reemplazo a la profundidad
de secuenciación más baja (134 414 lecturas). Las anotaciones para las OTU resultantes se derivaron de la base de datos
GreenGenes [14]. Todos los análisis de los datos de 16S rRNA se realizaron a partir de las tablas OTU submuestreadas al
azar. Para estudiar la diversidad bacteriana de las muestras, se calcularon métricas de diversidad y se generaron parcelas
de rarefacción con Qiime. Las diferencias en los índices de diversidad de Shannon se evaluaron luego con JMP Pro 12 (SAS
Institute, Inc., Cary, NC, EE. UU.), Aplicando métodos no paramétricos y considerando p <.05 como estadísticamente
significativo. Los valores atípicos se excluyeron antes de los análisis. El resumen taxonómico producido por Qiime se
visualizó como gráficos de barras y diferencias estadísticas en la riqueza taxonómica, es decir, en las abundancias de OTU,
se evaluaron con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Se estudiaron los niveles taxonómicos de phylum y genus, y
se consideró que el valor de p ajustado de False Discovery Rate (FDR) <.05 era estadísticamente significativo. Las OTU
existentes en menos del 25% de las muestras se excluyeron antes de las pruebas estadísticas. Para analizar las diferencias
en la diversidad bacteriana global entre las muestras, se generaron matrices de distancia UniFrac ponderadas a partir de
las tablas OTU submuestreadas al azar y se produjeron gráficos de análisis de coordenadas principales (PCoA). Los gráficos
de PCoA se visualizaron con EMPeror. Para confirmar las observaciones visuales, se realizaron análisis de adonis. Adonis
devuelve un valor R2 que muestra la cantidad de variación explicada por la variable de agrupamiento y un valor p para la
significación estadística [15].

Las diferencias en las variables nutricionales (duración de la lactancia materna, introducción de alimentos sólidos e
introducción de gluten) y en el número de cursos de antibióticos recibidos se analizaron con JMP Pro 12 (SAS Institute,
Inc.), utilizando métodos no paramétricos y considerando p < .05 como estadísticamente significativo. Para eliminar el
modo de nacimiento como un factor de confusión, todos los análisis estadísticos se realizaron primero para todo el
conjunto de datos (n = 27), y luego se repitieron para los recién nacidos nacidos en la vagina (n = 24).

Resultados

Las características de los niños participantes se presentan en la Tabla 1. De los 27 recién nacidos en este estudio, 24
nacieron por parto vaginal y tres nacieron por cesárea (CS). Todos los bebés fueron amamantados en el hospital, pero la
continuación de la lactancia varió de siete días a más de 18 meses (Tabla 1). La duración media de la lactancia materna
fue de 11 meses, sin embargo, la leche materna a menudo se complementó con fórmula. La mediana de edad para la
introducción de alimentos sólidos fue de 4,1 meses (rango de 2,0 a 6,2 meses) y para la introducción de gluten de 5,7
meses (rango de 4,4 a 7,7 meses). Los bebés que fueron introducidos anteriormente a los alimentos sólidos también
fueron introducidos al gluten antes (correlación de Spearman 0.679, p <.001). No se observaron diferencias en la duración
promedio de la lactancia materna o en la edad de los alimentos sólidos o la introducción de gluten entre los lactantes caso
y control (Mann-Whitney Up ¼.5395, p ¼.4712 y p¼.5539, respectivamente; Tabla 2). Los niños control parecían ser
amamantados a la edad de introducción del gluten con más frecuencia que los lactantes, pero la diferencia no fue
estadísticamente significativa (prueba de chi cuadrado de Pearson p¼.2113, tabla 2). Además, no se observaron
diferencias en la prescripción de antibióticos entre el caso

Tabla 1. Información de antecedentes de los sujetos del estudio.

y control de infantes (Tabla 2). En total, el 80.8% de los sujetos del estudio habían recibido al menos un curso de
antibióticos a la edad de 4 años. La exclusión de los bebés nacidos por CS no afectó significativamente los resultados con
respecto a la información nutricional o los antibióticos (Tabla 2).

La secuenciación del gen 16S rRNA de las 52 muestras de heces para lactantes dio como resultado 134k-330k OTUs por
muestra (media 191k, SD 40k), el recuento total de la secuencia fue de 9.9 × 106 OTU. La diversidad bacteriana promedio
de las muestras de heces, representada como valores medianos del índice Shannon, fue de 3,32 (rango 2,66-4,32) para
muestras de 9 meses y 4,10 (rango 3,27-4,54) para muestras de 12 meses, mostrando un aumento significativo en la
diversidad bacteriana entre 9 y 12 meses (FDR = 0,0002). La diferencia siguió siendo significativa después de la exclusión
de los bebés CS (p = .0014). Cuando se incluyeron todos los sujetos del estudio en el análisis, los índices de Shannon no
difirieron entre los lactantes de casos y controles (p=.1113 para muestras de 9 meses y p¼.686 para muestras de 12
meses). La métrica "especies observadas" de Qiime confirmó estos hallazgos, representando poca diferencia entre los
lactantes caso y control (Figura 1 (a, b)) pero una clara diferencia entre las muestras de 9 y 12 meses (Figura 1 (c)). Sin
embargo, cuando solo se estudiaron los recién nacidos nacidos en la vagina, los índices de Shannon en las muestras de 9
meses tendieron a ser más altos en los casos que en los controles (p = 0,449). En las muestras de 12 meses, la diferencia
entre los lactantes caso y control siguió siendo insignificante después de la exclusión de los niños nacidos con CS (p = .302).

La composición bacteriana media de nivel de filo y género de las muestras de casos y testigos, es decir, las abundancias
de OTU bacterianas relativas promedio, se representan como gráficos de barras en la Figura 2. Se pueden ver diferencias
menores en la taxonomía bacteriana entre los lactantes de casos y control en ambas muestras de 9 y 12 meses (Figura 2
(a, b)). Sin embargo, Qiime informó que no hubo diferencias estadísticamente significativas en la composición bacteriana
entre el caso y los niños control cuando se evaluaron las abundancias microbianas en los niveles de phylum y genus.
Además, no se observaron diferencias en las proporciones Bacteroides-Prevotella o Bacteroides-Bifidobacterium entre los
lactantes caso y control en muestras de 9 meses y 12 meses (p=.201 y p=.388 para BacteroidesPrevotella y p = .955 y
p=.572 para BacteroidesBifidobacterium, respectivamente). En el gráfico de análisis de coordenadas principales (PCoA),
donde las muestras individuales con una composición de microbiota similar se agrupan juntas, no se observaron
diferencias entre los lactantes caso y control (Figuras 3 (a, b)). Además, el análisis de Adonis confirmó que no se produjeron
diferencias significativas entre los casos y los controles en muestras de 9 meses y 12 meses (p = .808 y p = .96,
respectivamente).

Tabla 2. Información nutricional y cursos de antibióticos de los sujetos del estudio.

Figura 1. Diversidad bacteriana de las muestras del estudio, representadas como diferentes OTU observadas. A la edad de
nueve meses, los bebés de casos tienden a tener una microbiota fecal un poco más diversa que los controles (a), pero esta
diferencia es estadísticamente significativa solo cuando los bebés nacidos por cesárea son excluidos del análisis. A la edad
de 12 meses, no se pueden ver diferencias (b). Por el contrario, se puede observar una clara diferencia en la diversidad
bacteriana entre las muestras de 9 y 12mo (c). El nivel de rarefacción es 134 414 lecturas por muestra.

Figura 2. La composición bacteriana promedio de las muestras del estudio. No se pueden observar diferencias significativas
en la composición bacteriana de nivel de filo ni entre los lactantes de caso y de control ni entre las muestras de 9 y 12mo
(a). Las diferencias en la composición bacteriana a nivel de género son más prominentes; Las muestras 9 y 12mo difieren
claramente entre sí, y en las muestras 9mo, pueden observarse pequeñas diferencias entre los lactantes caso y control
(b). El nivel de rarefacción es 134 414 lecturas por muestra.
Una muestra de control de 9 meses tenía un perfil bacteriano significativamente diferente (Figura 3 (a)) con más del 50%
de las bacterias siendo Enterobacteriaceae, pero como esto no tuvo efecto en los resultados de los análisis estadísticos y
no afectó significativamente el gráfico de barras cifras, la muestra no se excluyó de los análisis finales. Los resultados con
respecto a la composición de la microbiota fecal entre el caso y los lactantes controles permanecieron inalterados al excluir
a los recién nacidos por cesárea, con solo pequeñas diferencias en los valores p (resultados no mostrados).

Los resultados relativos al efecto de la edad, el modo de administración y las variables nutricionales en la composición de
la microbiota fecal se presentan en Resultados Complementarios. Brevemente, la composición bacteriana difirió
significativamente entre las muestras de 9 y 12 meses (Figuras 2 (b) y 3 (c)) y entre los bebés nacidos por vía vaginal o por
CS. Además, la duración de la lactancia se correlacionó con varios géneros bacterianos. Sin embargo, la composición de la
microbiota fecal no difirió significativamente entre los niños que habían sido amamantados durante la introducción de
gluten y los que no (FDR> 0.1 para todos los phyla y géneros bacterianos en muestras de 9 y 12 meses).

Discusión

Estudios previos han informado que la composición de la microbiota intestinal de pacientes con EC difiere de individuos
sanos [3,16]. Sin embargo, no está claro si la microbiota intestinal alterada tiene un papel en la patogénesis de la EC o
simplemente es una

consecuencia de la enfermedad [17]. Se ha informado que el haplotipo HLA-DQ2.5 influye en la comunidad bacteriana
intestinal de los lactantes [6], pero la mayoría de estos niños no desarrollan EC. En la población finlandesa, menos del 10%
de los sujetos positivos DQ2.5 desarrollan la enfermedad. Comparamos la composición de la microbiota fecal temprana
entre los niños con el genotipo de riesgo que más tarde desarrolló CD y niños genéticamente susceptibles que no
desarrollaron la enfermedad o autoanticuerpos asociados durante el seguimiento. Con base en el 10% de riesgo de por
vida y la identificación de ya 6.5% de niños con tTGA (casos incluidos) en todo el grupo de seguimiento, no esperamos
muchos casos nuevos entre los controles negativos tTGA seleccionados. Los estudios de seguimiento también sugieren
que la aparición de nuevos autoanticuerpos asociados a la EC se está nivelando después de los 3 a 4 años de edad [18].

Las muestras de materia fecal se recolectaron a la edad de 9 y 12 meses y se analizaron con secuenciación del gen 16S
rRNA, permitiendo la detección y cuantificación relativa de los taxones bacterianos presentes en las muestras. Estudios
previos han informado diferencias en los niveles de Bacteroides, Clostridium y Staphylococcus géneros, junto con la
relación BacteroidesPrevotella entre los pacientes con CD y controles sanos [16]. Además, una cierta especie de
Bacteroides, Bacteroides dorei, se ha asociado con CD activa [19]. En este estudio, la abundancia de Bacteroides dorei no
se evaluó, ya que la identificación del nivel de especie por secuenciación del gen 16S rRNA es incierta [11,20]. . Sin
embargo, a nivel de género, ni la abundancia de Bacteroides ni la relación Bacteroides-Prevotella difirieron entre los
lactantes caso y control. Además, la abundancia de los géneros Clostridium no difirió entre los lactantes caso y control, y
el género Staphylococcus fue completamente indetectable en esta cohorte de muestra. En conjunto, en este estudio, no
se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la diversidad o composición microbiana fecal entre los niños
que más tarde desarrollaron CD y los que no. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la composición de microbiota
fecal temprana no se asociaría con la patogénesis de CD, mientras que los hallazgos previos sobre las diferencias en la
microbiota intestinal entre pacientes con EC e individuos sanos podrían haber aumentado por cambios dietéticos después
del inicio de la enfermedad o de la homeostasis intestinal alterada debido a alteraciones de la respuesta inmune de la
mucosa [21,22].

Hasta cierto punto, los hallazgos con respecto a la composición de la microbiota intestinal en CD también pueden ser
dependientes de la metodología. Además, como la secuenciación 16S rRNA solo revela la composición microbiana de las
muestras de heces, los perfiles funcionales de la microbiota permanecen descubiertos. Para estudiar la funcionalidad de
los microbios intestinales, se deben realizar análisis metaproteómicos o metabolómicos [23,24]. Se ha demostrado
previamente que la actividad metabólica de la microbiota intestinal en los niños con EC difiere de las personas sanas tanto
antes como después de la implementación de una dieta libre de gluten [25,26].

Aunque los resultados de este estudio sugieren que la composición de la microbiota fecal temprana puede no predecir el
desarrollo de EC, esto no excluye la posibilidad de un desencadenante relacionado con la microbiota para la enfermedad.
Como, por ejemplo, los cambios en la dieta, los antibióticos y las infecciones pueden alterar la homeostasis intestinal [27],
sigue siendo posible que algún disparador externo pueda alterar desastrosamente el equilibrio de la microbiota intestinal,
lo que lleva al inicio de la enfermedad [28]. De hecho, una hipótesis para el inicio del CD es que las infecciones intestinales
podrían interferir en la homeostasis intestinal y conducir a un aumento de la permeabilidad intestinal, es decir, intestino
permeable ([29]), que podría permitir la absorción de moléculas de gliadina no digeridas que inician los procesos inmunes
que conduce a la enfermedad [30].

Sin embargo, pocos estudios han investigado el papel de agentes infecciosos específicos en el desarrollo de la enfermedad,
sin embargo, en algunos estudios una mayor prevalencia de EC se ha asociado con infecciones precoces repetidas [31,32].
En este estudio, el uso de antibióticos se tuvo en cuenta en los análisis, pero no se evaluó el posible impacto de las
infecciones virales tempranas.

Además de los desencadenantes externos repentinos, la progresión gradual desfavorable de la microbiota intestinal
también puede conducir a un intestino permeable y la activación de las vías inflamatorias [29]. Por ejemplo, los estudios
epidemiológicos han informado que los niños nacidos por CS tienen un mayor riesgo de CD en comparación con los bebés
nacidos por vía vaginal [33-35]. En esta cohorte de estudio, el modo de administración tuvo un efecto significativo en la
composición de la microbiota fecal, pero debido al número limitado de niños con CS, no se pudieron extraer conclusiones
con respecto al papel del modo de administración en el riesgo de EC. Sin embargo, en base a los resultados de este estudio,
las personas que desarrollan EC, no ya en la primera infancia, tienen una composición distinta de microbiota fecal en
comparación con otros bebés con haplotipo de HLA de riesgo, lo que sugiere que es más probable el inicio de la EC. una
consecuencia de un fuerte disparador externo en lugar de un desarrollo gradual debido a una microbiota intestinal
peculiarmente vulnerable. Sin embargo, las heces pueden no ser el material de muestra más óptimo para los estudios de
EC, ya que la EC afecta principalmente al intestino delgado y la microbiota fecal refleja inadecuadamente la microbiota
duodenal [4,36]. Por lo tanto, este estudio no descarta la posibilidad de cambios en la microbiota del intestino delgado
antes del inicio de la enfermedad. Por otro lado, no se evaluó la homeostasis de la mucosa duodenal, ya que los estudios
sobre la diafonía microbiana del huésped de la mucosa y la posibilidad de funciones inmunes desfavorables habrían
requerido la recogida de biopsias duodenales. Los estudios previos sobre el papel de la microbiota duodenal en la
respuesta inmune de la mucosa ligada a CD siguen siendo poco concluyentes [22,37,38], lo que hace de este un área
extremadamente interesante para futuras investigaciones.

El posible papel protector de la lactancia materna contra la aparición de la enfermedad de Crohn se ha analizado en varios
estudios, y se ha sugerido que la introducción gradual de gluten durante la lactancia continua protege contra la
enfermedad [39,40]. Algunos estudios recientes, sin embargo, no han podido confirmar estos resultados [39-42]. En este
estudio, la duración promedio de la lactancia materna no difirió entre el caso y el control de los niños, pero los controles
tienden a ser más amamantados durante la introducción del gluten. La duración de la lactancia se correlacionó con varios
géneros bacterianos, de los cuales especialmente Lactobacillus y Bifidobacterium se han relacionado previamente con
resultados de salud positivos ([43]). Sin embargo, no se observaron diferencias en la abundancia de Lactobacillus o
Bifidobacterium entre los bebés que más tarde desarrollaron CD y los niños que no lo hicieron. Además, no se observaron
diferencias en la composición de la microbiota fecal entre los lactantes amamantados durante la introducción del gluten
y los que no, lo que sugiere que, aunque la lactancia materna podría inducir cambios en la microbiota intestinal, la posible
función protectora de la lactancia materna frente al CD podría no estar relacionado con la microbiota intestinal. Sin
embargo, debido al número limitado de bebés no amamantados durante la introducción de gluten en este estudio, estos
resultados son meramente indicativos.

Conclusiones

Nuestros resultados indican que la composición de la microbiota fecal a la edad de 9 y 12 meses no está asociada con el
desarrollo de EC. Nuestros resultados no excluyen la posibilidad de diferencias en la microbiota duodenal o un
desencadenante posterior relacionado con la microbiota para la enfermedad, pero sugieren que los lactantes que
desarrollan EC no tienen originalmente una composición de microbiota fecal distinta en comparación con individuos que
poseen el halo-riesgo HLA pero no desarrollan la enfermedad.