INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Alumno: Hernández Santa Rosa Gabriel

Grupo: 4IV1 Sección I

EFECTO DEL pH Y LA CONCENTRACIÓN DE LA INTENSIDAD DE

FLUORESCENCIA DE RIBOFLAVINA

Objetivos
Aprender a usar un fluorómetro de filtros.
Determinar cómo afecta el pH del disolvente en la intensidad de la fluorescencia.
Determinar cómo afecta la concentración de riboflavina en la intensidad de la fluorescencia.

Resultados
CONCENTRACION DISUELTO EN DISUELTO EN DISUIELTO DISUELTO
(ppm) AGUA HCl EN EN NaOH
CH3COOH
0 0 0 0 0
1 1.2 0.16 0.76 0
2 1.95 0.27 1.45 0.01
3 2.6 0.4 2.05 0.01
4 3.83 0.52 2.64 0.03
5 4.51 0.66 3.24 0.04
10 17.26 1.12 5.51 0.06
50 22.15 2.1 10.15 0.13
pH 5 3 1 13
TABLA 1. Resultados de la curva de calibración de riboflavina en diferentes medios.

25

20
Intensidad de emisión

15

10

0
0 10 20 30 40 50 60
-5
Concentración (ppm)

GRAFICA 1. Lecturas de la riboflavina de 0 a 50 ppm. Cada línea corresponde a un disolvente

diferente, de abajo hacia arriba; NaOH, HCl, CH3COOH y agua.
 5

Intensidad de emisión
3

0
0 1 2 3 4 5 6
-1
Concentración (ppm)

GRAFICA 2. Lecturas de la riboflavina de 0 a 5 ppm. Cada línea corresponde a un disolvente

diferente, de abajo hacia arriba; NaOH, HCl, CH3COOH y agua.

Discusión de resultados
En esta práctica, nuestro analito fue la riboflavina, sustancia resistente a ácidos fuertes y
que en solución acuosa tiene una fluorescencia amarilla muy intensa. La fluorescencia es
un tipo de luminiscencia que se produce cuando una sustancia es excitada por radiación
luminosa. La longitud de onda de la luz emitida es normalmente más larga que la luz de
excitación (Sampedro, de los Toyos y Martínez-Nisal, 1993, P.94).

El fluorómetro utilizado contaba con dos filtros para distintas longitudes de onda, uno de
emisión y otro de extracción. El de emisión era de color verde, para longitud de onda de
540 nm y el de extracción era azul, para longitud de onda de 425 nm.

Tanto en la gráfica 1 como en la gráfica 2, se puede observar que la intensidad de emisión

para cada mezcla varía mucho, es importante destacar que cada una de ellas tiene un pH
distinto. Al diluir la riboflavina en medio acido o básico, se pueden crear especies
ionizadas que disminuyen la intensidad de emisión como es el caso del NaOH y el HCl.
Debido a que el CH3COOH es un ácido débil, las especies ionizadas son muy pocas y en agua
son prácticamente inexistentes, siente este solvente el que presenta mayor intensidad.

Con respecto a la concentración, es de esperar que al aumentar esta, aumente la

intensidad de emisión y que las soluciones de 50 ppm (las más concentradas) emitan
cantidades mucho más altas a las de 10 ppm, pero el aumento en realidad es mínimo y
por ello la gráfica 1 no tiene un comportamiento lineal. Eso se puede explicar por los
fenómenos de auto atenuación y auto absorción que ocurren a altas concentraciones. En
la auto absorción, parte de la emisión de la fluorescencia es ocupara por otras moléculas
para excitarse, mientras que en la auto atenuación, se da por choques de las moléculas
perdiendo parte de la energía a forma de calor, disminuyendo así la fluorescencia.

En general, El fluorómetro es muy útil para determinar un analito en soluciones con una
concentración muy baja, pero se necesitan de filtros específicos y de conocer sus
longitudes de onda de máxima excitación y de máxima emisión

Preguntas adicionales
1. ¿Por qué deben conocerse las longitudes de onda de máxima excitación y de
máxima emisión?

Para saber a qué longitud de onda nuestro analito emitirá una mayor fluorescencia y sea
más fácil trabajar con los datos de intensidad de emisión obtenidos.

2. Diga cuales son las formas coenzimaticas de la riboflavina y cuál es su papel en el

metabolismo celular

La riboflavina (B2) tiene dos formas coenzimáticas, flavina adenina dinucleótido (FAD) y
flavina mononucleótido (FMN), requeridos en reacciones de oxidación-reducción
catalizadas por las deshidrogenasas ligadas a la flavina (Amstrong y Bennett, 1982, P. 277).

3. Ejemplo de analito que pueda identificarse

La clorofila de las hojas de las plantas absorbe la energía solar necesaria para la
fotosíntesis, pero no la usa toda; hay una parte que se disipa como calor y como
fluorescencia para no dañar la hoja.

4. Funcionamiento del filtro en el fluorómetro

La luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e incide

sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de
las moléculas de la muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en
todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o
monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90° con
respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o
transmitida llegue al detector (Espectrometria.com, 2018).
Conclusiones
Se determinó satisfactoriamente que la concentración es directamente proporcional a la
intensidad de emisión, aunque si se encuentra a grandes proporciones, ocurren los
fenómenos de auto atenuación y auto absorción. También es muy importante cuidar el pH
al que se trabaja ya que puede afectar la fluorescencia e la sustancia y alterar los
resultados.

Referencias
Amstrong, F. y Bennett, T. (1982). Bioquímica. Barcelona, España: Editorial Reverté S.A.
Espectrometria.com. (2018). Espectrometría de fluorescencia. Disponible en:
https://www.espectrometria.com/espectrometra_de_fluorescencia [Consultado 29 Mar.
2018].
Sampedro, A., de los Toyos, J. y Martínez-Nisal, A. (1993). Técnicas de fluorescencia en
microscopia y citometría. 1ª ed. Oviedo, España: Universidad de Oviedo, servicio de
publicaciones.