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Persistencia y Actividad Biológica de la

Toxina Bt (Bacillus thuringiensis) con
Características de Insecticida en Suelos
Saúl Flores / IVIC

INTRODUCCION.

La incorporación en el genoma de algunas plantas de cultivos de Bacillus

thuringiensis (Bt) a través del codón que produce toxina con característica de
insecticida reduce muchos problemas asociados al uso de pesticidas de origen
químico, sin embargo, la producción de la toxina por parte de la planta es
continúa a lo largo de su periodo de crecimiento.

La ingeniería genética ha hecho posible el transferir genes de origen animal, plantas, bacterias, hongos y virus. Dando origen a nuevas
caráctersticas y propiedades. Las diferentes aplicaciones van de las características fantásticas en cultivos donde se ha modificado el
sabor, la textura, la duración del producto y reduciendo el uso de pesticidas, por otro lado estas modificaciones en los cultivos podrían
originar nuevas alergias y cancerígenos.

Sin embargo, los cultivos transgénicos podrían representar un problema potencial para la agricultura y los ecosistemas naturales,
Bacillus thuringiensis es una bacteria gram positiva anaerobia, durante la esporulación produce una espora con inclusión cristalina que
contiene más de un tipo de insecticida (Hofte and Whiteles 1989, Schnepf et al., 1998); hasta el presente se han aislado alrededor de
3000 especies de 50 países diferentes.Hasta el presente se han podido identificar diferentes tipos de proteínas con actividad insecticida,
así tenemos Cry IIB toxina para lepidopteros., CryIIA para Lepidopteros y Dipteros, Cry III para Coleopteros y Cry IV para Dipteros

La preparación de Bt era usualmente en forma de aerosol la cual era una mezcla de células, esporas, cristales de la protoxina siendo
usado por mas 30 años. Hasta el presente no se ha reportado problemas de toxicidad por el uso en forma de aerosol, probablemente se
deba a que el Bt no sobrevive bien en los hábitats naturales. (Saleh et al., 1970; West,1984; West & Burger, 1985; West et al., 1984a, b,
1985; Petra & Casida, 1985). Esta espora se inactiva rápidamente en presencia de radiación ultravioleta (Griengo & Spence, 1978;
Ignoffo & Garcia, 1978). Esto es la causa que en condiciones naturales se hallen bajas concentraciones de la toxina. Bt.

Cual es el problema al añadir más toxina al suelo.

Está relacionada con parámetros importantes como el de evaluar, la concentración añadida, tasa de inactivación, consumo por larvas
de insectos, tasa de degradación por los microorganismos del suelo y la tasa de inactivación abiótica. Sin embargo, mediante el uso de la
ingeniería genética los genes son modificados dando como resultado la producción constante de toxina a medida que crece la planta, de
esta manera lo producido excede a lo consumido, esto trae como consecuencia la acumulación de la toxina constituyendo un riesgo
potencial para insectos no perjudiciales (polinizadores predadores de insectos perjudiciales, parásitos de otros insectos plagas que
potencialmente son pestes (Flexner et al., 1986; Goldburg & Tjaden, 1990; Addison, 1993; James et al., 1993). (Fig.1) Se evidenció que la
toxina Bt afecta las larvas de la mariposa monarca(Danaus plexippus) como fue demostrado por Losey et al., 1999, utilizando polen de
maíz. También afecta el desarrollo de Chrysoperla carnea, el cual es un insecto depredador de las larvas de Ostrinia nubilalis, insecto
plaga para el maíz en Europa (Hilbeck et al., 1998 a,b, 1999). La acumulación y persistencia de la toxina ha tenido como consecuencia la
aparición de insectos resistentes a la toxina Bt (Van Rie et al.; 1990.; McGaughey & Whalon, 1992; Entwistle et al., 1993; Tabashnik,
1994; Bauer, 1995; Ferré et al., 1995; Tabashnik et al., 1997).

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Esta persistencia es consecuencia del enlazamiento a la superficie activa de las partículas del suelo (arcillas, sustancias húmicas) el cual
reduce el acceso de los microorganismos del suelo a la toxina y lo que impide su consecuente biodegradación .Enlazamiento de la
Toxina Bt a las Superficies Activas del Suelo. La toxina se enlaza a la superficie de las partículas activas del suelo y de sedimentos en
sistemas acuáticos (generalmente arcillas), y a las moléculas orgánicas tales como sustancias húmicas. Las partículas de arena y sílice
no están involucradas en la persistencia de la toxina Bt ya que no presentan superficie especifica cargada, y generalmente están
constituidas por minerales primarios (Stotzky, 1986). Muchas de estas moléculas son importantes en la ecología, diversidad y actividad
de los microorganismos (sustrato, factores de crecimientoy sideroforos), así como en la protección ambiental y en el control biológico
de plagas (Stotzky, 1974, 1986, 1997).

Adsorción y Enlazamiento de las Toxinas Bt a las Arcillas y sustancias húmicas del suelo.

Varios trabajos han descrito a cerca de la adsorción, equilibrio y enlazamiento de las toxinas purificadas producidas por B. Thuringiensis
subsp kurstaki (Btk 66 kDa.), activa en contra de lepidópteros y subsp tenebrionis (Btt 68 kDa ) activa en contra de coleópteros.

Generalmente se estudiaron en dos tipos de arcillas, caolinita y montmorillonita (Venkauswerlu and Stotzky, 1990, 1992; Tapp & Stotzky,
1995 a,b, 1997, 1998; Tapp et al., 1994; Koskella & Stotzky, 1997), también se ha estudiado enlazamiento adsorción y equilibrio de las
toxinas Bt en sustancias húmicas provenientes de diferentes tipos de suelos (Crecchio & Stotzky, 1998, 2000).En la mayoría de los suelos
las arcillas que predominan son la caolinita y montmorillonita, que le confieren diferentes propiedades físico químicas, como la capacidad
de intercambio cationica lo cual tiene un efecto sobre la actividad biológica (Stotzky, 1986). Las toxinas y prototoxinas son absorbidas
rápidamente (menos de 30 minutos de absorción a pH 6.0 y 9.8) la absorción decrece a medida que se incrementa la valencia del catión.

Detección de Toxinas Bt en el Suelo y su Actividad Insecticida para las Toxinas Enlazadas.

Se han desarrollado diferentes métodos, para determinar la presencia de las toxinas Bt. Por ejemplo dol-blot-elisa el cual fue desarrollado
para determinar concentraciones en el orden de 3 nanogramos (Tapp & Stotzky, 1995 a), citometría, florescencia, lateral flow quickston
(Errologrx, Portland) este método es rápido y detecta menos de 10 ppm estas determinaciones son reconfirmadas mediante bioensayos
con larvas de manducca sexta (Leptinotarsa decemineata).

Toxinas Bt fueron purificadas y añadidas a suelos a -33Kpa y mantenidas en óptimas condiciones de actividad de los microorganismos y
después de 224 días la actividad fue determinada siendo la más prolongada reportado hasta el presente, el promedio de vida media de
la toxina reportada en la literatura es de 8 a 17 días en toxinas purificadas a partir de biomasa de plantas transgénicas de maíz,
algodón, y papas es entre 2 y 41 días (Palm et al., 1994, 1996; Sims & Holden, 1996; Sims & Ream, 1997). Otro de los factores
importantes en la persistencia de la toxina es el pH del suelo, si en caolinita se ajusta el pH de 7.0 a 4.9 decrece la actividad de la toxina.

Resistencia de Toxinas Enlazadas a la Biodegradación

El enlazamiento de las toxinas Btk y Btt a las arcillas del suelo reduce la probabilidad de que los microorganismos del suelo puedan
degradarla, esta es probablemente la razón de la persistencia de las toxinas en el suelo (Koskella & Stotzky 1997), se evidenció que la
toxina libre utiliza el carbón como sustrato y nitrógeno, en contraste cuando la toxina está enlazada, no utiliza carbón, sólo una pequeña
fracción de nitrógeno, la utilización de estas fuentes se cuantificaron mediante la toma de O2 por respirometría.

Actividad Insecticida y Resistencia a la Biodegradación en Toxinas Bt Enlazadas a Acidos Húmicos.

Los resultados son similares a los obtenidos con las arcillas; Los ácidos húmicos
fueron preparados a partir de diferentes suelos, con valores de acidez total que varia
entre 5.0 a 7.4 cmol /kg, y los contenidos de los grupos carboxil phenol es de 1.0 a
3.4 Cmol/kg respectivamente. Estos resultados son similares a los obtenidos con las
arcillas

La toxina se enlaza fuertemente a los ácidos húmicos (Crecchio & Stotzky, 1998) y al complejo monrmolionita- ácidos húmicos -
alhydroxipolímeros. (Crecchio & Stotzky, 2000).

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Biodegradación de Biomasa de Maíz Bt en el Suelo.

La adición de biomasa proveniente de maíz que expresa Cry1Ab toxina que es producido por Btk da como resultado una baja emisión de
CO2. indicando que existe una baja actividad metabólica en comparación con la biomasa no transgénica,

La biomasa fue separada en tallos y hojas que luego de secadas fueron molidas y mezclados con suelo, el tamaño promedio de la
biomasa molida fue de 70 % mayor de 0.5mm y un 30 % mayor de 1mm fueron incubadas para determinar la emisión de CO2 y se
tomaron sub muestras durante los 42 días de incubación para determinar algunas enzimas como fosfatasas ácida y alcalina, proteasa y
deshidrogenasa.La cantidad de C mineralizado es proporcional a la cantidad de CO2 emitido y depende de la cantidad de biomasa
añadida observándose diferencia entre hojas y tallos. Realizamos cambios en la relación C:N adicionando glucosa, no se observaron
diferencias significativas entre los valores de emisión de CO2., enzimas ni en él número total de bacterias y hongos.

La razón de que exista una baja biodegradación de la biomasa de maíz Bt todavía no es bien conocida, por ejemplo no se debe a la
diferencia en la relación C:N, no hay diferencias entre las poblaciones totales de hongos y bacterias, estas observaciones sugieren que
existen diferencias entre la composición química del maíz Bt y el no Bt . Se encontró que el contenido de lignina es 10 veces más en el
maíz Bt que en el no Bt (Saxena & Stotzky, 2001).

La lignina es el componente mayoritario en las células de las plantas a las cuales confiere dureza, rigidez e impermeabilidad al agua,
esta serie de modificaciones podría tener una serie de implicaciones ecológicas (Halpin et al., 1994). El incremento de la lignina en el
maíz beneficia, porque resiste el ataque de los insectos, retarda la biodegradación y la descomposición por microorganismos (Reddy
1984.; Tovar - Gomez et al., 1997), esto lo indica nuestro trabajo donde reportamos una baja emisión de CO2 en la biomasa de maíz Bt.
(Flores, S., Stotzky, G. & Saxena, D., en preparación.)

La baja tasa de biodegradación del maíz Bt podría causar que la materia orgánica se acumule en el suelo, favoreciendo la estructura del
mismo y evitando la erosión. En contraste, la baja biodegradación de la biomasa de maíz Bt aumentaría el tiempo de permanencia de la
toxina en el suelo y constituiría un riesgo para los organismos no perjudiciales y permitiendo la selección de insectos toxina resistente.
Se requiere de estudios adiciónales para clarificar este impacto de la baja biodegradación de la biomasa de maíz Bt especialmente
cuando se han sembrado alrededor de 20 millones de hectareas de maíz Bt solo en los EEUU el 26 % del total global (USEPA 2000).

Presencia de Toxina Bt en Exudados de Raíces de Maíz, Algodón, solgo Tabaco y Papa.

La proteína Cry1Ab fue encontrada en los exudados de las raíces de maíz Bt (NK4640Bt) (Saxena et al., 1999, 2001) en condiciones de
laboratorio y campo. Esto trajo mucha especulación a cerca de la posibilidad de que la toxina sea incorporada a los cultivos. Se hicieron
crecer plantas en cultivos hidropónicos, en condiciones estériles después de 25 días la proteína se degrada por efecto de la microbiota;
esto de muestra que el enlazamiento a las partículas del suelo protege de la hidrólisis a la toxina, lo cual también se observó con la
toxina purificada, en los otros cultivos no se observa este fenómeno, lo que podría indicar un posible efecto pleyotropico en el maíz
producto de la introducción de un nuevo gen a su genoma.

Movimiento Vertical de Toxinas Bt , Purificadas, de Biomasa y Exudados de Plantas Bt

Para verificar el movimiento de la toxina en la columna de suelo en las cuales había diferentes concentraciones de caolinita y
montmorillonita se agregaron en la parte superior de la columna que contenía 50 gramos de suelo, 0.8,1.6 y 3.2 (g/g de toxina
purificada Cry1Ab por gramo de suelo seco, se colectaron durante a la primera hora de adición y luego a las 3 horas de lavado. Se
encontró mayor retención de la toxina en caolinita y a medida que aumenta la concentración de la arcilla, se queda en los primeros 5 cm
de la columna. A medida que el suelo es más arenoso podría llegar al agua, dependiendo de la disponibilidad de la toxina y la cantidad
de agua que impacta sobre el suelo podría convertirse, en un riesgo para algunos insectos acuático cepiddopteros que viven en el agua
sólo en norte América, esto tiene implicaciones en la agricultura ya que dependiendo de la textura de los suelos donde se siembre la
planta de maíz Bt existirá la probabilidad de que las toxinas se enlacen fuertemente a las partículas del suelo o drenen en suelos
arenosos.

Efecto de la Toxina Bt Proveniente de Exudados de Raíces y Biomasa de Maíz Bt, sobre Lombrices, Nemátodos, Protozoas,
Bacterias y Hongos.

Para determinar el efecto de la presencia de la toxina en los exudados del maíz Bt en varios organismos en el suelo, se usó suelo
proveniente de las granjas East Marion, Long Island, NY, en 20 potes de 4.5 kilos de capacidad colocando 3 lombrices (Lumbricus
terrestris) por pote se adicionaron 3 semillas de maíz Bt (NK4640Bt) y el control isogénico no Bt , las plantas fueron removidas después
de 40 días de cultivo, colectando el suelo de la rizósfera para determinar sus posibles efectos sobre protozoos, bacterias, hongos y
nemátodos.

No se encontraron diferencias significativas en la mortalidad de las lombrices, que se cultivaron en suelo donde crecieron plantas de maíz
Bt y se determinó la presencia de la toxina, así como en suelos mezclados con biomasa de maíz Bt. Se pudo evidenciar la presencia de la

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toxina en el intestino de las lombrices. Sobre nemátodos, protozoo, bacterias y hongos no se observo ningún efecto; sin embargo, es
necesario profundizar en este particular sobre todo en estudiar los grupos funcionales de bacterias y hongos.

Absorción de la Toxina Bt del Suelo por Algunas Plantas

Luego que se descubrió que las plantas de maíz Bt presentan en sus exudados la proteína Cry 1Ab se sospechó que algunas plantas de
cultivo podrían tomar del suelo la toxina Bt ya que muchos cultivos son rotativos. Después de sembrar maíz Bt se sembraron plantas de
rábano, lechuga y maíz no Bt, se crecieron en condiciones de invernadero se determinó la presencia de la toxina Bt en las hojas, tallos y
raíces mediante análisis inmunológico y bioensayos, y se constató que las plantas no toman la toxina del suelo (Saxena & Stotzky, 2001
a).

CONCLUSIONES

Estos estudios demuestran la importancia de la interacción de la toxina con la superficie activa de las partículas del suelo, arcillas y
sustancias húmicas, partículas importantes en la biología de los hábitats naturales y confirman que esta interacción es fundamental en la
dinámica de los microbios, virus en el suelo donde ocurre trasferencia genética, conjugación transducción y transformación (ver Stotzky,
1986,1989, 2000; Vettori et al., 19; Yin & Stotzky, 1997).

Que la proteína de características de insecticida producida por varias especies de B. Thuringiensis, se enlaza rápidamente a las arcillas y
ácidos húmicos del suelo.

Este enlazamiento disminuye la probabilidad de ataque de la microbiota del suelo sobre la proteína y disminuye la biodegradación de ésta.

La toxina purificada, y las provenientes de exudados de raíces así como de biomasa de maíz Bt presentan el mismo patrón de
enlazamiento.

La biomasa de maíz Bt se descompone más lento que la biomasa de maíz no Bt.

Se evidenció el movimiento vertical de la proteína Cry 1Ab, en el suelo, cuyo movimiento va a depender de la concentración de arcilla.6-
La toxina parece no afectar las lombrices de tierra, nemátodos, protozoarios, bacterias y hongos totales.

Estos estudios demuestran que la interacción de la toxina Bt con las partículas del suelo puede constituir un riesgo potencial, para
muchos organismos y demuestra nuestra preocupación por la liberación al medio ambiente de nue

vas biomoléculas, vacunas anticuerpos, derivados sanguíneos, el suelo es uno de los sumideros más importantes en el planeta y donde
finalmente terminarán estas nuevas moléculas por varias vías, desechos, residuos vegetales, heces, orina, o por exudados de las raíces
de las nuevas plantas creadas al introducir un nuevo gen en su genoma, cambiando la diversidad de las comunidades de
microorganismos de la rizósfera, esto constituye uno de los problemas que a corto plazo tendremos que enfrentar, lo que es evidente es
que debemos tener una visión clara y tomar las precauciones necesarias para evitar peligros mayores al ambiente

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